PHÂN LẬP CÁC CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS KURSTAKI Ở VIỆT NAM Bùi Thị Hương, Đỗ Thị Ngọc Huyền, Nguyễn Tuấn, Nguyễn Thuỳ Châu Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu hoạch Đinh Duy Kháng Phòng Vi Sinh Phân tử, Viện Công Nghệ Sinh học Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng và nông sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá học, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) được dùng rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để phân lập vi khuẩn này từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọng tìm ra những chủng B. thuringiensis có phổ gây bệnh mới và khoảng vật chủ rộng hoặc nâng cao hoạt tính các chủng B.thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìm kiếm nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật di truyền tiếp theo. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ra những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học B. thuringiensis. Việc làm giàu thêm bộ sưu tập các chủng B. thuringiensis phân lập ở Việt Nam và nguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủng tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài côn trùng quan trọng là rất cần thiết. Chúng tôi đã tiến hành phân lập, phân loại các chủng B. thuringiensis có hoạt tính diệt sâu từ nguồn tự nhiên của Việt Nam, sử dụng một số kỹ thuật sinh hoá và sinh học phân tử để xác định tính chất của các chủng B. thuringiensis var. kurstaki phân lập được. I. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: I.1. Thu thập mẫu để phân lập các chủng B. thuringiensis Tiến hành thu thập 137 mẫu gồm có 55 mẫu đất nông nghiệp, 56 mẫu lá, 26 mẫu mùn thóc từ các nguồn khác nhau của một số tỉnh có sinh thái khác nhau ở miền Bắc Việt nam. I.2. Phân lập các chủng B. thuringiensis: Cắt một phần của lá (2-3 cm 2 ) nghiền với 0,5 ml dịch nước muối. Đối với các mẫu đất và mùn thóc cân 0,5 gam trộn với 5 ml môi trường T 3 lỏng chứa 0,25 M đệm natri acetate (pH = 6,8) và lắc trong 4 giờ ở 150 vòng/phút, nhiệt độ 30 0 C. Mẫu được xử lý nhiệt ở 80 0 C trong 3 phút. Lấy 0,2 ml dịch nổi trải trên đĩa petri có môi trường T3 nuôi ở 30 0 C trong 3 ngày. Quan sát hình dạng tinh thể của các chủng B. thuringiensis phân lập bằng kính hiển vi đối pha Olympus. I.3. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu: Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park [10]: Đối tượng sâu được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính 3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồng độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối với sâu bông (Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành tương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh thể của B. thuringiensis với liều 5x10 7 bào tử/gam gạo, nuôi ở 30 0 C với độ ẩm 70-80%. I.4. Xác định tính chất 10 chủng B. thuringiensis kurstaki phân lập. Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của các chủng B. thuringiensis. Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T 3 đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100. Ly tâm trong 1 phút. Cặn được hoà tan với 30 l đệm SDS (1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong 5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30 mA theo phương pháp của Sambrook và Maniatis. I.5. Phát hiện gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR. Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim Tag-polymeraza 0,4l, MgCl 2 : 2l, ADN 2l ( nồng độ 50ng/l). Sử dụng cặp mồi TY6(5’- GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC (5’-CAAC CT CTAT TT G GTGCAGGTTC-3’) và TYIUNI (5’- ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTT CTC-3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agaroza 1%. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN: II.1. Phân lập các chủng B. thuringiensis PAGE of parasporal inclusions of the ten kurstaki isolates showed two core fragments, 130 kDa and 70 kDa, and several other minor proteins. Ten B. thuringiensis kurstaki isolates were screened for cry1Ab and cry1C genes by PCR method. Total DNA of these B. thuringiensis strains were isolated then analyzed by electrophoresis on 1% agaroza gel. The result showed that total DNA isolated was not broken, it could be used as DNA template for the PCR. Oligonucleotit primer pairs of TY6 and TY14, TYIC and TYIUNI respectively were used to amplified the specific DNA fragments of cry1Ab gene as well as of cry1C gene by PCR. The PCR conditions were: denaturation at 94 0 C for 3 min, followed by 30 amplification cycles (94 0 C, 50 sec; 60 0 C, 50 sec; 72 0 C, 1min and 20sec) and extension at 72 0 C for 8 min The content of 5l of PCR products were analyzed by electrophoresis on 1% agaroza gel. The result showed that all ten isolated B. thuringiensis var. kurstaki strains produced only one PCR product of about 236 bp. This result indicated that all of them harboured cry1Ab gene, but no cry1C gene. Interestingly, B. thuringiensis var. kurstaki 28S strain inspire of habouring cry1Ab gene but it has no insecticidal activities to Plutella xylostella and Spodoptera exiqua. We supposed that this strain contain “silent” cry1C crystal toxin gene which is carried on the genome and it was not expressed. Because of this, we are interested in screening B. thuringiensis strains at the molecular level for their gene content. Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Lê Quang Huấn.