Luận văn thạc sỹ Sinh học BỘ GIÁO DỤC VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LÊ TRỌNG TÀI NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN CAO GEN MÃ HĨA PECTINASE TRONG Bacillus subtilis NHẰM Ƣ́NG DỤNG TRONG CƠNG NGHIỆP XƢ̉ LÝ VẢI BƠNG Chun ngành: Hóa sinh thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ VĂN TRƢỜNG Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi số kết cộng tác với đồng khác Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn i Luận văn thạc sỹ Sinh học LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Văn Trường, người thầy hướng cho ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho hồn thành luận văn Tơi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Di truyền Vi sinh vật - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam (nay Trung tâm Giống Bảo tồn nguồn gen vi sinh vật) tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học luận văn Tôi xin cảm ơn tất thầy cô giáo Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam chia sẻ, động viên, giúp vượt qua khó khăn để hồn thành tốt cơng việc nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn đến gia đình bè bạn - người ln bên tơi, động viên, góp ý tạo điều kiện tốt cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Tác giả Lê Trọng Tài Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn ii Luận văn thạc sỹ Sinh học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lƣợc Bacillus subtilis 1.2 Hệ biểu Bacillus subtilis 1.3 Pectin 1.4 Pectinase 1.4.1 Khái niệm pectinase 1.4.2 Phân loại chế hoạt động pectinase 1.5 Pectinase Bacillus subtilis 10 1.6 Ứng dụng pectinase kiềm 11 1.6.1 Cấu tạo sợi tự nhiên 11 1.6.2 Ứng dụng pectinase kiềm công nghiệp xử lý vải 12 1.6.3 Ứng dụng công nghiệp sản xuất bột giấy 13 1.6.4 Ứng dụng pectinase kiềm chiết xuất dầu thực vật, chế biến cà phê trà 13 1.7 Tình Hình nghiên cứu pectinase tái tổ hợp giới Việt Nam 13 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 14 2.1 Vật liệu 14 2.1.1 Các chủng vi khuẩn 14 2.1.2 Hóa chất thí nghiệm 15 2.1.3 Các vector sử dụng 15 2.1.4 Trình tự mồi 15 2.2 Môi trƣờng nuôi cấy 16 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 17 2.3.1 Sàng lọc chủng B subtilis có hoạt tính pectinase mơi trường thạch đĩa 17 2.3.2 Thu nhận pectinase ngoại bào từ chủng B subtilis tự nhiên 17 2.3.3 Thu nhận pectinase ngoại bào từ chủng tái tổ hợp 17 2.3.4 Định lượng protein theo phương pháp Bradford [11] 17 2.3.5 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp đường khử (Bernfeld 1955)[10] 19 2.3.6 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp phát liên kết đơi 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iii Luận văn thạc sỹ Sinh học 2.3.7 Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn B subtilis 22 2.3.8 Tách chiết DNA plasmid từ E coli 23 2.3.9 Tách chiết DNA plasmid từ B subtilis 23 2.3.10 Các phương pháp thao tác sinh học phân tử 23 2.3.11 Biến nạp plasmid vào E coli phương pháp xung điện 26 2.3.12 Biến nạp pMSE3/BaP-pel vào B subtilis 168 26 2.3.13 Phương pháp điện di protein SDS-PAGE (Laemmli, 2009) 27 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1 Sàng lọc chủng B subtilis phân lập từ nƣớc có hoạt tính pectinase cao 28 3.1.1 Sàng lọc chủng B subtilis có hoạt tính pectinase đĩa thạch 28 3.1.2 Nghiên cứu khả phân cắt pectin pH kiềm dịch enzyme ngoại bào chủng nghiên cứu 29 3.1.3 Xác định hoạt tính pectinase phương pháp phát liên kết đơi 31 3.2 Tách dòng gen pectinase E coli 32 3.2.1 Tách chiết DNA tổng số chủng B subtilis 32 3.2.2 Nhân gen pectinase PCR 33 3.2.3 Tách dòng gen pel vào E coli 34 3.2.4 Giải trình tự gen pectinase 36 3.3 Tạo chủng B subtilis tái tổ hợp sản sinh pectinase 38 3.3.1 Thiết kế vector biểu gen pectinase B subtilis 38 3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis 43 3.3.3 Biểu chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase môi trường lỏng 44 3.4 So sánh tính chất enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh từ chủng tự nhiên 47 3.4.1 So sánh ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên 47 3.4.2 So sánh ảnh hưởng pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên 48 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 49 ̣ 4.1 Kết luận 49 4.2 Kiến nghị 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Tài liệu tiếng Việt 50 Tài liệu tiếng Anh 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn iv Luận văn thạc sỹ Sinh học DANH MỤC TƢ̀ VIẾT TẮT a.a : Amino acid APS : Ammonium persulfate B subtilis : Bacillus subtilis BMM : Mơi trƣờng khống chất Belisky BSA : Bovine serum albumin DEAE : Diethylethanolamine DNA : Deoxyribonucleic axit DNSA : 3,5-Dinitrosalicylic axit E coli : Escherichia coli EDTA : Ethylenediaminetetraacetic axit HTAB : Hecxadecyl trimethyl trimethyl trimethyl trimethyl ammonium bromide ISO : International standards organization kDa : Kilo Dalton LB : Luria bertani M : Mole OD : Optical density PCR : Polymerase chain reaction pel : Gen pectinase Pel : Enzyme pectinase RR : Rhuthenium red rPel : Pectinase tái tổ hợp SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : Tetramethylethylenediamine U : Unit Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn v Luận văn thạc sỹ Sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại pectinolytic enzyme Bảng 1.2 Các thành phần cấu tạo sợi 11 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng nhân gen 23 Bảng 2.2 Chƣơng trình nhân gen PCR 23 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng cắt pKTH/pUC HindIII 24 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt pJET/pel HindIII 24 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen pel với promoter 24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel 24 Bảng 3.1 Kết sàng lọc chủng B subtilis có khả phân hủy pectin đĩa thạch 28 Bảng 3.2 Hoạt tính pectinase điều kiện pH phản ứng tối ƣu chủng nghiên cứu 30 Bảng 3.3 Hoạt tính pectinase enzyme thu đƣợc 31 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vi Luận văn thạc sỹ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc hóa học đoạn pectin Hình 1.2 Thủy phân pectin pectin methylesterases Hình 1.3 Sự thủy phân polygalacturonate endo- exopolygalacturonase Hình 1.4 Sự phân cắt polygalacturonate pectinase Hình 1.5 Sự kết nối cellulose chất cellulose lớp thứ cấp sợi Pectin đƣợc tồn hai loại: pectin axit esterified pectin 11 Hình 2.1 Đồ thị đƣờng chuẩn protein 18 Hình 2.2 Sơ đồ phản ứng khử 3,5 dinitrosalicylic axit thành amino, 5-nitrosalicylic axit 19 Hình 2.3 Đƣờng chuẩn glucose 20 Hình 2.4 Sơ đồ phản ứng cắt pectin axit pectinase 21 Hình 3.1 Hình ảnh số chủng B subtilis tạo vịng thủy phân pectin đĩa thạch LB 0,2% pectin 29 Hình 3.2 Ảnh hƣởng pH đến khả phân hủy pectin pectinase từ chủng nghiên cứu 31 Hình 3.3 Điện di DNA tổng số chủng B subtilis 33 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR nhân gen pectinase 34 Hình 3.5 Khuẩn lạc thể biến nạp E coli DH5α mang pJET/pel môi trƣờng chọn lọc LB, 100 µg/ml ampicillin 34 Hình 3.6 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel HindIII 35 Hình 3.7 Điện di sản phẩm cắt pJET/pel HindIII 35 Hình 3.8 So sánh theo hàng trình tự amino acid Pel từ chủng B subtilis phân lập Việt Nam với Pel từ B subtilis 168 37 Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu pel B subtilis 39 Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC HindIII 40 Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel 40 Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel PCR 41 Hình 3.13 Nhân gen dung hợp BaP-pel PCR 42 Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel pMSE/BaP-pel 42 Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel tế bào B subtilis 168 tái tổ hợp 44 Hình 3.16 Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào chủng B subtilis tái tổ hợp đa copy môi trƣờng LB+Kan 45 Hình 3.17 Kiểm tra biểu pectinase thể biến nạp đa copy tế bào B subtilis 168 sau 24 nuôi cấy 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn vii Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.18 Kiểm tra hoạt tính pectinase thể biến nạp đa copy BSM chủng B subtilis 168 chất pectin axit 46 Hình 3.19 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme 47 Hình 3.20 Ảnh hƣởng pH tới hoạt tính enzyme 48 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn viii Luận văn thạc sỹ Sinh học MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp dệt may Việt Nam phát triển mạnh, chiếm vị trí quan trọng kinh tế quốc Nếu phát triển thực tiến độ theo Quyết định số 36/2008/QĐ-TTg Thủ tƣớng Chính phủ đến năm 2015 sản xuất nƣớc 40 ngàn tấn, đáp ứng đƣợc 10% nhu cầu đến 2020 60 ngàn đáp ứng đƣợc 12% nhu cầu xơ tiêu thụ nƣớc Để “chiến lƣợc phát triển ngành công nghiệp Dệt may Việt Nam đến năm 2015, định hƣớng đến năm 2020” thành cơng ngồi việc thúc đẩy tăng xuất diện tích trồng cần phải cải tiến công nghệ, ứng dụng cơng nghệ enzyme q trình sản xuất vải để tạo sản phẩm vải chất lƣợng cao, giá thành rẻ cạnh tranh đƣợc thị trƣờng quốc tế Sợi tự nhiên đƣợc cấu tạo bao gồm 95% cellulose 5% cellulose Vải mộc sau dệt cịn chứa nhiều chất khơng phải cellulose Trong q trình nhuộm vải, không loại chất cellulose chúng làm cản trở thuốc nhuộm thâm nhập vào vải, dẫn đến giảm chất lƣợng vải nhuộm Thông thƣờng để loại bỏ chất này, vải mộc phải qua bƣớc nấu kiềm (alkaline scouring) để tẩy loại chúng đi, công nghệ đơn giản nhƣng nảy sinh vấn đề vừa làm giảm rắn sợi tác động chất kiềm tới cấu trúc cellulose, vừa làm ô nhiễm môi trƣờng tiêu hao lớn lƣợng Để giải vấn đề này, năm gần nhà công nghệ giới sử dụng enzyme pectinase, loại enzyme pectinase kiềm để phân hủy pectin sợi bơng, thay sử dụng hóa chất kiềm độc hại Xử lý vải pectinase làm tăng khả thấm nƣớc vải bông, vải mịn trơn nhẵn hơn, mang lại hiệu cao cho trń h t ẩy trắng (bleaching) nhuộm màu (dyeing), làm cho chất lƣợng vải tốt Việc ứng dụng enzyme pectinase kiềm công nghệ xử lý vải phát triển khoảng 10 năm gần Nhƣng đƣợc nhiều nhà cơng nghệ quan tâm ích lợi to lớn chúng việc nâng cao chất lƣợng vải bơng, rút ngắn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.9 Sơ đồ thiết kế vector biểu pel B subtilis 3.3.1.2 Dung hợp promoter BaP vào gen pel Thu nhận plasmid pKHT-BaP từ plasmid lai pKTH/pUC Để biểu gen hiệu cần thiết phải lựa chọn promoter mạnh để điều khiển biểu gen Promoter BaP đƣợc biết đến promoter có khả biểu mạnh protein tế bào B subtilis nghiên cứu trƣớc [4], [5] Do phƣơng án sử dụng promoter để điều khiển biểu gen pel tế bào B subtilis đƣợc lựa chọn Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 39 Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.10 Điện di sản phẩm cắt pKTH/pUC HindIII 1: pKTH/pUC cắt HindIII, 2: DNA marker Thang DNA chuẩn đƣợc đặt bên Với mục đích thu pKTH-BaP (pKTH mang promoter BaP) plasmid pKHT/pUC đƣợc cắt với HindIII để loại bỏ pUC18 (2,7 kb), băng DNA 3,7 kb băng pKTH-BaP đƣợc thu nhận thí nghiệm (Hình 3.10) Thành phần phản ứng cắt đƣợc ghi Bảng 2.1 phần phƣơng pháp Thu nhận pel từ pJET/pel Gen pel pJET/pel tách dòng từ chủng VBS11 phần 3.2.3 đƣợc sử dụng để thiết kế vector biểu Plasmid pJET/pel sau cắt HindIII đƣợc phân tách gel 0,8% agarose Băng DNA 1,5 kb đƣợc thu nhận làm gel extraction kit (Qiagen) sau kiểm tra lại điện di agarose Kết Hình 3.11 cho thấy gen pel thu đƣợc có độ tinh cao, đủ chất lƣợng cho thí nghiệm Hình 3.11 Thu nhận pel từ pJET/pel Gen pel 1,5 kb đƣợc mũi tên Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 40 Luận văn thạc sỹ Sinh học Tạo khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen PCR Để tạo gen dung hợp BaP-pel, trƣớc hết pKTH-BaP pel đƣợc nối với T4 ligase để tạo sợi khuôn cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng nối đƣợc thực nhƣ Bảng 2.3 phần phƣơng pháp Phản ứng nối đƣợc thực 16 °C, qua đêm Sau kết thúc phản ứng, sản phẩm gắn gen đƣợc sử dụng để làm khuôn mẫu cho phản ứng nhân gen dung hợp BaP-pel Nhân gen dung hợp BaP-pel PCR Phản ứng gắn BaP với pel có hai khả xảy ra: khả thứ BaP nối với pel thuận chiều, tức promoter BaP đƣợc nối trực tiếp với đầu 5’ gen pel Khả thứ hai BaP nối với pel ngƣợc chiều, tức BaP nối trực tiếp với đầu 3’của gen pel Do mồi xuôi (mồi F) đƣợc thiết kế bám vào vị trí đầu 5’ promoter BaP mồi ngƣợc (mồi R) bám vào vị trí đầu 3’ pel (Hình 3.12) làm phản ứng PCR BaP-pel đƣợc nối thuận chiều đƣợc nhân lên Gen dung hợp BaP-pel mang promoter BaP terminator pel Primer F Sản phẩm ligationnối thuận chiều pKTH BaP Ter pel Primer R PCR XhoI XbaI BaP pel Ter Gen dung hợp nhân lên cặp mồi Hình 3.12 Sơ đồ nhân gen dung hợp BaP-pel PCR Vị trí bám mồi đƣợc mũi tên ngang Với mục đích thiết kế vector biểu đa copy, thiết kế cặp mồi nhân gen dung hợp BaP-pel để thiết kế vào pMSE3 Trình tự nucleotid Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 41 Luận văn thạc sỹ Sinh học mồi đƣợc chi tiết phần phƣơng pháp Thành phần phản ứng PCR thí nghiệm đƣợc thể Bảng 2.6 Sau thực phản ứng nhân gen cặp mồi với khuôn mẫu sản phẩm gắn gen trên, sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra điện di agarose 0,8% Kết cho thấy nhân lên đoạn gen khoảng 1,8 kb tổng chiều dài promoter BaP (0,384 kb) gen pel (1,438 kb) Điều chứng tỏ promoter BaP đƣợc nối thuận chiều với gen pel gen dung hợp BaP-pel đƣợc nhân lên PCR (Hình 3.13) M 1,8 kb Hình 3.13 Nhân gen dung hợp BaP-pel PCR 2: BaP-pel đƣợc nhân lên cặp mồi cặp mồi 2, M : DNA marker kb (EUR) Băng DNA 1,8 kb đƣợc mũi tên Thang DNA chuẩn đƣợc đặt bên 3.3.1.3 Tạo vector đa copy pMSE/BaP-pel Hình 3.14 Kiểm tra gen dung hợp BaP-pel pMSE/BaP-pel Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 42 Luận văn thạc sỹ Sinh học - 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt XhoI XbaI., M : DNA marker kb (EUR) Băng DNA 5,6 kb 1,8 kb đƣợc mũi tên Thang DNA chuẩn đƣợc đặt bên Để đƣa gen BaP-pel vào pMSE3, trƣớc hết pMSE3 BaP-pel sau nhân lên PCR mục 3.2.3 đƣợc làm kit QIAGEN từ agarose sau xử lý với XhoI XbaI trƣớc nối T4 ligase 16 ºC qua đêm Sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào DH10b phƣơng pháp xung điện Thể biến nạp đƣợc chọn lọc môi trƣờng LB thạch đĩa bổ sung 50 µg/ml kanamycin 20 µg/ml streptomycin Các thể biến nạp sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng chọn lọc đƣợc nuôi cấy môi trƣờng lỏng để tách chiết plasmid kiểm tra enzyme giới hạn Kết điện di agarose cho thấy plasmid sau cắt XhoI XbaI cho băng vector kích thƣớc khoảng 5,6 kb băng kích thƣớc 1,8 kb (Hình 3.14) Điều chứng tỏ gen BaPpel đƣợc đƣa thành công vào vector pMSE3 Plasmid pMSE3 mang gen BaPpel đƣợc đặt tên pMSE/Bap-pel 3.3.2 Nghiên cứu chuyển gen pectinase vào B subtilis 3.3.2.1 Chuẩn bị plasmid đa copy pMSE/BaP-pel Khác với biến nạp gen E coli, biến nạp gen vào B subtilis cần phải có lƣợng plasmid đủ lớn (30-50 µg), nồng độ plasmid phải đủ cao (khoảng µg/µl) biến nạp thành cơng Trong thí nghiệm này, plasmid pMSE/Ba-pel đƣợc tách từ E coli kit tách plasmid Qiagen theo hƣớng dẫn hãng Kết tách plasmid đƣợc đánh giá điện di agarose cho băng vector (5,6 kb ) băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.14) Điều chứng tỏ plasmid pMSE/BaP-pel đƣợc tách đủ chất lƣợng thí nghiệm biến nạp gen 3.3.2.2 Biến nạp gen pectinase vào B Subtilis 168 Plasmid pMSE3/BaP-pel đƣợc biến nạp vào tế bào B subtilis 168 theo phƣơng pháp tế bào tƣơng hợp tự nhiên nhƣ mô tả phần phƣơng pháp Lƣợng plasmid sử dụng để biến nạp µg tổng thể tích 15 µl Sau kết thúc biến nạp, thể biến nạp đƣợc chọn lọc môi trƣờng thạch đĩa bổ sung Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 43 Luận văn thạc sỹ Sinh học 20 µg/ml kanamycin Các thể biến nạp sinh trƣởng đƣợc môi trƣờng chọn lọc đƣợc nuôi cấy môi trƣờng LB lỏng bổ sung kananmycin để kiểm tra có mặt plasmid tế bào Các plasmid sau tách phân tích XhoI XbaI đƣợc kiểm tra điện di agarose Kết cho thấy plasmid tách từ thể biến nạp khác xuất băng vector (5,6 kb) băng gen dung hợp BaP-pel (1,8 kb) (Hình 3.15) Điều chứng tỏ plasmid pMSE3/BaP-pel đƣợc biến nạp vào B subtilis 168 Chủng tái tổ hợp đƣợc đặt tên BSM 5,6 kb 1,8 kb Hình 3.15 Kiểm tra pMSE/BaP-pel tế bào B subtilis 168 tái tổ hợp 2: pMSE/BaP-pel đƣợc cắt XhoI XbaI., : DNA marker kb Băng vector (5,6 kb) BaP-pel (1,8 kb) đƣợc mũi tên 3.3.3 Biểu chủng tái tổ hợp BSM sản sinh pectinase môi trường lỏng Để đánh giá biểu pectinase môi trƣờng lỏng chủng BSM, thể biến nạp khác đƣợc trẻ hóa mơi trƣờng LB lỏng 20 µg/ml kanamycin sau cấy chuyển sang mơi trƣờng BMM (tỉ lệ 1%) để kiểm tra biểu gen tái tổ hợp Sau 24 ni cấy lắc 200 vịng/phút, 37oC, enzyme ngoại bào đƣợc thu nhận li tâm loại bỏ sinh khối kiểm tra protein điện di SDS-PAGE nhƣ khả phân hủy chất pectin Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 44 Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.16 Điện di SDS-PAGE dịch enzyme ngoại bào chủng B subtilis tái tổ hợp đa copy môi trƣờng LB+Kan 1-4: 15 µl dịch enzyme ngoại bào thể biến nạp khác nhau, 5: dịch lên men từ chủng B subtilis 168 Kết điện di SDS-PAGE cho thấy dịch enzyme thể biến nạp đƣợc kiểm tra xuất băng protein đậm kích thƣớc 42 kDa với kích thƣớc pectinase nhƣ tính toán Mẫu đối chứng dịch enzyme từ chủng BS168 xuất băng mờ, điều chứng tỏ băng protein 42 kDa pectinase tái tổ hợp đƣợc biểu hiện, mẫu (dịch enzyme từ chủng B subtilis 168 pectinase đƣợc sinh tự nhiên nên nồng độ enzyme thấp phát đƣợc điện di protein (Hình 3.16) Kiểm tra hoạt tính pectinase mẫu với chất pectin cho thấy hoạt tính pectinase chủng đối chứng B subtilis 168 đạt 15 U/ml mẫu từ chủng tái tổ hợp đạt từ 66 - 72 U/ml (cao 4,6-4,8 lần so với chủng B subtilis 168) (Hình 3.17) Hoạt tính pectate lyase B subtilis tái tổ hợp đa copy 80.00 70.00 60.00 50.00 Hoạt tính enzym e 40.00 (U/m l) 30.00 20.00 10.00 0.00 BSM1 BSM2 BSM3 BSM4 BS168 Các thể biến nạp khác Hình 3.17 Kiểm tra biểu pectinase thể biến nạp đa copy tế bào B subtilis 168 sau 24 nuôi cấy BSM 1-5: thể biến nạp đa copy, BS168: chủng B subtilis 168 khơng đƣợc biến nạp gen Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 45 Luận văn thạc sỹ Sinh học Hoạt tính pectinase thể biến nạp đƣợc kiểm tra đĩa thạch có 0,2% chất pectin axit phƣơng pháp đục lỗ Sau nhỏ 30 µl dịch enzyme ngoại bào vào lỗ thạch, mẫu đƣợc ủ 42 ºC qua đêm sau nhuộm với ruthenium red 0,05% Kết cho thấy đƣờng kính vịng hoạt tính mẫu tái tổ hợp BSM tạo cm, lớn nhiều mẫu đối chứng B subtilis 168 khơng mang gen (1,8 cm) (Hình 3.18) Hình 3.18 Kiểm tra hoạt tính pectinase thể biến nạp đa copy BSM chủng B subtilis 168 chất pectin axit BSM: thể biến nạp đa copy, BS168: chủng B subtilis 168 không đƣợc biến nạp gen Nasser cộng (1993) biểu thành công gen pel B subtilis tế bào E coli với hệ biểu T7 promoter, nhiên sản phẩm biểu tạo protein ngun vẹn có kích thƣớc 42 kDa protein khơng ngun vẹn kích thƣớc 33 kDa [30] Khác với Nasser, kết biểu gen pel B subtilis cho băng protein 42 kDa, điều chứng tỏ gen pel đƣợc biểu tế bào B subtilis tốt E coli Liu cộng (2011) biểu thành công gen pectinase kiềm (Apel) từ B subtilis TCCC11286 tế bào B subtilis WB600, kết biểu cho băng protein 45 kDa [27] tƣơng tự nhƣ kết biểu chúng tơi Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 46 Luận văn thạc sỹ Sinh học 3.4 So sánh tính chất enzyme pectinase tái tổ hợp với enzyme pectinase sinh từ chủng tự nhiên 3.4.1 So sánh ảnh hưởng nhiệt độ tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên Để xác định nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng, dịch enzyme thu đƣợc sau lên men chủng tái tổ hợp BSM chủng tự nhiên VBS11 đƣợc ủ với 0,2% pectin đệm Tris 50 mM, 20 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2, pH 10 nhiệt độ khác Phản ứng enzyme đƣợc thực nhƣ phần phƣơng pháp Giá trị OD 530 thu đƣợc sau đo máy quang phổ đƣợc chuyển đổi sang đơn vị hoạt tính (Unit) 140 Hoạt tính enzyme (U) 120 100 80 rPel 60 VBS11 40 20 25 30 35 40 42 45 50 55 60 70 Nhiệt độ (ºC) Hình 3.19 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới hoạt tính enzyme Kết Hình 3.19 cho thấy nhiệt độ tối ƣu cho phản ứng rPel 42oC, tƣơng tự nhƣ hoạt tính tối ƣu chủng tự nhiên VBS11 Hoạt tính enzyme có xu hƣớng giảm nhanh nhiệt độ phản ứng cao nhiệt độ tối ƣu Kết giống với kết nghiên cứu trƣớc nhiệt độ tối ƣu enzyme pectinase từ B subtilis Nasser cộng [31] Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 47 Luận văn thạc sỹ Sinh học 3.4.2 So sánh ảnh hưởng pH tới hoạt tính pectinase tái tổ hợp pectinase từ chủng tự nhiên 140 Hoạt tính enzyme (U) 120 100 80 VBS11 rPel 60 40 20 7.5 8.5 9.5 10 10.5 11 Giá trị pH Hình 3.20 Ảnh hƣởng pH tới hoạt tính enzyme Tính chất xúc tác phản ứng phân cắt enzyme phụ thuộc vào pH đệm phản ứng cần thiết phải đánh giá ảnh hƣởng pH để tìm pH tối ƣu Trong thí nghiệm enzyme đƣợc thực phản ứng với 0,2% pectin đệm tris 50 mM, 10 mM NaCl, 0,2 mM CaCl2 pH khác Kết thí nghiệm cho thấy hoạt tính enzyme rPel đạt cao pH10 (Hình 3.20) pH tối ƣu rPel tƣơng tự nhƣ pH tối ƣu enzyme Pel từ chủng gốc VBS11 đƣợc trình bày phần 3.1 Điều chứng tỏ tính chất xúc tác phản ứng rPel không thay đổi so với enzyme từ chủng tự nhiên Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 48 Luận văn thạc sỹ Sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI ̣ 4.1 Kết luận Đã sàng lọc đƣợc chủng B subtilis nguồn gốc Việt Nam sinh pectinase cao Giải mã đƣợc trình tự gen gen pectinase: pel6, pel8, pel11 pel13 Độ tƣơng đồng gen phân lập với trình tự nucleotide với gen có độ tƣơng đồng cao từ 96,3, tới 99,5% Độ tƣơng đồng aa với trình tự aa Pel biết đạt 98,8 đến 99,7% Tạo đƣợc 01 chủng B subtilis BSM tái tổ hợp đa copy sinh pectinase sản lƣợng cao Nhiệt độ pH tối ƣu enzyme tái tổ hợp rPel 42 oC, pH 10 4.2 Kiến nghị Với kết nghiên cứu bƣớc đầu đề tài đạt đƣợc, đề tài cần tiếp tục đƣợc nghiên cứu: Nghiên cứu xử lý vải thô rPel để loại pectin Nghiên cứu tối ƣu điều kiện lên men chủng sinh pectinase tái tổ hợp qui mô pilot Nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ xử lý sinh học (Bioscouring) thay xút khâu nấu kiềm (alkaline scouring) Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 49 Luận văn thạc sỹ Sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Dƣơng Văn Tuân, Lê Thị Hoàng Linh 2012 'Nghiên cứu sử dụng hệ enzyme pectinase, cellulase vi khuẩn B.subtilis, P.lantarum nấm mốc A.niger, Ph.chrysosporium để xử lý lớp nhớt vỏ cà phê' Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ Đại học Đà Nẵng năm 2012 Huỳnh Ngọc Oanh, Trần Ngọc Hùng 2008 'Thu nhận enzyme pectinase từ Asp.niger - tinh phƣơng pháp lọc gel lọc màng' Science & Technology Development, Vol 11, No.08 - 2008 Nguyễn Nhật Minh Phƣơng , Chế Văn Hoàng , Lý Nguyễn Bình Châu Trần Diễm Ái 2011 'Tác động enzyme pectinase đến chất lƣợng rƣợu vang xoài sau thời gian lên men chính' Tạp chí Khoa học 2011:20a 127-136 Trƣờng, L V., Thomas, S (2010) 'Biểu cao gen mã hóa xylanase Bacillus subtilis sử dụng promoter alpha-amylase từ Bacillus amyloliquefaciens', Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 8(3A), pp 827- 832 Trƣờng, L V., Việt, H., Hải, T.N (1998) 'Tách dòng biểu cao gen alphaamylase từ Bacillus amyloliquefaciens Bacillus subtilis', Tạp chí Khoa học Công nghệ, 36 (2), pp 12-18 Tài liệu tiếng Anh Albersheim, P and Killias, U (1962) 'Studies relating to the purification and properties of pectin transeliminase', Arch Biochem Biophys, 97, pp 107-15 Angayarkanni, J., Palaniswamy, M., Murugesan, S and Swaminathan, K (2002) 'Improvement of tea leaves fermentation with Aspergillus spp pectinase', J Biosci Bioeng, 94(4), pp 299-303 Anis, P a E., H A (2002) 'Comparison of alkaline scouring of cotton vs alkaline pectinase preparation', AATCC Review, 2(12), pp 22-28 Batra, S K (1985) in Lewin, M., and Pearce, E.M (ed.) Handbook of Fiber Science and Technology, pp 727-807 10 Bernfeld, P (1955) 'Amylases a and b In: Colowick SP, Kaplan NO (eds) ', Methods in enzymeology New York, pp 149-155 11 Bradford, M M (1976) 'A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding', Anal Biochem, 72, pp 248-54 12 Buchert, J., and Pere J., (2000) 'Scouring of cotton with pectinases, proteases and lipases', Textile Chemist and Colorist & American Dyestuff Reporter, 31(5), pp 48-52 13 Burkholder, P R and Giles, N H., Jr (1947) 'Induced biochemical mutations in Bacillus subtilis', Am J Bot, 34(6), pp 345-8 14 Cavaco-Paulo, A., Gübitz, G M (2003) 'Textile processing with enzyme ', Cambridge: Woodhead Publishing, pp 17–18, 30–34, 51–52, 90–95, 110, 124–125, 129–131, 158–169 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 50 Luận văn thạc sỹ Sinh học 15 Etters, J N., Husain, P A, N.K Lange (1999) 'Alkaline pectinase: an ecofriendly approach to cotton preparation', Textile Asia, pp 83-86 16 Finkelman, M J., J E Zajic (1978) 'Developments in Industrial', Microbiology, pp 459 17 Fu, L L., Xu, Z.R., Li, W., Shuai, J B., Lu, P., Hu, C X (2007) 'Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: imrpelication for optimization of heterologous protein secretion.', Biotechnol Adv, 25, pp 1-12 18 Guo, W., González-Candelas, L., Kolattukudy, P.E (1995) 'Cloning of a novel constitutively expressed pectinase gene pelB from Fusarium solani f sp pisi (Nectria haematococca, mating type VI) and characterization of the gene product expressed in Pichia pastoris', J Bacteriol, 177(24), pp 7070-7 19 Hartzell, M M., Hsieh, Y L (1998) 'Enzymeatic scouring to improve cotton fabric wettability', Text Res J., 68(4), pp 233-41 20 Kashyap, D R., Vohra, P.K., Chopra, S., Tewari, R (2001) 'Applications of pectinases in the commercial sector: a review', Bioresource Technology, 77, pp 215227 21 Keen, N T and S., T (1986) 'Structure of two pectinase genes from Erwinia chrysanthemi EC1 and their high-level expression in Escherichia coli', J Bacteriol 22 Klug-Santner, B G., Schnitzhofer, W., Vrsanská, M., Weber, J., Agrawal, P.B., Nierstrasz, V.A., Guebitz, G.M (2006) 'Purification and characterization of a new bioscouring pectinase from Bacillus pumilus BK2', J Biotechnol, 121, pp 390-401 23 Kunst, F., et al (1997) 'The complete genome sequence of the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis', Nature, 390, pp 249-256 24 Lei, S P., Lin, H.C., Heffernan, L., Wilcox, G (1985) 'Cloning of the pectinase genes from Erwinia carotovora and their expression in Escherichia coli', Gene, 35(1-2), pp 63-70 25 Laemmli U., K 2009 “Clevage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4” Nature 227 (5259): 680-685 26 Li, Y a H., I R (1998) 'Enzymatic Scouring of Cotton - Surfactants, Agitation, and Selection of Enzymes', Text Chem Col., 30(9), pp 23-9 27 Liu, Y., Chen, G., Wang, J., Hao, Y., Li, M., Li, Y., Hu, B., Lu, F (2012) 'Efficient expression of an alkaline pectinase gene from Bacillus subtilis and the characterization of the recombinant protein', Biotechnol Lett., 34(1), pp 109-15 28 Macmillian, J D., et al (1966) Methods in enzymeology, pp 632 29 Morozova, V.V., Semenova, M.V., Salanovich, T.N., Okunev, O.N., Koshelev, A.V., Bubnova, T.V., Krichevskiĭ, G.E., Timatkov, A.G., Barysheva, N.V., Sinitsyn, A.P (2006) 'Application of neutral-alkaline pectinase to cotton fabric boil off', Appl Biochem Microbiol, 42, pp 603-8 30 Nasser, W., Awadé, A.C., Reverchon, S., Robert-Baudouy, J (1993) 'Pectinase from Bacillus subtilis: molecular characterization of the gene, and properties of the cloned enzyme', FEBS Lett, 335(3), pp 319-26 31 Nasser, W., Chalet, F., Robert-Baudouy J (1990) 'Purification and characterization of extracellular pectinase from Bacillus subtilis', Biochimie, 72, pp 689-695 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 51 Luận văn thạc sỹ Sinh học 32 Pickersgill, R., Jenkins, J., Harris, G., Nasser, W., Robert-Baudouy, J (1994) 'The structure of Bacillus subtilis pectinase in complex with calcium', Nature, 1(10), pp 717 – 723 33 Reid, I., Ricard, M (2000) 'Pectinase in papermaking: solving retention problems in mechanical pulps bleached with hydrogen peroxide', Enzyme Microb Technol, 26, pp 115-23 34 Reid, I., Ricard, M (2004) 'Purified pectinase lowers cationic demand in peroxidebleached mechanical pulp', Enzyme Microb Technol, 34, pp 499-504 35 Ricca, E., Adriano, O., Henriques and Simon M Cutting (2004) 'Bacterial Spore Formers: Probiotics and Emerging Applications', Horizon Bioscience Press 36 Schaechter, M., Ingraham, J.L., Neidhardt, F.C (2007) 'The road from The Microbial world to Microbe', Int Microbiol, 10(3), pp 153-6 37 Schallmey, M., Singh, A., and Ward, O P (2004) 'Developments in the use of Bacillus species for industrial production', Can J Microbiol, 50, pp 1-17 38 Schols, H A., M A Posthumus, Voragen, A.G.J (1990) 'Structural features of hairy region of pectin isolated from apple juice producted by the liquefation process', Carbohydrate Research, 206(1), pp 117-129 39 Seagull, R W., Oliveri, V., Murphy, K., Binder, A., and Kothari, S (2000) 'Cotton fiber growth and development Changes in cell diameter and wall birefringence ', J Cotton Sci 4, pp 97-104 40 Searle-van Leeuwen, M J F., Vincken, J.P., Schipper, D., Voragen, A.G.J., Beldman, G., Voragen, J.V.a.A.G.J (1996) 'Acetyl esterases of Aspergillus niger: purification and mode of action on pectins', Prog Biotechnol., pp 793–798 41 Shevchik, V E., J Robert-Baudouy, Hugouvieux-Cotte-Pattat N (1997) 'Pectinase PelI of Erwinia chrysanthemi 3937 belongs to a new family', J Bacteriol 179, pp 7321-7330 42 Somogyi, M (1952) Journal of Biological Chemistry, 195, pp 19 43 Sonenshein A.L., H J., Richard Losick (2002) 'Bacillus subtilis and its closest Relatives: From Genes to Cells', ASM Press 44 Soriano, M., Diaz, P., Pastor, F.I.J (2006) 'Pectinolytic systems of two aerobic sporogenous bacterial strains with high activity on pectin', Curr Microbiol, 50, pp 114-8 45 Traore, M K., Buschle-Diller, G (2000) 'Environmentally Friendly Scouring Processes', TCC&ADR, 32(12), pp 40-43 46 Truong, L V., Tuyen, H., Helmke, E., Binh, L.T., Schweder, T (2001) 'Cloning of two pectinase genes from the marine Antarctic bacterium Pseudoalteromonas haloplanktis strain ANT/505 and characterization of the enzymes', Extremophiles, 5(1), pp 35-44 47 Vigneswaran, M A., N Anbumani (2012) 'Neural Network Approach for Optimizing the Bioscouring Performance of Organic Cotton Fabric through Aerodynamic System', Journal of Textile and Apparel technology and Management, 7(3 ) 48 Waddell, R B (2002) 'Bioscouring of cotton: commercial applications of alkaline stable pectinase', AATCC Review 2, pp 28-30 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 52 Luận văn thạc sỹ Sinh học 49 Wang, L F., and Doi, R.H (1989) 'Heterologous gene expression in Bacillus subtilis', in Butterworth-Heinemann, R.H.D.a.M.M (ed.) Biology of bacilli: applications to industry Boston: Mass, pp 63–104 50 Whitaker, J R (1990) 'Microbial pectolytic enzymes', in William, M.F.a.G., T Kelly (ed.) Microbial enzymes and biotechnology ed 51 Wipat, A., Harwood, C R (1999) 'The Bacillus subtilis genome sequence: the molecular blueprint of a soil bacterium', FEMS Microbiology Ecology 28 (1 ), pp 1-9 52 Zhang, C., Yao, J., Zhou, C., Mao, L., Zhang, G., Ma, Y (2013) 'The alkaline pectinase PEL168 of Bacillus subtilis heterologously expressed in Pichia pastoris is more stable and efficient for degumming ramie fiber', BMC Biotechnology Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 53