Kỷ yếu Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2005. 1379-1382. Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp Nguyễn Đức Thành*, Nguyễn Thúy Hạnh Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CNVN Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Mở đầu Các loài cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố nhiều ở khu vực ấn Độ, Malaixia, kéo dài từ đảo Seychelle qua ấn Độ đến Philippin, tất cả gồm có 13 chi và 470 loài. ở Việt Nam họ Dầu có 6 chi và khoảng trên 40 loài. Phía Nam từ Quảng Nam trở vào có 24 loài, khu vực miền Trung từ đèo Ngang đến đèo Hải Vân có 9 loài, ở miền Bắc có 5 loài và 1 loài có ở cả 3 vùng. Ngoài việc cung cấp gỗ, các loài cây họ Dầu còn cho một số sản phẩm khác dùng trong công nghiệp sơn và dầu bóng, trong dân gian nhân dân còn dùng để xảm thuyền [2] Theo Viện Điều tra quy hoạch rừng (1995) (1), năm 1959 diện tích các loại rừng có cây họ Dầu ở Đông Nam Bộ là 1146 275 ha (Chiếm 49% diện tích toàn vùng). Đến năm 1968 giảm xuống còn 834 050 ha (Chiếm 36% diện tích khu vực), năm 1982 giảm còn 416 900 ha (bằng 18% diện tích) và năm 1992 chỉ còn 183 081 ha (8%). Rõ ràng là việc bảo tồn các loài cây họ Dầu ở nước ta đã trở nên cấp thiết hơn bao giờ hết, nó góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen cây rừng đang có nguy cơ tuyệt chủng ở nước ta. Để công tác bảo tồn đạt kết quả tốt, việc nghiên cứu mức độ đa dạng di truyền của các loài cây này là hết sức cần thiết. Những năm gần đây, sự phát triển trong sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ hữu hiệu cho phân tích di truyền, nó đánh dấu bằng sự ra đời của các kỹ thuật chỉ thị phân tử khác nhau như kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR v.v. Các chỉ thị này có vai trò quan trọng trong nghiên cứu đa dạng di truyền, sự phát sinh và xác định các loài [3]. Trong nghiên cứu phân loại phân tử và phát sinh loài, các chỉ thị ADN lục lạp (cp DNA) cũng đã được sử dụng để xác định nguồn gốc và phân biệt loài ở thực vật. Các chỉ thị ADN lục lạp có đặc điểm rất quan trọng là tính bảo thủ cao và tần số đột biến thấp hơn so với ADN nhân. Chỉ thị ADN lục lạp thường được sử dụng là các chuỗi không mã và các gen như 16S, rbcL, atpB, matK v.v. Các chỉ thị này đã được sử dụng trong các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài và phân loại của nhiều loài cây như các loài cây cam chanh, các cây họ đậu (Leguminosae), họ Hemerocallidaceae và họ Araliaceae (7, 9, 8, 10,). Đối với cây họ Dầu, việc sử dụng các chỉ thị ADN genome và lục lạp vào nghiên cứu đa dạng di truyền và phát sinh loài cũng đã được một số tác giả công bố (5, 6,). Trong bài này chúng tôi trình bày những kết quả về nghiên cứu quan hệ di truyền của 17 loài thuộc 6 chi họ Dầu ở Việt Nam dựa vào đa hình ADN genome (RAPD) và lục lạp với mục đích tìm hiểu sự đa dạng di truyền của các loài này nhằm góp phần vào việc bảo tồn nguồn gen. Nguyên liệu và phương pháp Vật liệu 17 loài cây họ Dầu sử dụng trong nghiên cứu này do Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam cung cấp bao gồm 1 loài thuộc chi Anisoptera (A. costata Korth - Vên vên), 4 loài thuộc chi Dipterocarpus (D. alatus Roxb - Dầu rái, D. dyeri Pierre - Dầu song nàng, D. grandiflorus Blco - Dầu đọt tím, D. oblusifolius Teysm - Dầu trà beng), 4 loài thuộc chi Hopea (H. cordata Vidal - Sao lá hình tim, H. ferea Laness - Săng đào, H. odorata Roxb - Sao đen, H. reticulata Tardieu - Sao mạng cà ná), 1 loài thuộc chi Parashorea (P. chinensis Wang Hsic - Chò chỉ), 3 loài thuộc chi Shorea (S. obtusa Wall - Cà chít, S. roxbughii G. Don - Sến mủ, S. siamensis Miq - Cẩm liên) và 4 loài thuộc chi Vatica (V. cinerea King - Táu mật, V. mangachapoi ssp obtusifolia - Táu duyên hải, V. odorata (Griff) Sym ssp. Odorata - Táu trắng, V. odorata (Griff) Sym ssp. brevipetiolata Phamhoang - Táu ngâu). 7 mồi RAPD được mua từ hãng Operon, Mỹ (OPB11, OPB12, OPB13, OPB14, OPB15, OPC8, OPC9) và 4 cặp mồi lục lạp: trnD-trnT, trnH-trnK, psbC- trnS, trnM- rbcL, có trình tự đã công bố (11) và được cung cấp bởi hãng IDT, Mỹ. Các enzim giới hạn bao gồm HinfI, TaqI, HaeIII mua từ hãng Promega, Mỹ. Phương pháp Tách chiết ADN genome và kỹ thuật RAPD được tiến hành theo như đã công bố (11). Kỹ thuật PCR với các mồi RAPD được thực hiện như đã công bố (3). Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp được tiến hành với các phản ứng có thể tích là 25 μl bao gồm: ADN genome (50 ng); mồi cpADN (10 ng); dNTP (2,5 mM); MgCl 2 (50 mM); enzim Taq polymerase (0,5 đơn vị) và đệm PCR. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94 oC - 4 phút; 94 oC - 1 phút; 57 oC - 1 phút; 72 oC - 2 phút, lặp lại 45 1 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72 oC - 7 phút; giữ nhiệt độ ở 4 oC [10]. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8%, quan sát dưới đèn cực tím. Phân tích số liệu Các số liệu về quan hệ di truyền được phân tích bằng chương trình NTSYS pc với việc sử dụng hệ số tương đồng di truyền Jaccard và phương pháp phân tích UPGMA. Kết quả và thảo luận Đa hình di truyền các loài cây họ Dầu dựa trên chỉ thị RAPD Với việc sử dụng 7 mồi RAPD đã nhân bản được 311 phân đoạn ADN từ 17 mẫu cây đại diện cho 17 loài thuộc 6 chi nghiên cứu (Hình 1), trong đó có 244 phân đoạn cho đa hình giữa các loài. Số phân đoạn đa hình giao động từ 20 đến 62 tương đương với 68,97 đến 83,78%. Trung bình mỗi mồi cho 34,85 phân đoạn đa hình tương đương với 14,28%. Mồi OPB11 cho nhiều băng đa hình nhất (74 băng) còn mồi OPB14 cho ít băng đa hình nhất (20 băng). Hình 1. Sản phẩm PCR của mồi OPB11(A) và OPB12 (B) với ADN genome với 17 cây họ Dầu 1-Vên vên, 2- Dầu rái, 3- Dầu song nàng, 4- Đọt tím, 5-Trà beng, 6- Sao lá hình tim, 7- Săng đào, 8- Sao đen, 9- Sao mạng, 10- Chò chỉ, 11- Cà chít, 12- Sến mủ, 13-Cẩm liên, 14- Táu mật, 15- Táu duyên hải, 16-Táu trắng, 17-Táu ngâu. Về mức độ đa hình các loài cây họ Dầu nghiên cứu bằng chỉ thị RAPD cho thấy: tất cả các loài đều cho tỷ lệ đa hình lớn hơn 68%, trong đó loài Cà chít cho tỷ lệ băng đa hình cao nhất (92,85%), và loài Săng đào cho tỷ lệ băng đa hình thấp nhất (68,42%). Những số liệu nhận được chứng tỏ các loài cây họ Dầu thuộc 6 chi nghiên cứu rất khác nhau về mặt di truyền. Đa hình di truyền các loài cây họ Dầu dựa vào các chỉ thị ADN lục lạp Để phân tích đa hình ADN lục lạp của 17 mẫu cây đại diện cho 17 loài họ Dầu, chúng tôi đã sử dụng 4 cặp mồi lục lạp trnD-trnT. trnH-trnK, psbC- trnS và trnM- rbcL. Với 4 cặp mồi này, các phân đoạn ADN lục lạp nằm giữa các gen tương ứng sẽ được nhân bản và so sánh giữa các loài cây nghiên cứu. Kết quả nhận được là mỗi mồi lục lạp đều cho một băng đặc hiệu, cụ thể là với các cặp mồi trnD-trnT, trnH-trnK, psbC- trnS và trnM- rbcL đã nhận được các phân đoạn ADN có kích thước tương ứng lần lượt là 1600 bp, 1750 bp, 1650bp, 2700 bp, đúng như các tác giả khác đã công bố (Hình 2A). Để xác định sự khác biệt về trình tự Hình 2. Sản phẩm PCR của mồi trnD-trnT với ADN genome của 17 loài cây họ Dầu A- sản phẩm chưa cắt và B - sản phẩm cắt bằng enzym HaeIII, M-Marker phân tử 1kb,1-Vên vên, 2- Dầu rái, 3- Dầu song nàng, 4- Đọt tím, 5-Trà beng, 6- Sao lá hình tim, 7- Săng đào, 8- Sao đen, 9- Sao mạng, 10- Chò chỉ, 11- Cà chít, 12- Sến mủ, 13-Cẩm liên, 14- Táu mật, 15- Táu duyên hải, 16-Táu trắng, 17-Táu ngâu. nucleotit của các phân đoạn ADN nhận được từ các mẫu cây đại diện cho 17 loài nghiên cứu, các sản phẩm PCR nhận được được cắt với ba enzim giới hạn là HinfI, TaqI và HaeIII. Kết quả là sau khi cắt với mỗi loại enzim giới hạn các sản phẩm PCR đều cho đa hình cao (Hình 2B).Tổng số băng nhận được là 344 trong đó có 234 băng đa hình (chiếm 68,02%), sản phẩm mồi trnD - trnT cắt với enzim giới hạn HaeIII cho tỷ lệ đa hình là 82%, với enzim TagI là 91,84% và với Hinf1 là 73,17%. Sản phẩm mồi trnH-trnK cắt với enzim giới hạn HinfI cho tỷ lệ đa hình 79,17%, trong khi đó sản phẩm với mồi psbC- trnS cũng được cắt với enzim giới hạn HinfI nhưng cho đa hình thấp 42,86%. Như vậy, các kết quả phân tích chỉ thị cpADN cũng cho thấy các loài cây họ Dầu được nghiên cứu rất đa dạng về di truyền. 1,6 kb 3 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 A 1,0 kb 3 kb 0,5 kb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 B 1,5 kb 3 kb 0,5 kb A M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1, 5 kb 3 kb 0,5 kb B M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 2 Quan hệ di truyền giữa các loài cây họ Dầu Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các cây họ Dầu được xây dựng dựa trên các số liệu về đa dạng chỉ thị RAPD và ADN lục lạp (Hình 3), cho thấy giữa các cây họ Dầu có sự khác biệt lớn về mặt di truyền (Hệ số tương đồng di truyền giao động từ: 0,18 đến 0,58 ). Cụ thể là loài V. mangachapoi ssp obtusifolia (Táu duyên hải) và V. odorata (Griff) Sym ssp. brevipetiolata Phamhoang (Táu ngâu) thuộc chi Vatica có quan hệ di truyền xa với các loài thuộc các chi khác. Loài A. costata Korth (Vên vên) là loài duy nhất thuộc chi Anisoptera cũng có quan hệ di truyền xa với các loài ở các chi khác. 14 loài thuộc 4 chi (Dipterocarpus, Hopea. Parashorea và Shorea) và 2 loài thuộc chi Vatica chia làm 2 nhóm có quan hệ di truyền ở mức 0,25. Nhóm thứ nhất gồm toàn bộ 4 loài của chi Dipterocarpus (D. alatus Roxb - Dầu rái, D. oblusifolius Teysm - Dầu trà beng, D. dyeri Pierre - Dầu song nàng, và D. grandiflorus Blco - Dầu đọt tím) và 2 loài thuộc chi Vatica (V. cinerea King - Táu mật và V. odorata (Griff) Sym ssp. odorata - Táu trắng). Nhóm thứ hai bao gồm 4 loài thuộc chi Hopea (H. cordata Vidal - Sao lá hình tim, H. reticulata Tardieu - Sao mạng cà ná, H. odorata Roxb - Sao đen và H. ferrea Laness - Săng đào), 3 loài thuộc chi Shorea (S. obtusa Wall - Cà chít, S. siamensis Miq - Cẩm liên, và S. roxbughii G. Don - Sến mủ) và 1 loài duy nhất của Parashorea (P. chinensis Wang Hsie - Chò chỉ). Ashton 1982, dựa và các đặc điểm hình thái, giải phẫu gỗ và hoá thạch đã phân họ Dầu (Dipterocarpaceae) thành 3 họ phụ là Pakarimoideae, Monotoideae và Dipterocarpoideae. Họ phụ Dipterocarpoideae có hai tông là Dipterocarpeae và Shoreae (4). Coefficient 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1 2 5 3 4 15 17 6 9 8 12 14 7 10 13 16 18 Vên vên Dầu rái Dầu trà beng Dầu song nàng Dầu đọt tím Táu mật Táu tráng Sao lá hình kim Sao mạng cà ná Sao đen Cà chít Cẩm liên Săng đào Chò chỉ Sến mủ Táu duyên hải Táu ngâu Hình 3. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa các cây họ Dầu được xây dựng Dựa trên số liệu đa hình chỉ thị RAPD và ADN lục lạp Tông Dipterocarpeae có 8 chi trong đó có các chi Dipterocarpus và Vatica nằm trong nhóm thứ nhất theo số liệu đa hình ADN của chúng tôi còn tông Shoreae có 5 chi trong đó có các chi Parashorea, Hopea và Shorea nằm trong nhóm thứ hai. Chỉ có hai loài thuộc chi Vatica (V. mangachapoi ssp obtusifolia - Táu duyên hải và V. odorata (Griff) Sym ssp. brevipetiolata Phamhoang - Táu ngâu) và loài duy nhất của chi Anisoptera (A. costata Korth- Vên vên) thuộc tông Dipterocarpeae lẽ ra phải nằm trong nhóm 1 nhưng lại nằm riêng và có quan hệ di truyền xa với hai nhóm chính. Như vậy, những kết quả về phân tích đa dạng di truyền của 6 chi họ Dầu dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp đã cho thấy các loài cây họ Dầu ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền. Các kết quả phân nhóm dựa vào đa hình ADN tương đối phù hợp với việc phân loại dựa vào hình thái trước đây. Kết luận Các loài cây họ Dầu được nghiên cứu có mức độ đa dạng về mặt di truyền cao, hệ số di truyền giao động từ 0,18 đến 0,58. Kết quả phân nhóm dựa vào đa hình ADN genome và lục lạp tương đối phù hợp với phân loại theo hình thái. Tài liệu tham khảo 1. Nguyễn Duy Chuyên và Ngô An, 1995. Công trình khoa học kỹ thuật điều tra quy hoạch rừng (1991-1995). Nxb Nông nghiệp, Hà Nội,1995. 2. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Đức Thành, 1999. ứng dụng và phát triển các chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215. 4. Ashton P.S, 1982. Dipterocarpaceae. Trong C.G.G.J. Van Steenis (ed). Flora Malesiana, Series1, Spermatophyta, Martinus Nijhoff Publisher. The Hague, 9: 237-552. 5. Dayanandan S., Ashton P.S., Williams S.M., Primack R.B., 1999. Phylogeny of the tropical tree family Dipterocarpaceae based on nucleotide sequences of chloroplast rbcL gene. Amer. Journal of Botany, 86: 1182-1190. 6. Lee, S. L., Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2001. Comparative genetic diversity studies of Shorea Leprosula (Dipterocarpaceae) using RAPD and Allozyme markers. Journal of Tropical Forest Science 13 (1): 202-215. 7. Nicolosi E, Deng. Z. N, Gentile .A, La Malfa. S, Continella. G, Tribulato. E., 2000. Citrus phylogeny and genetic origin of important species as investigated by molecular markers. Theor. Appl. Genet, 100: 1155-1166. 3 8. Noguchi. J, Hong D. Y , and Grant. W. F., 2004. The historical evolutionary development of Hemerocallis middendorfii (Hemerocallidaceae) revealed by non-coding regions in chloroplast DNA. Plant Syst. Evol, 247:1-22. 9. Pardo C., Cubas P., and Tahiri H., 2004. Molecular phylogeny of Genista (Legiuminosae) and related genera based on nucleotide sequences of nrDNA (ITS region) and cpDNA (trnL-trnF intergenic specer). Plant Syst. Evol, 244: 93-119. 10. Plunkett G.M., Wen J., and Lowry II P.P., 2004. Intrafamilial classifications and characters in Araliaceae: Insight from the phylogenetic analysis of nuclear (ITS) anf plastid (trnL-trnF) sequence data. Plant Syst. Evol, 245: 1-39. 11. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470. * Công trình có sự hỗ trợ của Hội đồng Khoa học tự nhiên và đề tài “Bảo tồn nguồn gen cây rừng” của viện KHLNVN. Các tác giả xin cảm ơn GS.TSKH Lê Xuân Tú đã đọc và góp ý cho bản thảo. Summary The study of genetic relationship between Vietnamese tree species of Dipterocarpaceae family using genomic and chloroplast DNA polymorphism Nguyen Duc Thanh, Nguyen Thuy Hanh Institute of Biotechnology, VAST Nguyen Hoang Nghia Forest Science Institute of Viet Nam The family of Dipterocarpaceae is distributed mainly in tropic rain forests. In Vietnam, the Dipterocarps distributed throughout from South to North. Due to the war and the increasing of economy and population after the war, the numbers of Dipterocarps was significantly decreased. To contribute to an evaluation and conservation of Vietnamese Dipterocarps genetic resources, the genome and plastome of 17 species belonging to 6 genera of Vietnamese Dipterocarps are investigated using RAPD and chloroplast DNA markers, with the aim to study the genetic diversity of the Vietnamese Dipterocarps. The results of the analyses based on RAPD and chloroplast DNA regions trnD-trnT, trnK-trnH, psbC-trnS, trnM- rbcL, indicated that the investigated species are genetically, very, divergent. In addition, the grouping based on genomic and chloroplast DNA polymorphism is mostly agreed with morphological classification. Due to high level of genetic diversity, the conservation of the species should be highly considered. 4 . kết quả về nghiên cứu quan hệ di truyền của 17 loài thuộc 6 chi họ Dầu ở Việt Nam dựa vào đa hình ADN genome (RAPD) và lục lạp với mục đích tìm hiểu sự đa dạng di truyền của các loài này nhằm. tích đa dạng di truyền của 6 chi họ Dầu dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp đã cho thấy các loài cây họ Dầu ở Việt Nam rất đa dạng về mặt di truyền. Các kết quả phân nhóm dựa vào đa hình ADN. đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2005. 1379-1382. Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt