Xây dựng quy trình phát hiện đột biến gen abcd1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng

Xây dựng quy trình phát hiệnđột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắngTS.. Mục tiêu nghiên cứuXây dựng quy trình chẩn đoán gen ABCD1 gây bệnh Loạn dưỡng não chất trắng.Ứn

Xây dựng quy trình phát hiện

đột biến gen ABCD1 liên quan đến

loạn dưỡng não chất trắng

TS Triệu Tiến Sang

Bộ môn Sinh học và Di truyền Y học, Học viện Quân Y

Đặt vấn đề

▪ Triệu chứng: tê liệt hệ thần kinh, liệt chi dưới, mất thị

Gen ABCD1 và protein

- Protein ALDP: cấu tạo từ 745 axit amin.

- Cho đến tháng 11/2020, xác định được 852 đột biến không tái diễn gây bệnh (www.x-ald.nl).

Cơ chế gây bệnh

Kemp, Stephan (2014)

Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng quy trình chẩn đoán gen ABCD1 gây bệnh Loạn dưỡng não chất trắng.

Ứng dụng chẩn đoán bệnh trên mẫu tế bào phôi sinh thiết.

Đối tượng nghiên cứu

- Mẫu máu: một gia đình vợ chồng (vợ: N.T.T – 26 tuổi; chồng: V.Đ.H – 28 tuổi), bác trai bên vợ bị bệnh, bà ngoại mang gen, có tiền sử gia đình phía vợ có người mắc bệnh loạn dưỡng não chất trắng.

- Mẫu phôi thụ tinh nhân tạo: 7 mẫu (TR1 – TR7) được sinh thiết vào ngày 5, 1 mẫu (TR8) được sinh thiết vào ngày 6

● Hóa chất sử dụng để tách ADN từ mẫu máu: kit G-spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology – Hàn Quốc).

● Hóa chất sử dụng để khuếch đại toàn bộ hệ gen (WGA).

● Hóa chất cho kỹ thuật PCR: GoTaq Green Mastermix 2X (Promega – Hoa Kỳ); nước khử ion.

● Hóa chất chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR: agarose, TBE 1X, ethidium bromide, thang chuẩn ADN (100 bp – 1000 bp và 100 bp – 1500 bp) (Cleaver Scientific – Anh).

● Hệ thống trang thiết bị và máy móc đạt yêu cầu về kỹ thuật và an toàn phòng thí nghiệm tại Labo thuộc Bộ môn Sinh học và Di truyền y học, Học viện Quân y.

Hóa chất và vật liệu

Kết quả tách chiết và khuếch đại hệ

Kết quả giải trình tự exon mẫu NTT-ABCD1

Phát hiện đột biến dị hợp tử c.854G>C (p.Arg285Pro) trên

exon 1 của gen ABCD1 của mẫu NTT-ABCD1 (ADN của người

mẹ).

Kết quả thiết kế cặp mồi

Thiết kế cặp mồi nhằm khuếch đại đoạn gen mang đột biến c.854G>C.

Kết quả tối ưu phản ứng PCR

199 bp

M: thang chuẩn marker 100 bp.

Phản ứng PCR với ADN của mẫu NTT-ABCD1

199 bp

M: thang chuẩn marker 100 bp.

Vị trí khoanh tròn đỏ thể hiện đột biến thay thế G thành C, thể hiện kiểu gen dị hợp tử giống như kết quả NGS.

Kết quả ứng dụng quy trình lên mẫu tế bào phôi sinh thiết

M: Thang chuẩn marker (100 bp); (+): ADN mẫu NTT-ABCD1;TR1 – TR8: ADN của 8 mẫu tế bào phôi sinh thiết sau khuếch đại

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger với ADN tế bào phôi

TR1 Bình thường, không mang

alen đột biến

Tương tự với mẫu TR5,

TR7.

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger với ADN tế bào phôi

TR4 Bình thường, mang alen

đột biến

Tương tự với mẫu TR2, TR3,

TR8.

TR6 Bị bệnh.

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger với ADN tế bào phôi

•03 phôi (TR1, TR5, TR7) có kiểu gen đồng hợp kiểu dại → Sàng lọc bất thường NST→ Chuyển phôi.

•04 phôi (TR2, TR3, TR4, TR8) có kiểu gen dị hợp.

•01 phôi (TR6) có kiểu gen đồng hợp đột biến

Kết quả giải trình tự theo nguyên lí Sanger với ADN tế bào phôi

PHÂN TÍCH STR LIÊN KẾT

Kết quả giải trình tự thế hệ mới ứng dụng

Kết luận

• Xây dựng được quy trình phát hiện đột biến gen ABCD1 liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng.

• Ứng dụng được quy trình chẩn đoán đột biến gen liên quan đến loạn dưỡng não chất trắng trên mẫu tế bào phôi sinh thiết.

Xin chân thành cảm ơn!