Đang tải... (xem toàn văn)
Shigella gây ra bệnh lỵ trực khuẩn chiếmmột tỷ lệ đáng kể trong các bệnh đường ruột cấp tính ở trẻ em các nước đang phát triểnvà bệnh nhiễm trùng này là nguyên nhân chính dẫn đến sự tăng
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM 🙡🙡🙡 TIỂU LUẬN Mơn: Phân tích vi sinh thực phẩm ĐỊNH TÍNH SHIGELLA Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Nhóm THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ CƠNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 🙡🙡🙡 TIỂU LUẬN Mơn: Phân tích vi sinh thực phẩm ĐỊNH TÍNH SHIGELLA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 MỤC LỤC MỤC LỤC BẢNG BIỂU ii LỜI MỞ ĐẦU .1 NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ SHIGELLA .2 Đặc điểm sinh học 1.1 Sinh thái tính chất nuôi cấy 1.2 Tính chất sinh hóa 1.3 Cấu trúc kháng nguyên 1.4 Độc tố Khả chế gây bệnh 2.1 Khả gây bệnh 2.2 Cơ chế gây bệnh .4 2.3 Tác hại CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SHIGELLA Phương pháp truyền thống 1.1 Phạm vi áp dụng .5 1.2 Nguyên tắc .5 1.3 Mơi trường hóa chất 1.4 Quy trình phân tích 1.5 Dụng cụ thiết bị 1.6 Các bước tiến hành 1.7 Kết Phương pháp đại 2.1 Phương pháp PCR 2.2 Kỹ thuật LA (latex agglutination) KẾT LUẬN .11 TÀI LIỆU THAM KHẢO 12 BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC 13 CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM 14 MỤC LỤC BẢNG BIỂU Bảng Môi trường hóa chất Bảng Dụng cụ thiết bị LỜI MỞ ĐẦU Trực khuẩn lỵ Shiga đặt theo tên nhà Vi khuẩn học người Nhật Kiyoshi Shiga, người phát chúng vào năm 1897 Shigella tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn loài linh trưởng (như người khỉ đột) đặc biệt người, không gặp lồi động vật có vú khác Một bệnh truyền nhiễm lây lan cộng đồng từ người sang người, qua đường thực phẩm kể nước uống Sự xâm nhập sinh lý khơi mào cho bệnh viêm xâm nhập vi khuẩn Shigella vào biểu mô ruột kết lớp đệm Kết viêm đại tràng loét niêm mạc dẫn đến phân có máu, nhầy tiêu chảy sốt Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn chiếm tỷ lệ đáng kể bệnh đường ruột cấp tính trẻ em nước phát triển bệnh nhiễm trùng nguyên nhân dẫn đến tăng trưởng thấp còi trẻ em Shigella có nguy đáng kể du khách đến từ nước phát triển đến thăm khu vực lưu hành bệnh, đợt bùng phát thức ăn nguồn nước lẻ tẻ xảy nước phát triển Shigella cho loại vi khuẩn đứng hàng đầu gây bệnh tiêu chảy toàn giới Tính đến năm 2006, theo báo cáo Tổ chức Y tế Thế giới WHO, Shigella nguyên nhân gây khoảng 165 triệu trường hợp lỵ nặng, triệu số dẫn đến tử vong năm Ở Việt Nam, số ca nhiễm Shigella cao, hẳn bệnh gây Salmonella typhi Vibrio choleraeri Việt Nam có khoảng 39.500 ca nhiễm Shigella năm, cao vùng cao nguyên Trung Bộ, vùng bờ biển Nam Trung Bộ thấp vùng đồng sông Hồng Nghiên cứu cho thấy mưa nhiều nghèo đói nguy nhiễm Shigella Loài Shigella gây bệnh phổ biến S Flexneri S.sonnei Loại vi khuẩn liên quan chặt chẽ với Salmonella NỘI DUNG CHƯƠNG I TỔNG QUAN VỀ SHIGELLA Đặc điểm sinh học 1.1 Sinh thái tính chất ni cấy Theo khoa học Shigella xếp vào giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gramma Proteobacteria, Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, giống Shigella Castellani & Chalmers 1919 Shigella có dạng hình que dài – μm trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghim trực khuẩn gram âm, kỵ khí tùy nghi phát triển tốt điều kiện hiếu khí Trong mơi trường đặc chúng tạo thành khuẩn lạc trịn, có đường kính khoảng mm sau 24h Shigella thường bị nhầm lẫn với Salmonella trình kiểm tra vi sinh Shigella khơng sinh bào tử khơng có lơng mao, khơng di động Trên mơi trường phân lập có lactose, khuẩn lạc khơng màu 1.2 Tính chất sinh hóa Khi ni cấy có dạng cầu trực khuẩn có phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, H2S âm tính, lactose âm tính trừ S Sonei có khả lên men chậm sau từ ngày đến tuần Khả lên men monnitol, trừ S Dysenteriae Chủng Shigella lên men đường glucose, hầu hết không sinh hơi, số trường hợp sinh yếu Trên mơi trường phân lập có lactose, khuẩn lạc khơng màu 1.3 Cấu trúc kháng ngun Shigella có kháng nguyên thân O, số có kháng nguyên K khơng có kháng ngun H Giống Shigella gồm lồi: - Shigella dysenteriae (kháng huyết nhóm A), khơng lên men monnitol, có 10 typ huyết thanh, typ huyết khơng có quan hệ kháng ngun với nhóm khác khơng có quan hệ kháng ngun với Nhóm lây truyền chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Đặc biệt nhiễm serotype A (lỵ Shiga Kruse), ngồi độc tố cịn sinh ngoại độc tố mạnh, gây nên triệu chứng nhiễm độc thần kinh hay gặp trẻ em - Shigella flexneri (kháng huyết nhóm B), có khả lên men monnitol trừ vài ngoại lệ, có typ huyết thanh, typ huyết có thành phần kháng nguyên đặc hiệu typ thành phần kháng nguyên chung cho typ Nhóm lập thường xun hầu hết lồi toàn giới, chiếm 60% trường hợp nước phát triển - Shigella boydii (kháng huyết nhóm C), có khả lên men monnitol, trừ vài ngoại lệ, chia thành 15 typ huyết Được tìm thấy chủ yếu tiểu lục địa Ấn Độ Bắc Phi, nhiễm trùng chúng thường không gây hại - Shigella sonei (kháng huyết nhóm D), có khả lên men monnitol, nhóm có khả lên men lactose chậm, có typ huyết Gây 77% trường hợp nước phát triển, so với 15% trường hợp nước phát triển; nhóm phổ biến Trung Âu, đặc biệt gây bệnh tiêu chảy mùa hè thường vơ hại trẻ em Nhóm A – C có tính chất sinh lý tương tự nhau; S sonnei (nhóm D) phân biệt sở xét nghiệm sinh hóa chuyển hóa 1.4 Độc tố Các Shigella có nội độc tố số Shigella có ngoại độc tố: - Nội độc tố: nội độc tố có tính độc mạnh, cấu tạo kháng nguyên thân, loại kháng nguyên yếu Tác dụng chủ yếu gây phản ứng ruột - Ngoại độc tố: độc tố độc, mạnh độc tố trực khuẩn uốn ván, có tác dụng đặc hiệu vào hệ thần kinh Những độc tố mạnh trung hịa kháng thể đặc hiệu Khả chế gây bệnh 2.1 Khả gây bệnh Shigella tác nhân gây bệnh lỵ trực khuẩn, có người khỉ mắc bệnh Nguồn nhiễm Shigella vào thực phẩm chủ yếu từ nguyên liệu, từ nước, từ công nhân chế biến thực phẩm, tiếp xúc bề mặt sản xuất hay từ phân Các loại thực phẩm thường xuyên phân lập Shigella rau quả, xà lách, thịt băm, thủy sản Liều lượng gây ngộ độc thực phẩm Shigella thấp, mức 10g tế bào/g sản phẩm gây bệnh 2.2 Cơ chế gây bệnh Cơ chế gây bệnh Shigella phức tạp, liên quan đến tiền chất tiêu chảy gây độc ruột, độc tế bào ngoại độc tố, độc tố thần kinh Shigella nguyên gây bệnh lỵ trực trùng, viêm ruột kết qua trung gian cytokine hoại tử biểu mô ruột kết Vi khuẩn Shigella nhân lên tế bào biểu mô ruột kết, vi khuẩn chết giải phóng nội độc tố 2.3 Tác hại Gây xung huyết, xuất tiết, gây chết tế bào lây lan sang bên để lây nhiễm giết chết tế bào biểu mô lân cận gây loét, viêm chảy máu niêm mạc, viêm khớp mãn tính, thủng ruột, xuất huyết tiêu hóa, viêm lt đại tràng Nội độc tố tác động lên thần kinh giao cảm gây co thắt tăng nhu động ruột Những tác động làm bệnh nhân đau bụng quằn, buồn nhiều lần, phân có chất nhầy lẫn máu Ngoại độc tố gây viêm màng não hôn mê Tuy nhiên, vi khuẩn sinh ngoại độc tố sau xâm nhập vào niêm mạc đại tràng Bệnh lỵ trực khuẩn thường thể cấp tính Một tỷ lệ nhỏ trở thành mãn tính, bệnh nhân lại lỏng thường xuyên thải vi khuẩn theo phân Ở nước ta, đa số trường hợp bị lỵ trực khuẩn S Dysenteriae S Flexneri, có tỷ lệ nhỏ S Boydi S Sonnei Shigella phát cách nuôi cấy lượng mẫu xác định vào mơi trường lỏng khơng chọn lọc, sau chuyển vào môi trường tăng sinh chọn lọc Dịch khuẩn sau tăng sinh chọn cấy phân lập loại môi trường thạch đĩa mức độ chọn lọc khác Khuẩn lạc nghi ngờ kiểm tra thử nghiệm hóa kháng huyết CHƯƠNG II PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SHIGELLA Phương pháp truyền thống 1.1 Phạm vi áp dụng Phương pháp tham chiếu theo ISO 21567:2014 áp dụng để phát Shigella tất loại thực phẩm 1.2 Nguyên tắc Cấy lượng mẫu xác định vào môi trường chọn lọc Từ môi trường cấy phân lập lên môi trường rắn chọn lọc, sau thời gian ủ, khuẩn lạc nghi ngờ kiểm tra khẳng định thử nghiệm sinh hóa kháng huyết 1.3 Mơi trường hóa chất Bảng Mơi trường hóa chất Mơi trường hóa chất Mục đích Shigella Broth Tăng sinh chọn lọc MacConkey XLD Phân lập Hektoen Enteric Agar Nutrient Agar (NA) Phục hồi TSI Urea Thử nghiệm sinh hóa khẳng định Shigella LDC HCl NaOH 10% Chỉnh pH 1.4 Quy trình phân tích X g X ml mẫu thử + 9.Xml canh thang Shigella Chứa novobioxin 0,5 µg/ml Đồng hóa chỉnh Ph đến 7,0 cần/ủ kỵ khí 41,5°C/16 – 24h MacConkey Agar XLD agar Hektoen enteric agar ủ 37oC/20 – 24h Chọn khuẩn lạc điển hình cấy lên thạch dinh dưỡng/ủ 37°C, 20 – 24h Khẳng định sinh hóa 1.5 Dụng cụ thiết bị Bảng Dụng cụ thiết bị Dụng cụ Thiết bị Ống nghiệm Tủ cấy vô trùng Đĩa petri (∅ 100mm) Tủ ấm Cốc thủy tinh (100ml, 250ml) Nồi hấp Que trang, qua cấy vòng Máy dập mẫu (Stomacher) Đầu tip Pipetman (1000, 5000 µl) 1.6 Pipetman (1000, 5000 µl) Các bước tiến hành ❖ Bước Tăng sinh chọn lọc Cần lượng 25g mẫu rắn đong thể tích 25ml mẫu lỏng với sai số cho phép ± 5% phần thử đại diện cho vào bao PE vô trùng (hoặc bình tam giác), bổ sung 225ml mơi trường tăng sinh chọn lọc Shigella đồng mẫu máy dập mẫu (stomacher) 60 giây, ủ 37oC khoảng 18h ± 3h ❖ Bước Phân lập Dùng que cấy vòng cấy phân lập từ canh thang tăng sinh chọn lọc Shigella lên đĩa thạch chứa môi trường chọn lọc MacConkey, XLD HE Sau cấy, lật ngược dĩa cho hướng lên ủ 37oC ± 1oC khoảng 24h ± 3h Sau ủ 24h ± 3h, kiểm tra đĩa có mặt khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc khơng điển hình mà nghi ngờ Shigella - Trên môi trường XLD khuẩn lạc Shigella điển hình có màu hồng suốt, có khơng có tâm màu đen - Trên mơi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu xanh lam, có khơng có tâm đen - Trên mơi trường MacConkey khuẩn lạc Shigella điển hình có màu đỏ nhạt (mơi trường có màu đỏ cam, đục) Đánh dấu vị trí khuẩn lạc đáy đĩa ❖ Bước Phục hồi môi trường dinh dưỡng NA/TSA Đánh dấu khuẩn lạc điển hình nghi ngờ từ đĩa môi trường phân lập MacConkey, XLD HE Nếu đĩa có năm khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc nghi ngờ, lấy tất khuẩn lạc điển hình nghi ngờ cấy ria lên NA/TSA Ủ 37oC ± 1oC khoảng 24h ± 3h - Trường hợp 1: Từ đĩa thử khuẩn lạc đặc trưng, cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát Shigella mẫu - Trường hợp 2: Nếu khuẩn lạc cho kết từ thử nghiệm sinh hóa khơng phù hợp tiến hành thử bốn khuẩn lạc cịn lại đánh dấu, bốn khuẩn lạc cho kết thử nghiệm sinh hóa phù hợp kết luận phát Shigella mẫu ngược lại kết luận khơng phát Shigella mẫu ❖ Bước Khẳng định sinh hóa Từ khuẩn lạc chọn cấy ria lên NA/TSA, dùng que cấy cấy vào môi trường sau: - Môi trường thạch TSI/KIA: + Mục đích: Được sử dụng để thử nghiệm khả sử dụng nguồn carbon khác (glucose, lactose) khả sinh H2S + Cấy đâm sâu cấy vạch bề mặt thạch nghiêng Ủ đĩa tủ 37oC 24h Shigella cho phản ứng kiềm mặt nghiêng acid phần đâm sâu Không sinh không sinh H2S môi trường - Mơi trường Urea agar: + Mục đích: Phát vi sinh vật có mang enzyme urease hay khơng + Cấy ria bề mặt thạch Ủ tủ 37 oC - 1oC 24h - 3h Nếu urea bị thủy phân, có màu hồng đến hồng đậm giải phóng amoniac từ việc phân hủy urea với đổi màu chất thị pH Khi khơng có đổi màu thạch chứng tỏ phản ứng âm tính Các lồi Shigella khơng thủy phân urea - Mơi trường VP: + Mục đích: Phát vi sinh vật tạo sản phẩm trung tính q trình lên men glucose + Ủ 37oC 24h Shigella cho phản ứng âm tính với thử nghiệm VP, khơng đổi màu bề mặt môi trường Thử nghiệm VP (+) có màu đỏ bề mặt mơi trường 1.7 Kết 10 Phát (hay không phát hiện) Shigella 25g mẫu rắn 25ml mẫu lỏng Phương pháp đại 2.1 Phương pháp PCR Kary Mullis phát minh kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi polymerase) vào năm 1985, tạo nên cách mạng lớn đời sống khoa học Chỉ sau năm (1993), K Mullis trao giải Nobel hoá học nhờ phát minh Bộ công cụ dùng xét nghiệm “bộ Kít PCR” với độ nhạy cao với vi khuẩn, 25g mẫu thực phẩm có vi khuẩn cần tìm PCR phát chúng Điều đặc biệt kít khơng gọi tên loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm mà chúng phát 12 loại vi khuẩn khác như: E.coli, E coli 0157:h7, Salmonella spp, Shigella spp, nấm mốc Tùy thuộc vào loại thực phẩm số loại tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát loại thực phẩm, quy trình Kit PCR cho phép xét nghiệm gọi tên tất vi khuẩn nêu vòng 24 (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài) Chúng thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước để giúp kiểm tra xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không Kỹ thuật PCR dùng phát Shigella tiến hành cặp mồi SHIG khuếch đại cho trình tự 320bp plasmid xâm nhiễm đặc hiệu cho Shigella cặp mồi 16S khuếch đại cho trình tự có kích thước 1007bp nằm vùng bảo tồn cùa 16S rRNA diện loài vi khuẩn So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp cho hiệu xác hay chỗ, phát nhiều vi khuẩn gây bệnh tốn thời gian Riêng Shigella cho phép phát Shigella mức 10 CFU/25g mẫu sau 12→14h tăng sinh, cho kết sau 24h 2.2 Kỹ thuật LA (latex agglutination) Ngoài dựa kỹ thuật phân tích kháng thể dùng phát Shigella cịn có Kit Wellcolex, kít Bactigen dựa kiểu phân tích LA 11 Được sử dụng từ năm 1956, xét nghiệm LA phổ biến phòng thí nghiệm lâm sàng, áp dụng để phát 100 bệnh truyền nhiễm Thử nghiệm dựa ngưng kết hạt cao su với kháng thể huyết thanh.Chẩn đoán xác định Shigella từ mẫu lâm sàng 24h với độ đặc hiệu (> 98%) độ nhạy (100%), thao tác đơn giản dễ sử dụng Ví dụ: chế thử nghiệm LA: Các mẫu thực phẩm cần kiểm tra sau xử lý pha trộn với hạt cao su phủ kháng thể kháng nguyên cụ thể Nếu mẫu bị nghi ngờ có diện Shigella, hạt cao su cụm lại với (tựu lại) ❖ Sau thử nghiệm Nếu thử nghiệm âm tính, cao su cịn mịn giữ lại màu sắc ban đầu Nếu thử nghiệm dương tính, hạt cao su thay đổi màu sắc khác biệt so với hạt cao su xung quanh 12 KẾT LUẬN Do Shigella kiểm soát nghiêm ngặt thực phẩm, đòi hỏi phương pháp kiểm nghiệm phải nhạy, quy trình kiểm sốt phải chặt chẽ 13 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 8131:2009 (ISO 21567:2004) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi Phương pháp phát Shigella Spp [2] Shigella - Medical Microbiology (n.d.) NCBI Retrieved October 12, 2022, from https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8038/ [3] Shigellosis -Journal of Microbiology (n.d.) Korea Science Retrieved October 12, 2022, from https://koreascience.kr/article/JAKO200502636831192.page 14 BẢNG PHÂN CƠNG CƠNG VIỆC ST T Họ tên MSSV Cơng việc Mức độ hoàn thành Dụng cụ thiết bị Phạm Thị Xuân 2005200438 Đào Mục đích môi trường Tổng hợp chỉnh sửa Word 100% Chỉnh sửa PowerPoint Phạm vi nguyên tắc Huỳnh Tấn Lộc 2005208212 Mơi trường hóa chất 100% Quy trình phân tích Mở đầu kết luận Phan Thị Hồng 2005201194 Tổng quan Shigella Quyên 100% Phương pháp đại Các bước tiến hành Võ Nguyễn Trúc Quỳnh Kết 2005200372 Phương pháp đại 100% Chỉnh sửa PowerPoint Dương Thị Ánh Trâm 2005200259 Tổng hợp PowerPoint 15 100% CÂU HỎI TRẮC NGHIỆM Câu Chọn câu Shigella A Trực khuẩm gram âm, không sinh bào tử B Trực khuẩn gram dương, không sinh bào tử C Trực khuẩn gram âm, sinh bào tử D Trực khuẩn gram dương sinh bào tử Câu Trong chế thử nghiệm LA nghi ngờ phát Shigella? A Cao su mịn giữ lại màu sắc ban đầu B Thay đổi màu sắc so với hạt xung quanh C Cao su thay đổi màu sắc khác khơng cịn mịn D Hạt cao su cụm lại với thay đổi màu sắc khác biệt với cao su xung quanh Câu Định tính Shigella gồm bước A B C D Câu Phát biểu Shigella A Nội độc tố độc trực khuẩn uốn ván B Ngoại độc tố gây tác dụng hệ thần kinh C Cả hai độc tố độc tố yếu D Ngoại độc tố chủ yếu gây phản ứng ruột 16 Câu Trong bước phân lập định tính Shigella mơi trường XLD khuẩn lạc Shigella điển hình có màu gì? A Màu hồng suốt B Màu xanh lam C Màu tím hoa cà D Màu đen Câu Trong bước phân lập định tính Shigella mơi trường HE khuẩn lạc Shigella điển hình có màu gì? A Màu đỏ thẫm B Màu hồng cánh sen C Màu xanh lam D Màu xanh lục Câu Trong bước phân lập định tính Shigella mơi trường MacConkey khuẩn lạc Shigella điển hình có màu gì? A Màu đỏ nhạt B Màu tím hoa cà C Màu hồng D Màu nâu đen Câu Ở quy trình phân tích, đồng hố chỉnh tới pH? A pH = B pH = C pH = D pH = 17 Câu Shigella có loại kháng nguyên? A Kháng nguyên K H B Kháng nguyên O K C Kháng nguyên O H D Kháng nguyên O, K H Câu 10 Mục đích mơi trường Shigella Broth? A Tăng sinh chọn lọc B Phân lập C Phục hồi D Chỉnh pH Câu 11 Đâu phản ứng sinh hoá Shigella? A Lên men đường glucose không sinh B Không phản ứng Oxidase C Không lên men Lactose (một số lên men chậm sau ngày đến tuần), không sinh H2S D Tất Câu 12 Mức cho phép phát Shigella? A 10 CFU/25g mẫu sau 12 14h tăng sinh, cho kết 24h B 15 CFU/25g mẫu sau 12 13h tăng sinh, cho kết 24h C 10 CFU/25g mẫu sau 14 20h tăng sinh, cho kết 24h D 20 CFU/25g mẫu sau 12 14h tăng sinh, cho kết 24h 18