Báo cáo thiết bị công nghệ và kỹ thuật công nghệ sinh học 1.1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CNSH PHÁT HIỆN VIRUS FELINE PAULEUKOPENIA FPV GÂY BỆNH GIẢM BẠC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CNSH

PHÁT HIỆN VIRUS FELINE PAULEUKOPENIA (FPV) GÂY BỆNH GIẢM BẠCH CẦU Ở MÈO

BẰNG CÔNG NGHỆ nanoPCR

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN

THIẾT BỊ VÀ KĨ THUẬT CNSH

PHÁT HIỆN VIRUS FELINE PAULEUKOPENIA (FPV) GÂY BỆNH GIẢM BẠCH CẦU Ở MÈO

BẰNG CÔNG NGHỆ nanoPCR

TRẦN THỊ THU HÀ – 21126321 TRANG THỊ DIỆU HIỀN – 21126339

TP Thủ Đức, 09/2023

LỜI CẢM ƠN

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến toàn bộ quý thầy cô Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, thầy cô đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên phụ trách môn học - Thầy Huỳnh Văn Biết, người đã nhiệt tình hướng dẫn em thực hiện báo cáo này

TÓM TẮT

Giảm bạch cầu ở mèo (Feline panleukopenia) là một bệnh do rút nghiêm trọng do vi-rút giảm bạch cầu ở mèo (FPV) gây ra, khiến các lĩnh vực như nhân giống mèo đồng hành và bảo tồn mèo có nguy cơ tuyệt chủng gặp nguy hiểm Loại virus này có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong cao và được tìm thấy trên khắp thế giới Một số phương pháp phát hiện hiện có, chẳng hạn như qPCR, phân tích hóa mô miễn dịch, Kit test nhanh, v.v., tốn thời gian, tốn công sức, tốn kém và khó vận hành, không có lợi cho việc phổ biến Mặc dù kit test nhanh FPV nhanh và tiện lợi nhưng chúng có độ nhạy thấp Nghiên cứu được thực hiện nhằm phát hiện FPV ở mèo bằng công nghệ nanoPCR Phương pháp này đã khuếch đại đoạn axit nucleic có kích thước 345 bp với giới hạn phát hiện tối thiểu là 7,97 × 102 bản sao/μL, lớn hơn khoảng 100 lần so với PCR truyền thống Phương pháp này nhạy hơn phương pháp PCR thông thường, thuận tiện và tiết kiệm chi phí hơn phương pháp qPCR và có thể được sử dụng để phát hiện lâm sàng FPV

Từ khóa: virus giảm bạch cầu ở mèo; gen VP2; nanoPCR; thử nghiệm lâm sàng; dịch tễ học

SUMMARY

1.3 Nội dung thực hiện……… 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Quá trình virus xâm nhiễm vào cơ thể 3

2.2 Phương pháp nanoPCR 3

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 5

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 5

3.2.1 Nguyên vật liệu 5

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu 5

3.2.2.1 Thu thập thông tin và quan sát triệu chứng lâm sàng 5

3.2.2.2 Chẩn đoán FPV bằng Kit chẩn đoán nhanh 5

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

FP: Feline Panleukopenia

FPV: Feline Panleukopenia virus

qPCR: Real – time PCR

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 4.1 Kết quả phản ứng nanoPCR

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Giảm bạch cầu ở mèo (FP) hay còn gọi là bệnh viêm ruột truyền nhiễm ở mèo là một bệnh nhiễm trùng cấp tính, rất dễ lây lan do virus giảm bạch cầu ở mèo virus Feline Panleukopenia (FPV) gây ra có thể lây lan nhanh chóng ở mèo FPV được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1928 và được đặt tên chính thức vào năm 1935 FPV gây sốt nặng, nôn mửa và tiêu chảy ở động vật bị nhiễm bệnh, cũng như giảm lượng bạch cầu lớn Virus lây lan nhanh chóng và có thể lây truyền theo chiều ngang qua phân, nước tiểu và chất nôn của động vật bị nhiễm bệnh và lây truyền theo chiều dọc trong quá trình mang thai sang thai nhi, nơi nó có thể gây ra chứng giảm sản tiểu não của thai nhi Virus Feline Panleukopenia gây bệnh cho mèo ở tất cả lứa tuổi, nhưng mẫn cảm nhất là mèo non nhỏ hơn 1 tuổi, đặc biết ở mèo chưa được tiêm phòng đầy đủ, tỷ lệ mắc và tỷ lệ chết cao

FPV là một loại virus DNA chuỗi đơn thuộc họ Parvoviridae và chi parvovirus có dạng

tròn hoặc hình lục giác dưới kính hiển vi điện tử không có cấu trúc viên nang Bộ gen của nó có chiều dài khoảng 5200 nt và chứa hai khung đọc mở (ORF) mã hóa các protein cấu trúc (VP1 và VP2) và các protein phi cấu trúc (NS1 và NS2)

Hình 1.1 Tế bào virus Feline Panleukopenia (FPV)

Với sự phát triển của khoa học vật liệu, nhiều vật liệu hạt nano khác nhau đã thâm nhập vào ngành công nghiệp sinh học và y tế NanoPCR là một phương pháp PCR tương đối gần đây Quá trình này bao gồm việc thêm các hạt nano vàng có đường kính nhỏ hơn 100 nm vào phản ứng PCR Trong quá trình thay đổi nhiệt độ phản ứng, các hạt như vậy sẽ hình thành chất lỏng nano, tăng cường độ dẫn nhiệt của phản ứng và cho phép nó nhanh chóng đạt đến nhiệt độ phản ứng mục tiêu trong chu trình nhiệt, giảm thời gian phản ứng ở nhiệt độ không phải mục tiêu Nó cũng tăng cường đáng kể sự tiếp xúc động học của các thành phần chất phản ứng thông qua hiệu ứng điện tích, v.v., do đó cải thiện

với enzyme Taq và sự kết hợp của cả hai gần hơn ở nhiệt độ thấp hơn, điều này có thể ức chế sự khuếch đại không đặc hiệu Ở nhiệt độ cao hơn, sự kết hợp của cả hai là lỏng lẻo và có thể thực hiện khuếch đại cụ thể bình thường Vật liệu này cũng có vai trò tương tự như protein liên kết chuỗi đơn (SSB), có thể hấp thụ có chọn lọc DNA chuỗi đơn mà không hấp phụ DNA chuỗi kép, cải thiện tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu của phản ứng PCR Điều này càng cải thiện hiệu quả, độ đặc hiệu và độ nhạy của các phản ứng PCR, có thể nhạy hơn 10 – 1000 lần so với PCR thông thường và ít tốn kém hơn, dễ vận hành hơn và không yêu cầu các dụng cụ chuyên dụng theo yêu cầu của phương pháp qPCR có độ nhạy cao

1.2 Mục tiêu đề tài: phát hiện virus gây bệnh giảm bạch cầu ở mèo (FPV)

1.3 Nội dung thực hiện: phát hiện FPV ở mèo bằng công nghệ nanoPCR từ 83 mẫu

được lấy từ các phòng khám thú y ở TPHCM

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Quá trình virus xâm nhiễm vào cơ thể

FPV được thải ra từ tất cả các chất bài tiết của cơ thể trong thời gian bệnh nhưng thường được tìm thấy nhiều nhất trong phân Sự nhân lên của virus trong biểu mô ruột dẫn đến sự phát tán virus qua phân Thời gian phát tán virus thường chỉ vài ngày FPV xâm nhập vào các tế bào bằng cách sử dụng thụ thể transferrin 13 và sao chép trong các tế bào ở pha S của chu kỳ phân bào Ban đầu, virus nhân lên trong mô bạch huyết hầu họng Từ đó, virus lây lan qua hệ bạch huyết và máu đến nhiều mô Nhiễm trùng các mô bạch huyết dẫn đến hoại tử mô bạch huyết Nhiễm trùng tủy có liên quan đến giảm bạch cầu, kết hợp với sự cô lập bạch cầu trung tính trong mô đường tiêu hóa bị tổn thương Sự nhân lên của virus thành công dẫn đến sự ly giải tế bào chỉ xảy ra ở những tế bào đang nhân lên tích cực sự phá hủy các tế bào mật của ruột dẫn đến làm mất hoàn toàn các nhung mao ruột ngoài ra, sự phá hủy các mô bạch huyết có thể góp phần gây ra tình

trạng suy giảm miễn dịch do virus gây ra Tất cả các parvovirus đều có chung tính ái

tính đối với các tế bào có chỉ số phân bào cao; nghĩa là những virus này chỉ có thể hoàn thành chu trình sao chép của chúng trong các tế bào đang phân chia nhanh chóng Với khả năng mã hóa bộ gen nhỏ, phần lớn bộ máy sao chép của virus phải được cung cấp bởi tế bào bị nhiễm bệnh

2.2 Phương pháp nanoPCR

NanoPCR nó tăng tốc đáng kể quy trình qPCR thông thường bằng cách sử dụng các hạt nano

Hình 2.1 Quy trình nanoPCR (a) DNA trộn với MPN; (b) chiếu đèn xanh lên MPN; (c) enzyme DNA polymerase được thêm vào hỗn hợp; (d), (e), (f), (g) DNA theo cấp số nhân qua nhiều chu kỳ; (h), (i), (k), (l) nam châm được sử dụng tách MPN khỏi mẫu

DNA được chiết xuất khỏi mẫu và trải qua quá trình tinh chế DNA tinh khiết được trộn với MPN Chiếu đèn xanh lên MPN sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này sẽ nhanh chóng hoàn thành trong vòng 5 phút Sau đó DNA polymerase đc thêm vào để nhân DNA này theo cấp số nhân qua nhiều chu kỳ Trong một chu kỳ, đèn được bật để làm nóng nhanh mẫu lên 90°C sau đó tắt để làm mát môi trường xung quanh xuống 60°C Sau khi chuẩn đoán qPCR được thực hiện trong máy nanoPCR quy trình này tận dụng đặc tính từ tính của MPN, nam châm được sử dụng để tách MPN từ mẫu điều này cho pháp mẫu nhanh chóng được loại bỏ khỏi MPN để DNA có thể được phân tích huỳnh quang để phát hiện của gen virut FPV sẽ biểu hiện huỳnh quang Trong khi các mẫu âm tính sẽ không ở dạng nanoPCR, mỗi chu kỳ chỉ mất 9 giây so với qPCR thông thường mất khoảng 2 - 3 phút

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời Gian bắt đầu nghiên cứu từ ngày 15 tháng 1 năm 2023 đến ngày 27 tháng 8 năm

2023 Địa chỉ nghiên cứu tại đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nguyên vật liệu

83 con mèo có triệu chứng lâm sàng điển hình nghi mắc giảm bạch cầu mèo đến khám ở phòng khám thú y ở TPHCM

Vật tư, hóa chất: bao gồm hệ thống máy móc và vật tư phục vụ thực hiện phương pháp nanoPCR: bộ kit MyTaqTM Mix, plasmid mini kit; bộ kit tách chiết DNA QIAamp của hãng Qiagen (Đức), máy PCR; máy điện di, máy chụp ảnh gel Bộ kit chẩn đoán nhanh Feline Parvovirus Antigen Test do công ty Careside (Hàn Quốc) sản xuất

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Thu thập thông tin và quan sát triệu chứng lâm sàng

Thu thập thông tin: mèo được mang đến khám và điều trị tại phòng khám thú y đều thu thập thông tin và lập hồ sơ bệnh án; Quan sát triệu chứng lâm sàng của mèo mắc bệnh: các biểu hiện lâm sàng của mèo mắc bệnh được quan sát từ khi đến khám và trong suốt quá trình điều trị tại phòng khám Các triệu chứng được theo dõi chủ yếu như: thân nhiệt, phản xạ nôn, mức độ tiêu chảy, biểu hiện mất nước

3.2.2.2 Chẩn đoán FPV bằng Kit chẩn đoán nhanh

Tất cả mèo nghi ngờ đều được lấy dịch hầu họng, dịch nôn, dịch phân để xác định kháng nguyên virus Feline panleukopenia (FPV) bằng kit Feline Parvovirus Antigen Test do công ty Careside (Hàn Quốc) sản xuất

Diễn giải kết quả:

Dương tính: cả vạch C và T đều hiện màu

Âm tính: chỉ có vạch C hiện màu Kết luận không có kháng nguyên FPV Không hợp lệ: vạch C không hiện màu cho dù vạch T hiện màu hay không

3.2.2.3 Phương pháp nanoPCR

Phương pháp nanoPCR bao gồm các bước tách chiết DNA virus, thiết kế primer và các bước thực hiện kỹ thuật nano PCR

3.2.2.3.1 Tách chiết DNA virus

Chủng FPV YBYJ-1 đã được phân lập và bảo quản trước bằng cách lấy mẫu bệnh phẩm gồm hỗn hợp dịch ngoáy hầu họng, dịch nôn và mẫu phân của 83 mèo bị nghi nhiễm FPV Trong số đó, 26 mẫu dương tính với FPV bằng kit Feline Parvovirus

độ 5000 vòng/phút trong 3 phút để thu chất nổi phía trên Các vật liệu được chiết xuất bằng bộ chiết DNA QIAamp của hãng Qiagen (Đức) và giữ ở -80oC

3.2.2.3.2 Thiết kế primer

Trình tự gen FPV VP2 được lấy từ ngân hàng gene và các đoạn mồi để khuếch đại gen VP2 có chiều dài đầy đủ của FPV được xây dựng bằng phần mềm Oligo 7:VP2-F: 5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAAC-3 và VP2-R: 5′- GTATACCATATAACAAACCTTC-3, với độ dài khuếch đại dự đoán là 1932 bp

Để xây dựng các plasmid mẫu dương tính tiêu chuẩn, các mồi đặc hiệu được thiết kế theo vùng bảo tồn của gen VP2: VP2-U: 5′-TATATAGCACATCAGATACG-3′ và VP2-L: 5′-TGCATCAGGATCATATTCATT-5′-TATATAGCACATCAGATACG-3′, mức khuếch đại dự kiến chiều dài đoạn là 698 bp

3.2.2.3.3 Phản ứng nano PCR

Gen VP2 được khuếch đại bởi mồi VP2-F/R Các điều kiện phản ứng là 95°C trong 5 phút, 94°C trong 30 giây, 55°C trong 2 phút, 72°C trong 2 phút, tổng cộng 30 chu kỳ và 72°C trong 5 phút Phân tích điện di được thực hiện bằng gel agarose 1% Dải mục tiêu có độ dài 1932 bp đã được phục hồi và tinh chế bằng bộ phục hồi gel, chứa vectơ pMD19-T và được nhân giống trong DH5α Sau khi nuôi cấy mở rộng, plasmid pMD19-T-FPV-VP2 tái tổ hợp đã được chiết xuất bằng cách sử dụng bộ kit plasmid mini, nồng độ và số lượng bản sao (7,97 × 10 10bản sao/μL) được xác định bằng Nanodrop và được sử dụng làm mẫu dương tính tiêu chuẩn

Mồi VP2-U/L được sử dụng để khuếch đại mẫu dương tính chuẩn bằng nanoPCR Hệ thống phản ứng là mẫu plasmid 1 μL, 1 μL mồi ngược dòng và xuôi dòng (10 μM), 2 μL dNTP (mỗi loại 2,5 mM), 2,5 μL dung dịch đệm 10 × Ex Taq (20 mM), 0,5 μL DNA Ex Taq Polymerase (5 U/μL), hòa tan trong ddH 2O, 1 μL hạt nano vàng (đường kính 20 nm, nồng độ 0,2 mM) đã được thêm vào tổng thể tích 26 µL Quy trình phản ứng nanoPCR là 95°C 5 phút, 95°C 30 giây, 50°C 30 giây, 72°C 30 giây, tổng cộng 30 chu kỳ phản ứng, 72°C 10 phút và cuối cùng được bảo quản ở 4°C

Các phản ứng trên được thực hiện trong thiết bị PCR và cuối cùng 8 μL sản phẩm phản ứng được phân tích bằng điện di trên gel agarose 1%

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

Tất cả các mèo này đều được chỉ định lấy mẫu gồm hỗn hợp dịch hầu họng, dịch nôn và phân để thực hiện kiểm tra sàng lọc bằng Kit test nhanh và thực hiện phản ứng nanoPCR Kết quả cho thấy cho 26 ca dương tính với bệnh giảm bạch cầu ở mèo bằng Kit test nhanh cho 2 vạch C (Control) và vạch T (Test) đậm, rõ ràng và 03 ca cho vạch test (T) mờ, không rõ nên kết quâ ở trạng thái nghi ngờ, và 54 mẫu cho kết quâ âm tính với FPV

Hình 4.1 Kết quả khi kiểm tra bằng Kit test nhanh (a) Dương tính với FPV; (b) Kết quả nghi ngờ; (c) Âm tính với FPV

Bảng 4.1 Kết quả phản ứng nanoPCR

Loại mẫu Số mẫu xét nghiệm Kết quả phản ứng nanoPCR

Hình 4.2 Kết quả phản ứng nanoPCR Giếng 2 - giếng 4: Mẫu test dương tính với FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 5 -giếng 7: Mẫu nghi ngờ FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 8 - giếng 10: mẫu âm tính với FPV bằng Kit test nhanh; Giếng 11: Đối chứng dương (DNA từ vacxin); Giếng 12: Đối chứng âm (free water DNA)

Kết quả trên cho thấy phương pháp nanoPCR có độ chính xác cao, ngay cả khi giám định các mẫu nghi ngờ đều cho kết quả dương tính rõ ràng với kích thước vạch band bằng 698bp trùng đúng với thiết kế của đoạn mồi

Hình 4.3 Hình ảnh mèo bị nhiễm virus FPV

Tất cả các mèo được xác định dương tính tới FPV đều được kiểm tra, theo dõi triệu chứng lâm sàng Các triệu chứng đặc trưng của mèo mắc FPV: ủ rũ, mệt mỏi, ăn ít, bỏ ăn, sốt, tiêu chảy, phân lẫn máu, nôn bọt trắng, vàng xanh, chảy nước dải, mắt nhiều ghèn, niêm mạc nhợt nhạt Mèo có thể chết đột ngột do các biến chứng vì cơ thể mất nước, mất cân bằng điện giải, hạ đường huyết, xuất huyết và nhiễm độc nội độc tố trong máu

4.2 Thảo luận

Trên toàn cầu, các đợt bùng phát và nghiên cứu về FPV đang được công bố và loại vi-rút này đã có ảnh hưởng đáng kể đến việc chăn nuôi mèo cưng và các hoạt động kinh

doanh bảo tồn mèo quý hiếm Bất chấp việc sử dụng rộng rãi các loại vắc xin có bán trên thị trường, nhiễm trùng FPV vẫn tiếp tục giết chết một số lượng lớn mèo FPV gây ra bệnh tiêu chảy ở động vật bị nhiễm bệnh và do đó một số lượng lớn các hạt vi rút phát tán trong môi trường, có thể nhanh chóng lây lan bệnh, gây gánh nặng cho các quy trình phát hiện lâm sàng hiện nay Do tỷ lệ lây nhiễm và tử vong cao của căn bệnh này, sự nguy hiểm và thiếu phương pháp điều trị hiệu quả, nên cần có một xét nghiệm nhanh chóng, nhạy cảm, đơn giản và chi phí thấp để phát hiện và phòng ngừa bệnh FPV có thể được quảng bá rộng rãi Mặc dù độ nhạy của nanoPCR thấp hơn một chút so với qPCR, nhưng với sự phát triển của khoa học vật liệu, việc sàng lọc và tối ưu hóa các vật liệu như hạt nano có thể được tiếp tục trong tương lai để nanoPCR có khả năng phát hiện tốt hơn So với các phương pháp phát hiện FPV khác, nghiên cứu này nhằm cải thiện phương pháp PCR truyền thống thông qua việc kết hợp các hạt nano vàng vào hệ thống phản ứng PCR truyền thống, dựa vào tính dẫn nhiệt tuyệt vời của các hạt vàng để phát triển phương pháp phát hiện FPV nanoPCR có độ nhạy cao và đặc hiệu Phương pháp này có ưu điểm là chi phí thấp, thao tác đơn giản, nhanh chóng, không cần dụng cụ đặc biệt và phù hợp cho việc quảng bá trên quy mô lớn