luận án tiến sĩ nghiên cứu chế tạo và đặc trưng tính chất của tổ hợp carrageenancollagen từ vảy cá mang dược chất allopurinol

Allopurinol ALP là một chất ăc chế enzyme xanthine oxidase enzym oxy hóa xanthine thành acid uric, do ó có tác dÿng làm giÁm m¿nh nồng ộ acid uric trong máu °ợc sử dÿng làm thuốc iều trị

HàC VIÞN KHOA HàC VÀ CÔNG NGHÞ

Vi QUÞC M¾NH

CÁ) MANG D¯þC CHÂT ALLOPURINOL

Chuyên ngành: Hoá Hāu c¢

Tôi xin cam oan những nội dung trong luận án này do tôi thực hiện d°ới sự h°ớng dẫn cāa GS TS Thái Hoàng và PGS TS Vũ Quốc Trung Một số nhiệm vÿ nghiên cău là thành quÁ tập thể và ã °ợc các ồng sự cho phép sử dÿng

Các số liệu, kết quÁ trình bày trong luận án là trung thực và ch°a từng °ợc công bố trong các công trình khác

Tác giÁ lu¿n án

trưng tính chất của tổ hợp carrageenan/collagen (từ vÁy cá) mang dược chất allopurinol" đã hoàn thành t¿i Phòng Hoá lý vật liệu phi kim lo¿i – Viện Kỹ thuật nhiệt đới – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến GS TS Thái Hoàng và PGS TS Vũ Quốc Trung, những ngưßi Thầy đã tần tình hướng dẫn và chỉ bÁo tôi trong suốt quá trình xây dựng và hoàn thiện luận án

Tôi xin chân thành cÁm ơn anh, chị, em trong Phòng Hoá lý vật liệu phi kim lo¿i và Viện Kỹ thuật nhiệt đới – nơi tôi thực hiện đề tài, đã t¿o mọi điều kiện tuận lợi để tôi hoàn thành luận án này

Tôi xin trân trọng cÁm ơn Ban Giám đốc, thầy giáo, cô giáo cùng toàn thể cán bộ phòng Đào t¿o Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cÁm ơn Ban giám hiệu Trưßng Đ¿i học Thành Đô, Ban lãnh đ¿o cùng toàn thể các đồng nghiệp Khoa Dược đã t¿o mọi điều kiện, hỗ trợ, giúp đỡ tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án

Tôi xin chân thành cÁm ơn đề tài Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia (Nafosted) – mã số: 104.02-2017.326 giai đo¿n 2018–2021 đã hỗ trợ kinh phí để tôi hoàn thành luận án này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, b¿n bè, đồng nghiệp đã t¿o điều kiện giúp đỡ, chia sẻ và động viên tôi trong quá trình hoàn thành luận án

Hà Nội, tháng 01 năm 2024

Vi QUÞC M¾NH

Mä ĐÄU 1

CH¯¡NG 1 TÞNG QUAN 4

1.1 Tßng quan về collagen 4

1.1.1 Cấu t¿o và cấu trúc phân tử collagen 4

1.1.2 Phân lo¿i collagen 6

1.1.3 Tính chất cāa collagen 10

1.1.4 Tình hình nghiên cău sÁn xuất collagen từ cá 12

1.2 Tßng quan về carrageenan 18

1.2.1 Cấu t¿o và cấu trúc phân tử carrageenan 18

1.2.2 Tình hình nghiên cău sÁn xuất carrageenan 24

1.2.3 Ăng dÿng cāa carrageenan 27

1.3 Tßng quan về polyme thiên nhiên mang d°ÿc chÃt 29

2.2 Trích ly collagen tā vÁy cá (há cá chép – Cyprinidae) 43

2.2.1 Xử lý s¡ bộ nguyên liệu ầu vào (B°ớc 1) 43

2.2.2 Xử lý protein và chất béo bằng dung dịch kiềm (B°ớc 2) 44

2.5.9 Ph°¡ng pháp sắc ký nano a chiều và khối phổ (nanoLC-MS/MS) 52

2.6 GiÁi phóng allopurinol tā màng và h¿t tß hÿp Car/C/ALP trong các môi tr°ãng pH khác nhau 53

2.6.1 Xây dựng °ßng chuẩn cāa allopurinol trong các dung dịch pH khác nhau 53

2.6.2 Xác ịnh hàm l°ợng allopurinol °ợc mang bái tổ hợp Car/C 55

2.6.3 Xác ịnh khối l°ợng thuốc allopurinol giÁi phóng từ vật liệu tổ hợp Car/C/ALP 55

2.7 Thÿ nghißm in vivo sÿ dāng h¿t tß hÿp carrageenan/collagen/allopurinol trên c¢ thể đßng v¿t (chußt bình th°ãng và chußt đ°ÿc tiêm phúc m¿c potassium oxalate) 56

2.7.1 Xác ịnh ộc tính cấp cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol trên chuột °ợc thử nghiệm 56

2.7.2 Xác ịnh ộc tính bán tr°ßng diễn cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol trên chuột °ợc thử nghiệm 57

2.7.3 KhÁo sát tác dÿng cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol ến sự giÁm nồng ộ urat/acid uric trong máu cāa các lo¿i chuột °ợc thử nghiệm 58

3.1.1 Ành h°áng cāa dung dịch kiềm ến xử lý vÁy cá thu collagen 61

3.1.2 Ành h°áng cāa hỗn hợp acid ến xử lý vÁy các thu collagen 62

3.1.3 Xác ịnh ộ tinh khiết và hàm l°ợng các acid amin trong collagen thu °ợc từ hỗn hợp vÁy cá 63

3.1.4 Đặc tr°ng, tính chất và hình thái cấu trúc cāa collagen thu °ợc từ hỗn hợp vÁy cá họ cá chép 66

3.2 Màng tß hÿp carragennan/collagen/allopurinol 72

3.2.1 Hiệu suất mang allopurinol cāa các màng tổ hợp carrageenan/collagen 72

3.2.2 Phổ FTIR cāa màng tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol 73

3.3.1 Phổ FTIR cāa h¿t tổ hợp carrageenan/collagen/allopurinol (ACC) 90

3.3.2 Phân bố kích th°ớc h¿t cāa h¿t tổ hợp ACC 92

3.3.3 Ành SEM cāa h¿t tổ hợp nano ACC 93

3.3.4 Đặc tr°ng nhiệt cāa h¿t tổ hợp nano ACC 94

3.3.5 Hiệu suất mang allopurinol cāa các h¿t tổ hợp nano ACC 96

3.3.6 Nghiên cău giÁi phóng allopurinol từ h¿t tổ hợp nano Car/C/ALP trong dung dịch ệm pH 2 và pH 7,4 97

3.4 Thÿ nghißm in vivo sÿ dāng h¿t tß hÿp nano carrageenan/collagen/allopurinol trên c¢ thể đßng v¿t (chußt bình th°ãng và chußt đ°ÿc tiêm phúc m¿c potassium oxalat) 102

3.4.2 Xác ịnh ộc tính bán tr°ßng diễn cāa h¿t tổ hợp nano

carrageenan/collagen/allopurinol trên chuột °ợc thử nghiệm 105

3.4.3 KhÁo sát tác dÿng cāa h¿t tổ hợp nano carrageenan/collagen/allopurinol ến sự giÁm nồng ộ urat/acid uric trong máu cāa các nhóm chuột °ợc thử nghiệm 109

K¾T LU¾N 115

NHĀNG ĐÓNG GÓP MàI CĂA LU¾N ÁN 117

DANH MĀC CÔNG TRÌNH CĂA TÁC GIÀ 118 PHĀ LĀC 1.PL

A-CNPs: Nano siêu thuận từ chitosan mang allopurinol

BÁng 1.1 Cấu trúc các lo¿i collagen [20] 7

NaOH 0,5 M 61

1) thu °ợc từ vÁy cá họ cá Chép t¿i Việt Nam 65

các màng tổ hợp CCA (hàm l°ợng thuốc khác nhau) trong các dung BÁng 3.15 Các ặc tr°ng nhiệt cāa ALP, carrageenan, collagen và h¿t tổ

dịch ệm pH 2 và pH 7,4 101

BÁng 3.21 Cân nặng cāa các nhóm chuột tr°ớc và sau uống h¿t tổ hợp nano ACC19-10 sau 14 và 28 ngày (gam) 106 BÁng 3.22 Chỉ số huyết học cāa các nhóm chuột tr°ớc và sau uống h¿t tổ

BÁng 3.23 Các chỉ số sinh hóa cāa chuột tr°ớc và sau uống h¿t tổ hợp nano ACC19-10 sau 14 và 28 ngày 107 BÁng 3.24 Trọng l°ợng gan, thận và lách cāa chuột sau uống h¿t tổ hợp

nano ACC19-10 sau 28 ngày 108

ALP và nano-ALP 111

Trang

Hình 1.1 Cấu trúc cāa collagen 4

Hình 1.2 Sự tham gia cāa hydroxyproline vào liên kết hydro giữa các chuỗi polypeptide 5

Hình 1.3 Cấu trúc xoắn ba cāa collagen 5

Hình 1.4 Một số d¿ng sinh học cāa chuỗi xoắn 3 collagen 6

Hình 1.5 Sự sắp xếp cāa collagen d¿ng sợi 7

Hình 1.6 Sự sắp xếp cāa một số lo¿i collagen không t¿o cấu trúc sợi 9

Hình 1.7 Cấu trwc phân tử và sự chuyển hóa trong môi tr°ßng kiềm cāa các lo¿i carrageenan khác nhau 20

Hình 1.8 Cấu trúc cāa ½-Car 21

Hình 1.9 Cấu trúc cāa ¼-carrageenan Car 21

Hình 1.10 Cấu trúc cāa ¾-carrageenan Car 21

Hình 1.11 Gel carrageenan với Ca2+ 23

Hình 1.12 Đồ thị hàm l°ợng Cur giÁi phóng từ hệ ½-Car-Cur trong dung dịch pH 5,0 và pH 7,4 30

Hình 1.13 (a) L°ợng GH giÁi phóng từ C/PVA (20/80) á nồng ộ khác nhau, 33

Hình 1.14 Đồ thị giÁi phóng thuốc Dox từ màng tổ hợp CoL/Ch/DBC mang thuốc Dox hàm l°ợng CoL/Ch khác nhau trong các dung dịch ệm pH 7,4 (a), 6,5 (b) và 5,8 (c) 36

Hình 2.1 Collagen kết tāa (trái), collagen sau khi ông khô (phÁi) 45

Hình 3.1 Phổ EDX cāa collagen thô (A); collagen thẩm tích sau 24 giß (B) và collagen thẩm tích sau 48 giß (C)BÁng 3.4 Tỉ lệ khối l°ợng (%) các nguyên tố trong collagen tr°ớc và sau khi thẩm tích 63

Hình 3.2 Phổ FTIR cāa collagen sau thẩm tích 48 giß 67

Hình 3.3 Ành SEM cāa collagen thô á ộ phóng ¿i 100.000 lần 68

Hình 3.4 Ành SEM á các ộ phóng ¿i 1.000 và 10.000 lần cāa collagen tinh sau khi thẩm tích 48 giß 68

Hình 3.7 Kết quÁ iện di SDS-Page cāa collagen 70

Hình 3.8 Đồ thị phÁn ánh sự phÿ thuộc cāa phần ộ nhớt cāa collagen vào nhiệt ộ 72

Hình 3.9 Phổ FTIR cāa ALP, Car và C 74

Hình 3.10 Phổ FTIR cāa màng tổ hợp CCA 75

Hình 3.11 Phổ FTIR cāa màng tổ hợp CCA á các tỉ lệ Car/C và ALP khác nhau 77

Hình 3.12 Một số giÁ thuyết t°¡ng tác trong màng tổ hợp Car/C/ALP 78

Hình 3.13 GiÁn ồ XRD cāa ALP 79

Hình 3.14 GiÁn ồ XRD cāa màng tổ hợp Car/C/ALP á tỉ lệ Car/C = 95/5, 1% KCl 79

Hình 3.15 Ành SEM cāa các màng tổ hợp Car/C/ALP, chất t¿o gel KCl 1 %: ALP (a), CCA991-5 (b), CCA955-5 (c), CCA9010-5 (d), CCA955-3 (e) và CCA955-10 (f) 80

Hình 3.16 GiÁn ồ DSC cāa màng tổ hợp Car/C/ALP (5 %) 81

Hình 3.17 Đồ thị giÁi phóng ALP từ màng tổ hợp CCA trong các dung dịch ệm pH 2 và pH 7,4 84

Hình 3.18 Đồ thị giÁi phóng ALP từ mẫu màng CoA-5, CaA-5 và màng tổ hợp CCA khi hàm l°ợng ALP thay ổi trong dung dịch ệm pH 7,4 86

Hình 3.19 Đồ thị giÁi phóng ALP tinh khiết và từ màng CCA với hàm l°ợng ALP thay ổi trong dung dịch ệm pH 2 và pH 7,4 87

Hình 3.20 Phổ FTIR cāa Car, C, ALP và các h¿t tổ hợp ACC á các t礃ऀ lệ Car/C khác nhau 91

Hình 3.21 Phổ IR cāa các h¿t tổ hợp ACC19-5, ACC19-10 và ACC19-15 92

Hình 3.22 GiÁn ồ phân bố kích th°ớc h¿t cāa các h¿t tổ hợp nano ACC28-10, ACC55-ACC28-10, ACC64-10 93

Hình 3.23 Ành SEM cāa ALP các h¿t tổ hợp nano ACC với t礃ऀ lệ Car/C khác nhau 94

Hình 3.24 Ành SEM cāa các h¿t tổ hợp ACC với hàm l°ợng ALP khác nhau 94

Hình 3.26 Đồ thị giÁi phóng ALP các h¿t tổ hợp nano ACC và ALP tinh khiết

l°ợng ALP khác nhau) trong dung dịch ệm pH 7,4 100

Hình 3.31 Hình Ánh ¿i thể cāa gan, lách và thận cāa chuột sau 72 giß uống

S¡ ồ 2.1 Quy trình trích ly và tinh chế collagen từ hỗn hợp vÁy cá (họ cá

Mä ĐÄU

Polyme thiên nhiên, nhân t¿o hoặc tổng hợp có sử dÿng trong y học °ợc gọi là vật liệu polyme y sinh Chúng °ợc sử dÿng với các mÿc ích khác nhau nh°: iều trị bệnh, thay thế các c¡ quan bị tổn th°¡ng giwp phÿc hồi chăc nng hoặc tng c°ßng một chăc nng nào ó trong c¡ thể [1]

Các polyme y sinh dùng làm vật kiệu thay thế cần có các tính chất sau [1, 2]: T°¡ng hợp sinh học và không ộc h¿i; có thể khử trùng; dễ chế t¿o Lo¿i vật liệu th°ßng sử dÿng làm các bộ phận thay thế trong c¡ thể là sợi carbon, polyglycolide,

Với polyme y sinh làm vật liệu mang, dẫn thuốc trong d°ợc phẩm, ng°ßi ta chia làm 2 lo¿i: dùng làm tá d°ợc mang thuốc và dùng làm truyền dẫn iều trị t¿i ích [3, 4] Trong ó, các polyme y sinh á d¿ng h¿t nano nh¿y với nhiệt ộ và pH ể mang và giÁi phóng thuốc một cách tự nhiên từ các phần tử cāa thuốc vào c¡ thể con ng°ßi theo những ch°¡ng trình °ợc thiết lập sẵn Nh° vậy, nồng ộ thuốc

hiện t°ợng giÁi phóng cÿc bộ và có thể kéo dài thßi gian iều trị cho một lần sử dÿng thuốc

Trong các hệ polyme y sinh, hệ polyme hydrogel có nhiều °u iểm nh°: khÁ nng t°¡ng thích sinh học tốt, t°¡ng tác tốt với d°ợc phẩm, dễ kiểm soát giÁi phóng

cău ể ăng dÿng vào bào chế các d¿ng thuốc mới trong iều trị bệnh Trong số các polyme phổ biến dùng ể chế t¿o d¿ng hydrogel, carrageenan (Car) và collagen (C) là hai ăng viên tiềm nng °ợc sử dÿng ể mang các d°ợc chất Carrageenan °ợc chiết xuất từ rong ỏ, có thể phân hu礃ऀ sinh học và an toàn với c¡ thể ng°ßi Các sÁn phẩm cāa Car với kích th°ớc nano ặc biệt là hệ nano tổ hợp có nhiều tính chất và °ợc ăng dÿng nhiều trong công nghiệp d°ợc phẩm [5, 6] (làm tá d°ợc sÁn xuất các lo¿i thuốc iều trị nh°: thuốc chống ông máu, ngừa ung th°, … [7, 8]) Collagen có tác dÿng bÁo vệ thuốc kháng các yếu tố gây biến ổi d°ợc chất nh°: ánh sáng, oxy Tuy nhiên, nguồn collagen hiện nay °ợc sÁn xuất chā yếu từ da ộng vật Trong ó ộng vật có thể bị nhiễm một số bệnh nh°: bệnh bò iên, bệnh não xốp á bò, lá mồm long móng, … khiến cho chất l°ợng collagen thu °ợc không Ám bÁo

Gần ây, collagen °ợc trích ly từ vÁy cá °ợc quan tâm nghiên cău nh° một lo¿i vật liệu sinh học mới thay thế collagen từ ộng vật vì nguồn collagen từ vÁy cá an toàn, giúp xử lý chất phế thÁi cāa ngành thāy sÁn, ồng thßi mang l¿i hiệu quÁ kinh tế cho ngành thāy sÁn Cho ến thßi iểm này, ch°a có ề tài nào nghiên cău xử lý

thu collagen một cách có hệ thống cũng nh° sử dÿng tổ hợp carrageenan và collagen từ vÁy cá làm vật liệu mang, dẫn thuốc

Acid uric là sÁn phẩm chuyển hóa cāa purine trên ng°ßi [9] KhoÁng 2/3 l°ợng acid uric °ợc sinh ra từ chuyển hóa nội sinh và các lo¿i thăc n giàu purine nh° thịt, hÁi sÁn… [10] Phần lớn acid uric °ợc ào thÁi qua °ßng tiết niệu và một phần qua mật Sự mất cần bằng trong chuyển hóa acid uric và rối lo¿n ào thÁi qua thận sẽ dẫn ến tng acid uric máu [11] Allopurinol (ALP) là một chất ăc chế enzyme xanthine oxidase (enzym oxy hóa xanthine thành acid uric), do ó có tác dÿng làm giÁm m¿nh nồng ộ acid uric trong máu °ợc sử dÿng làm thuốc iều trị

cāu chế t¿o và đặc trưng tính chất cÿa tổ hợp carrageenan/collagen (từ vÁy cá) mang dược chất allopurinol= nhằm thu °ợc collagen từ quá trình xử lý, chiết tách

vÁy cá n°ớc ngọt á Việt Nam (cá chép, cá trôi, các trắm, cá rô phi), ồng thßi sử dÿng collagen từ vÁy cá thu °ợc kết hợp với carrageenan ể chế t¿o vật liệu mang d°ợc chất mô hình là ALP ể hỗ trợ iều trị bệnh gút, nhằm kiểm soát sự hấp thu và thÁi trừ cāa thuốc ALP, qua ó kéo dài thßi gian tác dÿng cāa thuốc

- Xây dựng °ợc quá trình trích ly collagen từ vÁy cá n°ớc ngọt Việt Nam

(cá chép - Cyprinus carpio, cá trôi - Labeo rohita, cá trắm cỏ - Ctenopharyngodon

idella, cá rô phi - Oreochromis niloticus)

- Chế t¿o °ợc tổ hợp polyme thiên nhiên carrageenan/collagen (từ vÁy cá)

chăa ALP d¿ng màng và d¿ng h¿t bằng ph°¡ng pháp dung dịch và ph°¡ng pháp gel – ion hóa

- Đánh giá °ợc khÁ nng làm giÁm acid uric trong máu từ việc sử dÿng tổ

hợp polyme thiên nhiên carrageenan/collagen (từ vÁy cá) chăa ALP

- Nghiên cău iều kiện trích ly collagen từ vÁy cá n°ớc ngọt Việt Nam (cá

chép - Cyprinus carpio, cá trôi - Labeo rohita, cá trắm cỏ - Ctenopharyngodon

idella, cá rô phi - Oreochromis niloticus)

- Nghiên cău iều kiện chế t¿o và tỉ lệ thành phần giữa các polyme carrageenan và collagen (từ vÁy cá) mang ALP ể thu °ợc tổ hợp polyme mang d°ợc chất á d¿ng màng và d¿ng h¿t bằng ph°¡ng pháp dung dịch và ph°¡ng pháp gel – ion hóa

- Nghiên cău sự giÁi phóng d°ợc chất ALP từ tổ hợp polyme Car/C/ALP - Nghiên cău thử nghiệm in vivo trên chuột sử dÿng tổ hợp polyme thiên nhiên Car/C (từ vÁy cá) chăa ALP ến khÁ nng giÁm acid uric trong máu

Luận án bao gồm: Phần má ầu, ba ch°¡ng nội dung chính cāa luận án, kết luận, các óng góp mới cāa luận án, danh mÿc các công bố liên quan ến luận án, danh mÿc tài liệu tham khÁo và phÿ lÿc

PhÅn Må đÅu: Nêu tính cấp thiết cāa luận án, khái quát chung về nội dung

và mÿc ích nghiên cău cāa luận án

Ch°¢ng 1 Tßng quan: Giới thiệu về các ối t°ợng nghiên cău, ph°¡ng

pháp nghiên cău cũng nh° các nghiên cău trong và ngoài n°ớc liên quan ến các

ối t°ợng và ph°¡ng pháp nghiên cău

Ch°¢ng 2 Thăc nghißm: Trình bày về vật liệu và các ph°¡ng pháp chế t¿o, nghiên cău

Ch°¢ng 3 K¿t quÁ và thÁo lu¿n: Đánh giá về những kết quÁ nghiên cău ã

¿t °ợc cāa luận án

Các đóng góp mái

Danh māc các công bß liên quan đ¿n lu¿n án

Tài lißu tham khÁo: Liệt kê các tài liệu tham khÁo ã sử dÿng ể nghiên cău và thực hiện luận án

Phā lāc: Trình bày các bÁng biểu số liệu o ¿c liên quan tới kết quÁ cāa luận án

CH¯¡NG 1 TÞNG QUAN

1.1.1 Cấu t¿o và cấu trúc phân tử collagen

Đ¡n vị cấu trwc c¡ bÁn cāa collagen là tropocollagen có chiều dài khoÁng 300 nm, °ßng kính khoÁng 1,5 nm, gồm ba chuỗi polypeptide xoắn l¿i với nhau (Hình 1.1) Các chuỗi trong collagen °ợc ổn ịnh bái liên kết hydro giữa các nhóm –CO– và –NH– kế liền nhau trên m¿ch polypeptide [12]

Hình 1.1. Cấu trwc cāa collagen

Mỗi chuỗi polypeptide chăa khoÁng 1050 amino acid, trong ó chā yếu là

polypeptide cāa collagen, các amino acid có sự lặp l¿i cāa bộ ba amino acid Gly-X-Y, (X th°ßng là prolin, Y th°ßng là hydroxyprolin hoặc hydroxylysin) Với những collagen không có cấu trwc sợi, sự lặp l¿i cāa bộ ba Gly-X-Y có thể bị gián o¿n á những vị trí xác ịnh trong những o¿n xoắn ba [13]

Hàm l°ợng các amino acid trong collagen có nguồn gốc từ cá thấp h¡n collagen có nguồn gốc từ ộng vật Amino acid trong collagen cāa cá á môi tr°ßng ấm cao h¡n môi tr°ßng l¿nh Các amino acid này giwp ổn ịnh cấu trwc xoắn cāa

nhóm carbonyl cāa chuỗi peptid kế bên và một phân tử n°ớc làm cầu nối trung gian (Hình 1.2)

Hình 1.2. Sự tham gia cāa hydroxyproline vào liên kết hydro giữa các chuỗi polypeptide

Persikov ã nghiên cău sự ổn ịnh cāa phân tử collagen dựa trên trình tự Gly-X-Hyp và Gly-Pro-Y, từ ó xác ịnh °ợc các amino acid trên các vị trí X và Y, á vị trí cāa X th°ßng gặp các amino acid: Pro, Glu, Ala, Lys, Arg, Gln, và Asp; á vị trí Y th°ßng gặp các amino acid là: Hyp, Arg, Met, Ile, Gln, và Ala; các amino acid th¡m và Gly ít ổn ịnh á cÁ hai vị trí X và Y [14]

Độ ổn ịnh nhiệt cāa collagen °ợc tng lên nhß hydroxyprolin Sakikabara

nhiệt này là do nhóm hydroxyl cāa Hyp h°ớng ra phía bề mặt ngoài cấu trwc xoắn ốc, không tham gia vào liên kết hydro bên trong cấu trwc nên nhóm này sẽ tham gia hình thành liên kết hydro nhß cầu nối trung gian là phân tử n°ớc [15] Lúc này,

những cầu n°ớc liên tÿc nhau [16] Do ó, sự lặp l¿i cāa bộ ba amino acid Gly-X-Y trong mỗi chuỗi polypeptide cho phép hình thành cấu trwc xoắn ba với amino acid glycine cuộn vào bên trong lõi xoắn ốc còn các amino acid X và Y lộ ra phía bề mặt ngoài (Hình 1.3) [12]

Hình 1.3 Cấu trwc xoắn ba cāa collagen

Trong thành phần cấu t¿o cāa collagen, số l°ợng các amino acid có tính acid gần bằng số l°ợng các amino acid có tính base Vì vậy, collagen vẫn giữ °ợc tr¿ng thái cân bằng về iện trong những iều kiện sinh lý khác nhau [17] Các ph°¡ng pháp th°ßng °ợc dùng ể tách các phân tử collagen từ các bó sợi là dùng các enzyme (nh° pepsin) ể phân cắt các chuỗi polypeptide ra khỏi phân tử collagen (lo¿i bỏ °ợc các liên kết ngang ngo¿i phân tử), do ó dễ dàng thu hồi collagen [17]

Trong ộng vật, các phân tử collagen sẽ kết tÿ với nhau t¿o thành vi sợi (microfibril) Các vi sợi là ¡n vị cấu trwc ể hình thành các sợi, bó sợi lớn h¡n và các m¿ng l°ới có trong mô, x°¡ng và các màng c¡ bÁn (Hình 1.4) [18]

Hình 1.4 Một số d¿ng sinh học cāa chuỗi xoắn 3 collagen

1.1.2 Phân lo¿i collagen

Trong c¡ thể ng°ßi, tồn t¿i 28 lo¿i collagen °ợc °ợc liệt kê trong BÁng

d¿ng màng, chuỗi h¿t, chuỗi ngắn, d¿ng chuyển màng và một số lo¿i khác

1.1.2.1 Collagen d¿ng sợi

Là d¿ng phổ biến với hàm l°ợng h¡n 90% l°ợng collagen trong c¡ thể Collagen d¿ng sợi có chiều dài chu kỳ khoÁng 64-67 nm, °ợc lặp i lặp l¿i Mỗi sợi

collagen t¿o bái các ¿i phân tử tropocollagen với kích th°ớc: dài 300 nm, rộng 15 nm và °ợc sắp xếp so le nhau Hai phân tử liên tiếp cách nhau 40 nm (Hình 1.5) [19]

Hình 1.5. Sự sắp xếp cāa collagen d¿ng sợi

m¿c, phổi, m¿ch máu); collagen lo¿i II (thành phần quan trọng cāa sÿn); collagen lo¿i III (có tính chất àn hồi do vậy có nhiều trong mô liên kết nh° : nh° phổi, da, m¿ch máu); collagen lo¿i V °ợc liên kết với lo¿i I (có trong giác m¿c); collagen lo¿i XI °ợc liên kết với lo¿i II (có trong cấu t¿o cāa sÿn) (BÁng 1.1) Collagen d¿ng sợi có mỗi chuỗi ³, có vùng xoắn ốc dài và lặp l¿i liên tÿc cāa bộ ba

BÁng 1.1 Cấu trúc các lo¿i collagen [20]

Collagen lo¿i IV là d¿ng phổ biến nhất, là thành phần màng phân cách giữa các c¡ quan, màng trong, h¿ bì, mô c¡ và tế bào thần kinh và mô c¡ Collagen IV dài h¡n

ầu 7S và NC1 khác với d¿ng sợi là không có hai ầu teleopeptide N và C Phân tử collagen IV kết tÿ l¿i với nhau nhß vào sự hình thành liên kết t¿i hai vùng 7S và NC1, sự t°¡ng tác t¿i các vùng xoắn ốc và t°¡ng tác giữa các thành phần khác cāa màng ể hình thành lên cấu trwc m¿ng l°ới (Hình 1.6A)

Hình 1.6. Sự sắp xếp cāa một số lo¿i collagen không t¿o cấu trwc sợi

Trong số collagen cāa ộng vật thì vùng xoắn ốc cāa collagen VII là dài nhất (chiều dài 420 nm) vàbị gián o¿n t¿i các iểm á hai ầu vùng NC1 và NC2 Collagen này có á ranh giớ nối giữa lớp trung và biểu bì, với chăc nng sợi neo giữ các cấu trwc (Hình 1.6B) Collagen lo¿i XVIII và XV có nhiều o¿n kết tÿ l¿i với nhau, gọi là lo¿i hỗn hợp Hai lo¿i này t¿o liên kết với các màng và liên kết cộng hoá trị với các chuỗi glycosaminoglycan gọi là các proteoglycan

1.1.2.3 Collagen chuỗi h¿t

Collagen chuỗi h¿t là lo¿i phổ biến óng vai trò duy trì hình d¿ng và tr¿ng thái các mô Các phân tử chuỗi h¿t có các vùng xoắn ốc ngắn (bằng 1/3 so với d¿ng sợi) Phân tử collagen VI liên kết với nhau tao chuỗi h¿t, có chiều dài chu kỳ 110 nm (Hình 1.6 C)

1.1.2.4 Collagen chuỗi ngắn

xoắn ba có chiều dài bằng 1/2 d¿ng sợi và có nhiều vùng gián o¿n Hai lo¿i này tham gia hình thành giác m¿c (collagen VIII) và sÿn (collagen X) (Hình 1.6 D)

1.1.2.5 FACIT collagen

Là lo¿i collagen ầu tiên °ợc tìm thấy Lo¿i này có collagen IX, là thành phần chính cāa sợi collagen trong sÿn Collagen IX là heterotrime d¿ng ³1(IX)³2(IX)³3(IX) gồm: phân tử glycosaminoglycan liên kết với chuỗi ³2(IX) nên

gọi là proteoglycan Trên bề mặt các collagen II và XI liên kết với collagen IX có trong sÿn bằng với các dẫn xuất cāa lysin bằng liên kết cộng hoá trị

bố trong các mô khác nhau, nh° collagen XXII có á màng biên giữa các mô;

1.1.3 Tính chất cÿa collagen

1.1.3.1 Sự hút ẩm của collagen

kết giÁm Khi hwt n°ớc, collagen bị ion hóa do t°¡ng tác giữa các nhóm phân cực

hydro cāa chuỗi polypeptide trong collagen làm yếu liên kết Collagen liên kết với

thể tích phân tử collagen tng lên [19]

Tỉ lệ giãn ná cāa collagen có giới h¿n (7 % cho sợi °ớt và 5 % cho sợi khô)

bằng 1/3 - 1/4 chiều dài ban ầu Tiếp tÿc un nóng, collagen bị thāy phân thành

Trong quá trình lão hóa, collagen bị thoái hóa sẽ gây ra nếp nhn trên da [21]

Đun sôi dung dịch collagen t¿o thành gelatin, khi ó vòng xoắn ba má xoắn

gelatin T礃ऀ lệ giữa gelatin/gelaton/galatose phÿ thuộc vào thßi gian un và nhiệt ộ un Enzym trysin và pepsin có tác dÿng thāy phân chậm collagen và thāy phân nhanh gelatin Collagen bị kết tāa t¿o sợi dày khi bổ sung alchol, acetone hoặc muối

1.1.3.2 Sự tương tác của collagen với acid và kiềm

Collagen là chất l°ỡng tính, nó có thể tác dÿng với acid và kiềm do trên m¿ch cāa phân tử collagen tồn t¿i các gốc carboxyl và amino [21] Trong môi

có thể thu礃ऀ phân liên kết peptide trong collagen t¿o thành chuỗi peptide ngắn h¡n và các acid amin tự do

1.1.3.3 Một số tính chất khác của collagen [22]

Tuỳ thuộc nguồn gốc, mỗi lo¿i collagen sẽ có những ặc iểm khác nhau và chwng °ợc mô tÁ bái nhiều tính chất ặc tr°ng cho nguồn gốc trích ly nh°:

+ Nhiệt ộ biến tính collagen: là nhiệt ộ t¿i ó cấu trwc xoắn ba cāa collagen bắt ầu bị biến ổi thành những cuộn xoắn ngẫu nhiên Do ó, biết °ợc tính chất này sẽ giwp việc ăng dÿng collagen °ợc hiệu quÁ và thích hợp

+ Thành phần amino acid cāa collagen: là tính chất rất quan trọng, giwp ánh giá °ợc mặt dinh d°ỡng cāa collagen, là nền tÁng ể dự oán các tính chất hoá học, lý học và sinh học cāa collagen

+ Khối l°ợng phân tử collagen: là thông số gián tiếp giwp nhận biết măc ộ nguyên vẹn cāa m¿ch phân tử collagen thu °ợc (mỗi phân tử collagen có khối l°ợng khoÁng 300 kDa)

+ Phổ hồng ngo¿i (IR): mỗi amide có ộ hấp thÿ á b°ớc sóng riêng biệt, do vậy phổ IR giwp phát hiện và xác ịnh mẫu phân tích có tồn t¿i cấu trwc xoắn hay không

hóa yếu nh°ng tốt h¡n sữa gầy

+ Sự biến tính: d°ới tác dÿng hóa học cāa acid, base, muối, ancol… cấu trwc

nguyên liên kết peptide (cấu trwc bậc một cāa protein) Do vậy, tính chẩt cāa protein bị thay ổi, gọi là là hiện t°ợng biến tính protein Sau biến tính, protein th°ßng giÁm ộ hòa tan, mất ho¿t tính sinh học, nh¿y cÁm với enzyme protease, ộ nhớt nội t¿i tng lên và không kết tinh [23]

1.1.4 Tình hình nghiên cāu sÁn xuất collagen từ cá

1.1.4.1 Trên thế giới

Theo Caruso và cộng sự [24], °ớc tính rằng h¡n 50% bộ phận cāa cá, bao gồm vây, ầu, da và nội t¿ng, bị lo¿i bỏ d°ới d¿ng <chất thÁi=, v°ợt quá 20 triệu tấn sÁn phẩm phÿ mỗi nm Do ó, việc khai thác các sÁn phẩm phÿ từ cá biển nh° một nguồn cung cấp collagen mới ngày càng thu hwt °ợc sự chw ý [25, 26] do collagen thu °ợc từ cấc phÿ phẩm này dễ chiết xuất, hàm l°ợng cao, dễ hấp thÿ, t°¡ng thích sinh học, Không lây nhiễm một số mầm bệnh nh° collagen từ ộng vật Do vậy, nhiều nghiên cău ã tập trung vào việc trích ly và ánh giá các ặc tính cāa

collagen từ da cāa các loài cá khác nhau, chẳng h¿n nh° vÁy và vây cāa Catla catla và Cirrhinus mrigala [27], cá nhám mèo ốm nhỏ (Scyliorhinus canicula) [28], cá

da tr¡n (Silurus triostegus) [29]

Nghiên cău cāa Huang và cộng sự [30] cho thấy áp suất cao °ợc sử dÿng trong quá trình tách collagen từ vÁy cá rô phi cho sÁn l°ợng collagen từ 7,5 ến 12,3%, cao gấp 2–3 lần so với sÁn l°ợng cāa quy trình chiết xuất sử dÿng acetic acid thông th°ßng

Sử dÿng acid khi chiết tách collagen cũng °ợc nghiên cău Acetic acid là một trong những acid phổ biến nhất °ợc dùng trong chiết xuất collagen từ cá, nồng ộ cāa dung dịch th°ßng dùng từ 0,5 ến 1M Tan và cộng sự [31] ã nghiên cău Ánh h°áng cāa các lo¿i acid khác nhau (acetic acid, acid clohydric, acid citric và acid lactic, W:V = 1:50), t礃ऀ lệ chất lỏng/chất rắn và ộ pH khác nhau (1,8; 2,1; 2,4 ; 2,7 và 3,0 ) ến quá trình chiết xuất collagen từ da cá da tr¡n bằng các ph°¡ng pháp khác nhau (ph°¡ng pháp chiết xuất bằng acid, ồng nhất hóa và hỗ trợ pepsin) Ph°¡ng pháp pepsin và hỗ trợ ồng nhất hóa thể hiện khÁ nng thu hồi protein cao nhất (64,19% á pH 2,4 bằng HCl) Về ph°¡ng pháp chiết xuất acid, t礃ऀ lệ thu hồi protein tách từ da bằng HCl á pH 2,4 là 42,36% (cao nhất), tiếp theo là chiết xuất bằng acetic acid pH 2,7 (39,45%)

Tác dÿng cāa acetic acid nồng ộ khoÁng 0,2–1,0 M ối với quá trình chiết xuất collagen từ da cá °ợc Arumugam và cộng sự nghiên cău [32] Kết quÁ thu °ợc sÁn l°ợng collagen tng dần khi tng nồng ộ acetic acid, l°ợng collagen tối

a thu °ợc là 15,968 mg/g á 0,6M acetic acid Tuy nhiên, v°ợt quá 0,6 M, sÁn l°ợng collagen giÁm do l°ợng acid d° có tác dÿng thāy phân collagen

Yang và cộng sự nghiên cău tách chiết collagen từ da cá có sử dÿng acetic acid Hàm l°ợng collagen thu °ợc phÿ thuộc nồng ộ acetic acid sử dÿng, nồng ộ cāa collagen tng từ 0,518 lên 1,581 mg/mL khi thay ổi nồng ộ acetic acid từ 0,1 ến 2,0 M [33]

Masahiro Ogawa và cộng sự (2004) ã nghiên cău các tính chất hoá sinh cāa

collagen tách chiết từ x°¡ng và vÁy cāa cá trống en (Pogonia cromis) cận nhiệt ới và cá sheepshead seabream (Archosargus probatocephalus) Collagen °ợc

trích ly bằng cách sử dÿng acetic acid và sử dÿng enzyme pepsin kết hợp với acetic

Nm 2006, L.S Senaratne và các cộng sự ã nghiên cău tách chiết và xác

ịnh các tính chất ặc tr°ng cāa collagen từ da cá l°ng nâu toadfish (Lagocephalus

glover) Các tác giÁ °a ra quy trình tách: Đầu tiên khử protein phi collagen bằng cách ngâm da cá trong dung dịch NaOH 0,1N trong 3 ngày Sau ó lo¿i chất béo bằng ancol butylic 10% trong 24 giß Da cá sau khi lo¿i bỏ chất béo tiếp tÿc °ợc ngâm trong acetic acid 0,5M trong 3 ngày và °ợc xử lý bằng enzyme pepsin trong 48 giß ể tách collagen Thêm NaCl vào dung dịch thu °ợc ể kết tāa collagen Ph°¡ng pháp này cho hiệu suất tách chiết là 54,3% theo khối l°ợng khô, cấu trwc phân tử cāa collagen gồm ba chuỗi ³1, ³2, ³3, nhiệt ộ biến tính cāa collagen là 28

Lin Wang và các cộng sự (2008) cũng nghiên cău tách chiết và xác ịnh các

tính chất ặc tr°ng cāa collagen từ da, vÁy và x°¡ng cāa cá ỏ (Sebastes mentella)

Quá trình tách chiết °ợc thực hiện qua các b°ớc khử protein phi collagen bằng NaOH 1M; khử khoáng bằng ethylenediaminotetraacetic (EDTA) 0,5M và khử chất béo bằng hexan Các quá trình khử ều °ợc thực hiện trong 24 giß Sau ó các phần ều °ợc ngâm trong acetic acid 0,5M (trong 48 giß) ể chiết collagen và kết tāa collagen bằng NaCl Hiệu suất thu hồi và nhiệt ộ biến tính collagen từ da, vÁy

ph°¡ng pháp ùn – thāy phân – chiết (EHE) ể tách collagen từ vÁy cá rô phi Ph°¡ng pháp EHE °ợc ăng dÿng nhiều trong công nghiệp thực phẩm với nhiều °u iểm nh° dễ vận hành, sÁn xuất liên tÿc, nng suất cao và ít chất thÁi Quá trình ùn °ợc sử dÿng ể làm ăt các liên kết giữa collagen và hydroxyapatide trong vÁy cá và giwp cho sự trích ly collagen từ vÁy cá bằng cách tách với n°ớc °ợc dễ dàng h¡n H¡n nữa, quá trình ùn cũng giwp làm giÁm bớt mùi khó chịu cāa vÁy cá ể thu °ợc collagen có mùi dễ chịu h¡n Collagen thu °ợc là collagen lo¿i I, có ộ tinh s¿ch cao Hiệu suất cāa ph°¡ng pháp EHE cao h¡n 2-3 lần so với ph°¡ng pháp chiết/ép Tất cÁ các chiết xuất thu °ợc, ặc biệt là collagen lo¿i I có các tính chất hóa lý tốt và là ăng viên tiềm nng trong sÁn xuất các sÁn phẩm th°¡ng m¿i [37]

P K Bhagwat và cộng sự ã nghiên cău ặc tr°ng cāa collagen °ợc trích ly từ vÁy cá chép theo 2 b°ớc [23] Đầu tiên, vÁy cá sau khi s¡ chế °ợc tách khoáng bằng hỗn hợp dung dịch chăa NaCl 1M, Tris HCl 0,05M, EDTA 20 mM trong 48 giß Sau ó, ngâm vÁy cá trong dung dịch EDTA 0,5M trong 48 giß và °ợc rửa l¿i với n°ớc s¿ch, thu °ợc vÁy cá ã tách khoáng VÁy cá sau khi tách khoáng °ợc

cá Thêm NaCl (tới nồng ộ 0,9M) vào dịch lọc và khuấy liên tÿc trong 24 giß Sau ó, ly tâm hỗn hợp trong 20 phwt á tốc ộ 8000 vòng/phwt thu °ợc kết tāa Quá trình trên °ợc lặp l¿i hai lần ể thu °ợc collagen có ộ tinh khiết cao h¡n Collagen sau ó °ợc thẩm tích trong 24 giß tr°ớc khi tiến hành ông khô

Nm 2022, Rasmi Zakiah Oktarlina và cộng sự ã nghiên cău quy trình trích ly micro-collagen từ vÁy cá chép (Cyprinus carpio) Kết quÁ thu °ợc cho thấy hiệu suất trích ly collagen từ vÁy cá chép là 8,62%, collagen thu °ợc có màu trắng vàng, cấu trwc d¿ng sợi với các liên kết amide A, B, I, II và III Kích th°ớc cāa micro-collagen trong khoÁng 668 – 1581nm với kích th°ớc chā yếu là 1146 nm [38]

Cũng trong nm 2022, Robert Gál và cộng sự ã nghiên cău quá trình tách collagen từ x°¡ng cāa cá chép sau ó chế t¿o gelatin Thí nghiệm nghiên cău hai yếu tố cāa quy trình là nồng ộ HCl (t°¡ng ăng 0,5 ; 1,0 và 2,0 % khối l°ợng nguyên liệu) trong quá trình khử khoáng cāa nguyên liệu ban ầu và hàm l°ợng

collagen Tùy thuộc vào các iều kiện, gelatin thu °ợc bằng cách chiết xuất nhiều giai o¿n từ nguyên liệu ban ầu với tổng hiệu suất là 18,7–55,7% Gelatin thu °ợc có ộ nhớt trung bình thấp (1,1– 4,9 mPa.s) và thích hợp cho một số ăng dÿng trong thực phẩm, d°ợc phẩm và mỹ phẩm [39]

1.1.4.2 à Việt Nam

Trên thế giới, việc trích ly collagen từ da cá ã °ợc nghiên cău từ nm 1990, nh°ng á Việt Nam, ến nay ch°a có công trình nghiên cău trích ly collagen °ợc °a vào ăng dÿng Các nghiên cău gần ây mới chỉ dừng l¿i á quy mô phòng

thí nghiệm nh°: nghiên cău tách chiết gelatin từ da cá tra (Pangasianodon

hypophthalmus) cāa các tác giÁ Nguyễn Đỗ Quỳnh, Nguyễn Lê Anh Đào, Tr°ßng Đ¿i học Cần Th¡ [40] Kết quÁ thu °ợc cho thấy da cá °ợc khử 19%N phi protein

cāa gelatin thu °ợc (157,40 g) cao gấp 1,5 lần so với ộ bền gel cāa gelatin từ da cá Trung Quốc (107,2 g) Độ nhớt gelatin từ da cá tra (3,34 cP) cao h¡n ộ nhớt cāa gelatin từ Trung Quốc (1,88 cP)

Trần Thị Huyền và cộng sự, bằng ph°¡ng pháp hóa học ã tách chiết collagen từ da cá tra Để tng hiệu quÁ cho quá trình trích ly collagen, da cá tra °ợc ngâm trong dung dịch NaOH 0,2M (t礃ऀ lệ khối l°ợng/thể tích = 1/10) trong 20 giß, thay dung dịch xử lý 2 giß một lần Sau ó, xử lý bằng dung dịch acid citric 0,003M (t礃ऀ lệ khối l°ợng/thể tích = 1/8) trong 30 phút Tiếp tÿc ngâm trong dung dịch acetic acetic acid 0,5M (t礃ऀ lệ khối l°ợng/thể tích = 1/10) trong 34 giß ể trích ly collagen Dịch chiết °ợc kết tāa bằng dung dịch NaCl 2,5M thu °ợc collagen

(tính theo % khối l°ợng khô), hwt n°ớc cāa collagen tng 415%, collagen có nhiệt

kDa, 156 kDa, 217 kDa và 185 kDa [41]

Võ Quốc Vn và Hà Thanh Toàn (2008) ã sử dÿng ph°¡ng pháp hoá học ể

chiết tách gelatin từ da cá Tra Quá trình chiết tách °ợc thực hiện á 50oC trong 3 giß trong dung dịch acetic acid 0,05M Gelatin thu °ợc có khối l°ợng phân tử nằm trong khoÁng từ 95-138 kDa, chăa 14 lo¿i amino acid, trong ó proline chiếm t礃ऀ lệ cao nhất (13,73%) [42]

Tác giÁ Trần Thanh Nhãn ã sử dÿng enzyme alcalase với nồng ộ 0,05 % ể

Nm 2021, Tr°¡ng Thị Mộng Thu và cộng sự ã nghiên cău iều kiện tiền xử

lý và chiết tách collagen từ da cá lóc (Channa striata) bằng pepsin Kết quÁ thu °ợc

cho thấy, da cá lóc °ợc xử lý lo¿i lipid bằng cách ngâm trong dung dịch butyl alcohol 10% trong 72 giß Sau ó, chiết tách collagen °ợc thực hiện với pepsin 0,45% trong 24 giß Collagen thu °ợc là collagen lo¿i I, có 20 lo¿i acid amin, hòa tan tốt trong khoÁng pH 1 – 4 và dung dịch NaCl từ 0,2 – 0,6M [44]

1.1.5 Āng dụng cÿa collagen

1.1.5.1 Trong công nghệ thực phẩm

Trong công nghiệp thực phẩm, collagen °ợc dùng ể làm màng bọc kẹo, vỏ bao xwc xích, thực phẩm chăc nng Collagen °ợc sử dÿng làm bền hệ nhũ t°¡ng cāa xwc xích và gim bông sẽ làm tng khÁ nng giữ ẩm Do ó, làm giÁm °ợc hao hÿt khối l°ợng trong suốt quá trình chế biến Nhß vào cấu trwc có thă bậc cāa collagen ã t¿o cho lớp vỏ ộ bền và ộ ổn ịnh trong suốt quá trình chế biến, tuy nhiên vẫn giữ °ợc ộ mềm cần thiết cho sÁn phẩm hoàn thiện Vỏ bao bằng collagen có nhiều °u iểm h¡n so với màng bao bằng ruột ộng vật nh°: dễ vệ sinh h¡n, dễ dàng bÁo quÁn, chất l°ợng ổn ịnh, dễ dàng t¿o màu sắc Polyphenol và tanin trong r°ợu bị kết tāa cùng collagen nên °ợc sử dÿng trong nghành công nghiệp ồ uống nh° r°ợu vang giúp lo¿i bỏ các thành phần ộc h¿i [45]

1.1.5.2 Trong y dược

Trong y - d°ợc, do khẳ nng phân hāy, t¿o màng và t¿o gel, collagen °ợc sử dÿng rộng dãi Collagen còn °ợc sử dÿng nhiều y d°ợc do không gây dị ăng và °ợc hấp thj triệt ể trong c¡ thể; ngoài ra tính t°¡ng thích sinh học cũng nh° khÁ nng cầm máu cāa collagen nên nó có thể °ợc chế t¿o thành những d¿ng bào chế khác nhau Dựa vào các tính chất trên cāa collagen có thể °ợc ăng dÿng trong các

lĩnh vực sau: sÁn xuất thuốc, sÁn xuất vật liệu cầm máu và làm lành vết th°¡ng, máu nhân t¿o, sÁn xuất môi tr°ßng nuôi cấy tế bào và mô

Có nhiều polyme tự nhiên và nhân t¿o °ợc ăng dÿng nh° là các lo¿i vật liệu sinh học, nh°ng các tính chất cāa collagen khác với các tính chất cāa polyme tổng hợp chā yếu á cách thăc nó t°¡ng tác với c¡ thể Collagen có tính chất ho¿t ộng bề mặt, có khÁ nng phân hu礃ऀ tốt, có tính kháng nguyên yếu và có khÁ nng t°¡ng thích sinh học cao h¡n so với các polyme khác nh° albumin và gelatin [46, 47] Những ăng dÿng chính cāa collagen trong lĩnh vực y d°ợc làm hệ thống vận chuyển thuốc bao gồm:

+ Màng mỏng collagen: màng collagen có tác dÿng làm màng vận chuyển thuốc, các thành phần thuốc °ợc °a vào các màng nhß liên kết hydro và liên kết cộng hoá trị Các màng collagen °ợc dùng trong iều trị nhiễm trùng mô, nhiễm trùng giác m¿c…

+ L°ới collagen sử dÿng trong nhãn khoa: l°ới collagen có tác dÿng bÁo vệ biểu mô giác m¿c khỏi ho¿t ộng chớp mắt cāa mí mắt, ồng thßi nó thwc ẩy quá trình chữa lành biểu mô sau khi cấy ghép giác m¿c D°ợc phẩm °ợc vận chuyển phÿ thuộc vào khÁ nng n¿p và giÁi phóng d°ợc phẩm cāa l°ới collagen L°ới collagen khi °ợc °a vào trong mắt sẽ t¿o ra một lớp dung dịch collagen có khÁ nng t°¡ng thích sinh học và nó có tác dÿng bôi tr¡n bề mặt trong cāa mắt, làm giÁm sự cọ xát cāa mí mắt với giác m¿c, và thwc ấy quá trình lành biểu mô

+ Bng, g¿c collagen: Bng g¿c collagen có nhiều °u iểm nh°: (1) Có khÁ nng thấm hwt một l°ợng lớn dịch tiết cāa mô, bám dính tốt vào vết th°¡ng °ớt do ó bÁo vệ vết th°¡ng khỏi sự lây nhiễm vi sinh vật (2) G¿c collagen có khÁ nng kết hợp với các thành phần thwc ẩy phát triển tế bào và kết hợp với các hợp chất kháng khuẩn, làm cho quá trình chữa lành vết th°¡ng diễn ra nhanh chóng h¡n (3) H¡n nữa ể ¿t °ợc hiệu quÁ phÿc hồi nhanh h¡n, g¿c collagen °ợc kết hợp với một số thành phần khác nh°: elastin, fibronectin và glycosaminoglycan…

+ Trong kỹ thuật cây ghép da, collagen °ợc sử dÿng là chất vận chuyển các tế bào da °ợc nuôi cấy hoặc là chất vận chuyển các thành phần thuốc cho quá trình

thay thế da và iều trị vết bỏng Trong kỹ thuật nuôi cấy da thay thế, màng collagen có tác dÿng thwc ẩy sự phát triển cāa biểu mô

1.1.5.3 Trong mỹ phẩm

Trong cấu trúc cāa da có ến 70% thành phần là collagen, °ợc phân bố nhiều á lớp h¿ bì Collagen óng vai trò trong việc t¿o hệ thống nâng ỡ, tng c°ßng các ặc tính c¡ học cāa da nh° ộ àn hồi, săc cng, ộ mịn cāa da và ộ ẩm cāa da Khi số l°ợng, chất l°ợng và hàm l°ợng collagen bị suy giÁm dẫn ến giÁm ộ àn hồi, ộ cng mịn cāa da và khÁ nng giữ ẩm cāa da… Ngoài 30 tuổi, tốc ộ tổng hợp collagen giÁm và tng quá trình lão hóa, phân hāy cāa collagen Hàng nm, trung bình l°ợng collagen trong c¡ thể bị tổn hao khoÁng 1,5 % Hàm l°ợng collagen mất i làm thay ổi các °ßng nét trên khuôn mặt, làn da bị chÁy nhão, trùng xuống và xuất hiện các nếp nhn Vì vậy, bổ sung collagen th°ßng xuyên giúp cÁi thiện cấu trúc cāa da, phÿc hồi tế bào tổn th°¡ng, tng khÁ nng giữ ẩm và kích thích tái t¿o làn da Do ó, collagen là thành phần chính cāa các sÁn phẩm làm ẹp nh°: kem d°ỡng, mặt n¿ collagen, sữa tắm… Collagen °ợc sử dÿng làm thuốc tiêm cng da, và °ợc FDA (Cÿc quÁn lý Thực phẩm và D°ợc phẩm Hoa Kỳ) chăng nhận và cho phép tiêm vào các nếp nhng, vết sẹo trong iều trị thẩm mỹ Thuốc tiêm chăa collagen °ợc tiêm vào lớp h¿ bì giúp iều chỉnh các nếp gấp, nếp nhn giúp khôi phÿc l¿i vẻ bề ngoài mềm m¿i, cng mịn và trẻ hóa làn da Thuốc tiêm collagen có tác dÿng trong 1 – 2 nm do collagen cũng bị c¡ thể hấp thu [56]

1.2.1 Cấu t¿o và cấu trúc phân tử carrageenan

1.2.1.1 Thành phần, cấu t¿o và cấu trúc phân tử carrageenan

từ rêu Irish moss (Loài rong ỏ Chondrus crispus) t¿i một ngôi làng trên bß biển

cấu trwc hóa học cāa Car °ợc ẩy m¿nh Hiện nay, sÁn xuất Car với quy mô công

nghiệp °ợc má rộng, mà nguồn rong ỏ thuộc ngành Rhodophyta sử dÿng phổ

biến h¡n Những loài này gọi chung là Carrageenophyt Từ nhiều công trình nghiên cău, ã có hàng chÿc loài rong biển °ợc khai thác tự nhiên hay nuôi trồng ể sÁn xuất Car

gắn vào Car á các vị trí với số l°ợng khác nhau Vì vậy, Car không chỉ là một

cấu trwc riêng và °ợc ký hiệu riêng Nh°: ½-, ¾-, À-, ¼-Car (Hình 1.7) [48]

Car trong nội bào và thành tế bào rong biển, Car là một polysaccharit cao phân tử với hàm l°ợng este-sulfate từ 15% - 40% Với các ¡n vị mắt xích c¡ bÁn

glycosid và ³-(1,3), các ¡n vị này ều có thể °ợc hoặc không °ợc sulfat hóa Số l°ợng và vị trí nhóm este sulfat cũng nh° hàm l°ợng 3,6-AG là nguyên nhân gây kên sự khác nhau giữa các ½-, ¾-, À-, ¼-Car ½-Car có l°ợng este sulfat từ 25% ến 30% và khoÁng 28% ến 35% l°ợng 3,6-AG ¼-Car có l°ợng este sulfat từ 28% ến 30% và l°ợng 3,6-AG từ 25% ến 30% ¾-Car có l°ợng este sulfat trong khoÁng 32% ến 39% và không có 3,6-AG [48] Hàm l°ợng este sulfat lớn làm nhiệt ộ hòa tan thấp và ộ bền gel thấp [49]

Hknh 1.7 Cấu trwc phân tử và sự chuyển hóa trong môi tr°ßng kiềm cāa các lo¿i

carrageenan khác nhau

1.2.1.2 Phân lo¿i carrageenan

Dựa theo cấu trúc carrageenan °ợc chia thành các lo¿i [48]:

¼-Car: Là một lo¿i polymer m¿ch ngắn có sự xen kẽ giữa

D-galactose-4-sulphate và 3,6–AG Cấu trwc phân tử ½-carrageenan là một vòng chuỗi xoắn kép bậc 3 (Hình 1.8)

Hình 1.8. Cấu trúc cāa ½-Car

»-Car: Gống nh° ½-Car nh°ng gốc 3,6-AG l¿i á vị trí cacbon số 2 ¼-Car có

cấu trúc vòng xoắn kép bậc 2 Gel ¼-Car có tính àn hồi tốt (Hình 1.9)

Hình 1.9. Cấu trúc cāa ¼-carrageenan Car

Hình 1.10. Cấu trúc cāa ¾-carrageenan Car

1.2.1.3 Tính chất của carrageenan

Các lo¿i carrageenan khác nhau có các tính chất khác nhau nh°: ộ tan; tính t¿o gel và t¿o ộ nhớt cāa dung dịch; khÁ nng liên kết với protein cũng nh° liên kết với các polysaccarid khác Do vậy, á các tr¿ng thái khác nhau, carrageenan có những tính chất khác nhau ặc tr°ng cho từng d¿ng sÁn phẩm

* Độ tan

cāa gel Độ tan cāa Car phÿ thuộc vào số l°ợng, số lo¿i các ion trong cấu trúc và nồng ộ dung dịch Car

Trong n°ớc l¿nh, chỉ có ¾-Car và muối sodium cāa ½- và ¼-Car là bị hòa tan Muối potassium và calci cāa ½- và ¼-Car không tan, khÁ nng tr°¡ng ná cāa car phÿ thuộc vào theo nồng ộ và kiểu cation có mặt trong n°ớc Trong n°ớc l¿nh khi có

này sau khi làm l¿nh ều hình thành gel Độ chắc cāa gel và tính ồng nhất cāa

nh° chất t¿o gel và làm ặc dung dịch sữa l¿nh khi có mặt cāa gốc photphat

¼- và ¾-Car hòa tan trong dung dịch muối NaCl 10% có sự gia nhiệt ½-Car không hòa tan trong dung dịch này [50]

* Độ nhớt

Độ nhớt cāa dung dịch Car xác ịnh °ợc khi dung dịch Car không t¿o gel Khi dung dịch Car thay ổi nhiệt ộ từ cao xuống thấp sẽ làm tng ộ nhớt ến khi xuất hiện gel Độ nhớt tng khi bắt ầu hình thành gel Vì vậy, quá trình o ộ nhớt cāa dung dịch Car °ợc tiến hành á nhiệt ộ cao (75,0ºC) ể tránh sự

Độ nhớt dung dịch Car phÿ thuộc vào nhiệt ộ, nồng ộ và sự xuất hiện cāa ion khác trong dung dịch, khối l°ợng và lo¿i Car [56] Độ nhớt tng khi nồng ộ dung dịch Car tng hoặc khối l°ợng phân tử Car lớn Độ nhớt dung dịch Car giÁm khi tng nhiệt ộ và ng°ợc l¿i [50]

Dung dịch Car có ộ nhớt thấp nên dễ dàng xử lý [51] Do gel n°ớc ½-Car không á d¿ng thixotrovân phổ Khi ½-Car °ợc sử dÿng trong sữa với nồng ộ nhỏ, chwng có ặc tính t°¡ng tự ¼-Car trong n°ớc Vì vậy, gel yếu °ợc t¿o bái hỗn hợp

protein sữa và ½-Car dễ bị phá vỡ khi có lực tác ộng, khi ó chế ộ chÁy cāa gel trá thành giÁ dẻo Khi lực tác ộng giÁm, gel tái hình thành và chế ộ chÁy l¿i trá về bÁn chất tự nhiên là thixotropic

* T¿o gel

Khi làm l¿nh, dung dịch ½-, ¼-Car t¿o thành gel Hiện t°ợng này phÿ thuộc vào cấu trúc xoắn ôi cāa Car à nhiệt ộ lớn h¡n nhiệt ộ chÁy lỏng cāa gel, Car tồn t¿i á tr¿ng thái cuộn ngẫu nhiên trong dung dịch Khi h¿ nhiệt ộ dung dịch, hình thành cấu trúc không gian 3 chiều, hình thành các iểm xoắn ôi t¿i iểm giao nhau cāa chuỗi polyme Khi h¿ nhiệt ộ xuống d°ới nhiệt ộ nóng chÁy sẽ t¿o iều kiện cho các mắt xích cāa Car ính kết ể t¿o gel với cấu trúc 3 chiều Sự xuất hiện cāa liên kết trong cấu trúc cũng nh° kiểu, số l°ợng và vị trí nhóm este sulfat sẽ Ánh h°áng ến tính t¿o gel cāa Car C¡ chế gel hóa c¡ bÁn dựa trên dung dịch ½- và ¼-Car

tới ặc tính cāa ¾-Car (Hình 1.11) [52]

Hình 1.11 Gel carrageenan với Ca2+

Các cation tng c°ßng sự gel hóa cāa Car, giúp ổn ịnh cấu trúc xoắn cāa Car thông qua việc chặn/khóa nhóm sulfat, ngoài ra các cation có thể tham gia liên kết phối trí giữa các phân tử [53]

phÿ thuốc vào nồng ộ KCl, khi tng nồng ộ KCl làm tng ộ căng cāa gel ½-Car

½-Car tinh khiết hình thành gel yếu á nồng ộ từ 0,7 – 1,4% Khi có mắt ồng thßi 2

Độ àn hồi cāa gel Car là do số l°ợng nhóm sulfat thấ [55], do nhóm sulfat không t¿o cấu trúc lập thể, do vậy quá trình chuyển hóa cấu trúc cāa Car bị dừng l¿i

khÁ nng ông ặc Độ chắc gel t礃ऀ lệ thuận với nồng ộ Car và ion trong dung dịch Gel °ợc hình thành d¿ng gel nhiệt khôi phÿc và có ít sự biến ổi khichúng tham

có thể °ợc ánh giá thông qua mô un àn hồi Mô un àn hồi tng khi tng nồng ộ Car [57, 58]

1.2.2 Tình hình nghiên cāu sÁn xuất carrageenan

1.2.2.1 Trên thế giới

Để thu °ợc Car, rong biển °ợc chiết xuất bằng cách sử dÿng n°ớc nóng

chất và sấy khô, ngâm trong dung dịch kiềm (3–10%) un á nhiệt ộ cao (70–100

tiền chất cāa carrageenan Sau khi chiết kiềm, hàm l°ợng sulfat sẽ giÁm [60] Vì lý do này việc chiết xuất Car bằng kiềm gọi là khử l°u huỳnh

Chiết xuất Car cũng có thể thực hiện bằng n°ớc nóng So với chiết xuất kiềm, ph°¡ng pháp n°ớc nóng cho hiệu suất cao h¡n [61] Nh°ợc iểm, ộ bền gel °ợc t¿o ra bái nhiệt ộ nóng n°ớc thấp h¡n so với sử dÿng dung dịch kiềm Độ bền gel thấp h¡n do hàm l°ợng sunfat cao h¡n và hàm l°ợng 3,6-AG thấp h¡n so với trong chiết kiềm Vì lý do này, chiết kiềm th°ßng °ợc sử dÿng trong quy mô công nghiệp Car

Andi Hasiah và các cộng sự ã chiết xuất Car từ Eucheuma spinosum bằng cách sử dÿng nhiệt iện trá Kết quÁ cho thấy hiệu suất chiết thay ổi từ 29,6-62,4%

với ộ nhớt và ộ bền gel thay ổi lần l°ợt từ 259-290 cP và 42,54-70,41 g/cm2

cP) ¿t °ợc á nhiệt ộ chiết xuất 95 °C, thßi gian chiết 240 phút, nồng ộ KOH 0,4M, t礃ऀ lệ dung dịch so với rong biển là 45/1 [61]

Tr°ớc ó, Webber và cộng sự cũng nghiên cău ể tối °u hóa quá trình chiết tách Car từ rong bằng ph°¡ng pháp bề mặt áp ăng Nghiên cău xác ịnh °ợc iều kiện chiết xuất tối °u là 74°C trong 4 giß, hiệu suất chiết tách carrageenan là

Car chiết xuất từ Kappaphycus alvarezii ã °ợc Anisuzzaman và cộng sự nghiên cău Rong biển °ợc xử lý kiềm và sử dÿng kỹ thuật phun sấy ể thu °ợc bột Car Quy trình chiết tối °u cho kỹ thuật sấy phun cho kết quÁ á nồng ộ KOH 6,70% và thßi gian chiết 74,70 phút à iều kiện tối °u, ộ nhớt cāa gel là 111,80 cP và kích th°ớc h¿t cāa bột là 86,88 ¿m Độ bền cāa gel °ợc tối °u hóa á măc

Trong số các nghiên cău về ph°¡ng pháp chiết xuất Car thì ph°¡ng pháp xử lý bằng enzyme cho nhiều hăa hẹn h¡n và thân thiện với môi tr°ßng [64] Mặc dù công nghệ này có tiềm nng °ợc sử dÿng á quy mô công nghiệp nh°ng có rất ít thay ổi trong việc sử dÿng enzyme ể sÁn xuất Car từ rong biển Enzyme cellulase là một trong những enzyme °ợc sử dÿng rộng rãi nhất ể chiết xuất carrageenan

ph°¡ng pháp un sôi ¿t hiệu suất 37,5% [65] Enzyme xenluloze °ợc thêm vào

trong 1 giß Các huyền phù °ợc ly tâm tách lấy các chất nổi trên bề mặt và cho vào

cao vì cellulose là thành phần chính cāa thành tế bào rong biển Endo-cellulase, exo-cellulase và ³ -glucosidase là ba lo¿i enzyme cellulose chính và quá trình thāy phân hoàn toàn các vi sợi cellulose trong thành tế bào có thể °ợc thực hiện bằng cách kết hợp ba lo¿i enzyme này [66]

Gần ây, nhằm giÁm thiểu việc sử dÿng hóa chất các nghiên cău về ph°¡ng pháp sử dÿng ít dung môi h¡n, tốn ít nng l°ợng và thßi gian chiết xuất