VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN HÀ XUYÊN Th N ye gu Nghiên cứu sản xuấ t, tinh sa ̣ch Pfu DNA polymerase n tái tổ hơ ̣p từ Escherichia coli ity rs ve ni U Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Tác giả Nguyễn Hà Xun Th n ye gu N ity rs ve ni U Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ii LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc chân thành tới TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy hướng dẫn, định hướng giúp đỡ thực thành công luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo trường Đại học Thái Nguyên thầy cô thuộc Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, thầy cô Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam tận tình giảng dạy truyền thụ cho kiến thức chuyên môn để thực luận văn Th Tôi xin chân thành cảm ơn cô chị, bạn đồng nghiệp em sinh viên phòng Kỹ thuật Gen nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ tơi qua trình làm gu N việc phịng thí nghiệm Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ người sinh thành, nuôi dưỡng ye chỗ dựa tinh thần vững cho suốt thời gian qua Cuối xin gửi lời cảm ơn n ve ni Một lần vô cảm ơn U tới anh chị, bạn bè cổ vũ động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2015 ity rs Học viên Nguyễn Hà Xuyên CÁC CHỮ VIẾT TẮT Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật iii Tên viết tắt Tên đầy đủ a.a Amino acid APS Amonium persulphate Bp Base pair CBB Coomassie brilliant blue DNA Pol Deoxyribonucleic acid Polymerase Dntp Deoxynucleoside triphosphate E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium bromide Ethanol IPTG Th EtOH Isopropyl-thio-β-D-galactoside N Kilo base KDa Kilo Dalton KLPT Khối lượng phân tử LB Luria – Bertani OD Mật độ quang học (optical density) PCR Polymerase chain reaction PLysS plasmid plysS mã hóa cho T7 lysozyme PMSF Phenyl methyl sulphonyl fluoride RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ssDNA Sợi đơn DNA (single stranded DNA) TAE Tris-acetate-EDTA TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine n ye gu Kb ity rs ve ni U MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật iv LỜI CẢM ƠN iii CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN vi DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN vii MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan DNA polymerase 1.1.1 DNA polymerase sinh vật nhân sơ sinh vật nhân chuẩn 1.1.2 Tổng quan DNA polymerase bền nhiệt 1.2 Tổng quan Pfu DNA polymerase Cấu trúc Pfu DNA polymerase 1.2.2 Cơ chế hoạt động sửa sai Pfu DNA polymerase 1.2.3 Một số tính chất Pfu DNA polymerase 10 1.2.4 Ứng dụng Pfu DNA polymerase 13 1.2.5 Tình hình nghiên cứu Pfu DNA polymerase tái tổ hợp 15 Th 1.2.1 gu N Vật liệu, hóa chất, thiết bị 18 n 2.1 ye PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 Vật liệu 18 2.1.2 Hóa chất thiết bị 20 ni Phương pháp 21 ve 2.2 U 2.1.1 Tách chiết plasmid 21 2.2.2 Nhân đoạn gen mã hóa cho Pfu DNA pol phản ứng PCR 21 2.2.3 Điện di DNA gel agarose 23 2.2.4 Tinh kit Wizard SV Gel 23 2.2.5 Ghép nối gen 23 2.2.6 Biến nạp plasmid vào E coli phương pháp sốc nhiệt 24 2.2.7 Xác định trình tự DNA 25 2.2.8 Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho Pfu DNA pol 26 2.2.9 Biểu gen mã hóa cho Pfu DNA pol 26 2.2.10 Phân tích protein kỹ thuật điện di SDS-PAGE 26 2.2.11 Sắc ký lực qua cột amylose 27 2.2.12 Tinh protein đuôi Histag Ni-charged Magbeads 28 2.2.13 Kiểm tra hoạt độ tổng hợp DNA Pfu DNA pol tái tổ hợp 28 ity rs 2.2.1 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật v PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Xác định trình tự gen mã hóa cho Pfu DNA pol từ tế bào mang vector pET 11a 29 3.2 Thiết kế vector biểu gen mã hóa cho Pfu DNA pol 36 3.3 Xây dựng quy trình tạo vector biểu 38 3.4 Lựa chọn chủng biểu gen mã hóa cho Pfu DNA pol 42 3.5 Tinh protein Pfu DNA pol tái tổ hợp 44 3.6 Thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp 47 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49 PHỤ LỤC……………………………………………………………………………………………… 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………………………………………… 55 Th n ye gu N ity rs ve ni U DANH MỤC CÁC BẢNG SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Bảng Tiêu đề Bảng 1.1 So sánh độ xác DNA polymerase bền nhiệt 11 Trang PCR Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật vi Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi sử dụng luận văn Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hóa Pfu DNA pol 22 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối ghép 24 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật 25 Bảng 2.5 Thành phần dung dịch đệm SDS-PAGE 27 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp 29 19 Th n ye gu N ity rs ve ni U DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN Hình Tiêu đề Trang Hình1.1 Cấu trúc tổng thể Pfu DNA polymerase Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật vii Hình 1.2 So sánh trình tự acid amin cấu trúc motif β –hairpin (vùng exonulcease) motif Y-GG/A (vùng ngón tay cái) Hình 1.3 Cơ chế hoạt động sửa sai Pfu DNA polymerase 11 Hình 3.1 Kết điện di kiểm tra DNA plasmid mang đoạn gen Pfu 32 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt đoạn gen mã hóa 31 cho Pfu DNA pol vector pET11a gel agarose 1% Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen mã hóa Pfu 32 DNA pol cặp mồi T7- F/ Pfu - R1 Pfu – F1/ T7- R Hình 3.4 Kết giải trình tự đoạn gen mã hóa Pfu DNA pol từ vector pET11a tái 36 tổ hợp Th Sơ đồ thiết kế vector biểu gen mã hóa Pfu DNA pol Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm cắt Pfu vector pMAL - c5X enzyme 38 Hình 3.5 39 N giới hạn gel agarose 1% gu Hình 3.7 Kết PCR sàng lọc tách chiết plasmid dòng khuẩn lạc mang 41 ye plasmid pMAL c5X –Pfu điện di gel agarose 1% n Kết biểu protein Pfu DNA pol tế bào E coli BL21(DE3) 43 U Hình 3.8 Hình 3.9 ve ni E coli BL21(DE3) pLysS điện di gel polyacrylamide 8% Kết tinh protein MBP – Pfu xử lý nhiệt điện di gel ity rs polyacrylamide 8% 45 Hình 3.10 Kết tinh Pfu DNA pol tái tổ hợp điện di gel polycrylamide 46 Hình 3.11 Kết điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp 47 gel agarose 1% Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật viii MỞ ĐẦU Hiện PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm nhân đoạn DNA ống nghiệm lên hàng triệu Kỹ thuật có ứng dụng nhiều nghiên cứu sinh học y học phục vụ nhiều mục đích khác như: chẩn đốn bệnh di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách dịng gen xác định huyết thống… Do tính chất lặp lại nhiều chu kỳ phản ứng nhiệt độ khác nhau, đặc biệt biến tính DNA 95oC nên PCR địi hỏi phải có enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác trình nhân DNA thực dễ dàng đặc hiệu Pfu DNA polymerase tách từ vi khuẩn cổ siêu ưa nhiệt Pyrococcus furiosus sinh Th trưởng tối ưu 100°C Pfu DNA polymerase bền nhiệt, giữ 95% hoạt độ ban đầu 95°C Ngồi hoạt tính tổng hợp mạch Pfu DNA polymerase gu N cịn có hoạt tính đọc sửa 3’- 5’ exonuclease làm tăng độ xác trình tổng hợp DNA Hiện Pfu DNA polymerase thương mại có xác suất gắn sai nucleotide ye khoảng 1,3.10-6 Độ xác q trình tổng hợp DNA Pfu DNA polymerase cao n U nhiều so với Taq DNA polymerase xem số enzyme có tốc độ ni tổng hợp lỗi tất DNA polymerase bền nhiệt nghiên cứu Chính ve vậy, Pfu DNA polymerase sử dụng phổ biến để khuyếch đại sản phẩm dùng [25] ity rs cho mục đích nhân dòng, biểu hay nghiên cứu đột biến tổng hợp gen Pfu DNA polymerase đóng vai trò quan trọng phản ứng PCR nên việc thu nhận enzyme từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành nhu cầu cấp thiết Tuy vậy, việc thu nhận chế phẩm enzyme trực tiếp từ vi khuẩn ưa nhiệt khơng đơn giản vi khuẩn thường yêu cầu môi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao enzyme quan tâm sản xuất lượng thấp Trên giới có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu tinh Pfu DNA polymerase tái tổ hợp gặp khó khăn sử dụng biện pháp tinh chưa tối ưu Heparin có giá thành đắt [22], cột P11 phosphocellulose cột mono Q qui trình sử dụng phức tạp [12]… Ở Việt Nam có cơng trình nghiên cứu sản xuất Pfu DNA pol từ E coli Giáo sư Phan Tuấn Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Nghĩa thực vào năm 2005 với qui trình tinh qua sắc ký lực với Ni2+ Heparin Sepharose [1, 2] Tuy nhiên Pfu DNA pol tạo lại dạng dung hợp với 20 a.a vector nên ảnh hưởng đến khả kéo dài DNA phản ứng PCR qui tình tinh Heparin tốn mà lại không đặc hiệu Trước nhược điểm khó khăn việc tinh để thu Pfu DNA pol tinh khiết, có nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả hòa tan protein tái tổ hợp tế bào E coli, khả tinh cao sử dụng hệ biểu tạo hexahistidine-tagged maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu pMAL [5, 39] PMAL hệ vector biểu cho phép protein tạo trạng thái tan dung hợp với maltose - binding proein (MBP) Ngoài khả tạo dạng tan protein, MBP có Th lực với amylose nên dễ dàng tinh protein dung hợp qua viêc sử dụng cột amylose Điểm cắt Factor Xa trước Pfu DNA pol giúp hoàn nguyên Pfu DNA N pol Bên cạnh việc sử dụng Histag để tinh Ni2+ đầu N lại khơng ảnh hưởng gu đến hoạt tính Pfu DNA tái tổ hợp [15] Với ưu điểm trên, sử dụng hệ ye n vector biểu pMAL kết hợp đuôi His để thực đề tài: “Nghiên cứu sản xuấ t, tinh U sa ̣ch Pfu DNA polymerase tái tổ hơ ̣p từ Escherichia coli’’ với mục tiêu sản xuất Pfu sinh học phân tử nước ity rs ve ni DNA polymerase chất lượng cao góp phần tích cực việc phục vụ nghiên cứu PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan DNA polymerase Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Th Hình 3.9: Kết tinh protein MBP – Pfu xử lý nhiệt điện di gel N polyacrylamide 8% gu Trong đó: ĐC 1, 2, 3, 4: dịch chiết tế bào sau xử lý 75 ºC 60, 30, 20, 10 phút; ye ĐC 5: dịch chiết tế bào biểu sau cảm ứng; ĐC 6: dịch chiết tế bào biểu n trước cảm ứng; ĐC 7: dịch chiết tế bào E.coli BL21 (DE3) pLysS không mang ni U vector tái tổ hợp; ĐC M: GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder ve Kết điện di Hình 3.9 cho thấy xử lý nhiệt dịch chiết 10, 20, 30, 60 phút rs tương ứng với ĐC 4, 3, 2, không thấy xuất băng protein dung hợp có kích ity thước 135 kDa Trong nghiên cứu Pfu DNA tác giả trước xử lý nhiệt 75 ºC băng protein Pfu DNA pol khơng bị [1] Có thể giải thích rằng, protein Pfu DNA pol dung hợp có gắn thêm đoạn MBP đầu N, MBP làm khả bền nhiệt Pfu DNA po bị kết tủa protein không bền nhiệt khác tế bào E coli Qua khẳng định protein Pfu DNA pol dung hợp có gắn thêm đầu MBP khơng bền với nhiệt phương pháp xử lý nhiệt dịch phá tế bào để tinh Pfu DNA pol không tối ưu Tuy nhiên lựa chọn vector pMAL - c5X để biểu hiện, protein tái tổ hợp tạo gắn thêm đoạn protein bám maltose đầu N, dựa vào đặc điểm để tinh Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 45 protein sắc ký qua cột amylose ghi mục 2.2.11 Sản phẩm sau qua cột amylose điện di gel polyacrylamide 10% thể Hình 3.10, ĐC 2, Th polycrylamide ye gu N Hình 3.10: Kết tinh Pfu DNA pol tái tổ hợp điện di gel Trong đó: ĐC 1: dịch chiết tế bào trước tinh sạch; ĐC 2: dịch loại qua cột n U amylose; ĐC 3: Pfu DNA pol dung hợp sau tinh cột amylose; ĐC 4: dịch sau ni đổi đệm Pfu DNA pol dung hợp cột amicon, ĐC 5: Pfu DNA pol dung hợp sau ve cắt Factor Xa (trước tinh bi từ gắn Ni2+); ĐC 6: dịch loại sau ity rs gắn tinh bi từ; ĐC 7, 8: Pfu DNA pol sau tinh bi từ gắn Ni2+ (rửa giải lần lần 2); ĐC M: GangNam-STAIN™ Prestained Protein Ladder Kết tinh Hình 3.10 cho thấy, ĐC 3, sản phẩm sau tinh sắc ký qua cột amylose thu Pfu DNA pol tái tổ hợp dạng dung hợp với kích thước 135 kDa nhiều băng phụ có kích thước nhỏ Những băng phụ MBP bám không đặc hiệu protein dung hợp tạo chưa hoàn chỉnh chứa đầu N có MBP Bên cạnh dịch loại qua cột chứa băng protein tái tổ hợp Từ khẳng định khả bám amylose với MBP không cao, không đặc hiệu hiệu suất tinh qua cột amylose thấp làm lượng lớn protein đích qua cột Tuy thu lượng nhiễm tạp dịch sau tinh chứa Pfu DNA pol MBP - Pfu có điểm cắt Factor Xa, Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 46 chúng tơi tiến hành hồn ngun Pfu DNA pol cách xử lý dịch sau tinh với Factor Xa theo tỉ lệ Factor Xa : 100 Pfu DNA pol dung hợp (w:w) Dịch sau cắt điện di SDS PAGE kiểm tra thể ĐC Hình 3.10 cho thấy băng protein 135 kDa bị thay vào có băng xuất với kích thước khoảng 92 42.5 kDa tương ứng với kích thước Pfu DNA pol MBP Ngồi cịn có băng có kích thước gần 75 kDa xuất hiện, băng có dịch sau cắt mà cịn sau tinh dịch sau cắt bi từ có gắn Ni 2+ Điều giải thích protein tái tổ hợp tạo có mảnh khơng hồn chỉnh bị đoạn nhỏ đầu C nên tinh MBP hay bi từ có gắn Ni2+, mảnh có khả bám tốt MBP đuôi His nằm đầu N Th siêu âm trình tinh làm đứt gãy protein Những suy luận hoàn toàn hợp lý ĐC số dịch sau tinh MBP có băng nằm N vạch 100 135 kDa, dịch sau cắt xuất băng gần 75 45 kDa Theo dự đốn gu băng 75 kDa phần Pfu DNA pol nên khơng ảnh hưởng ye đến phản ứng PCR, chúng tơi tiến hành thử hoạt tính Pfu DNA pol sau tinh n 3.6 Thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp ve ni U hoàn nguyên Pfu DNA polymerase có khả kéo dài chuỗi DNA từ đầu 3’OH tự rs mồi để đánh giá hoạt độ tổng hợp DNA Pfu DNA pol tái tổ hợp,chúng ity tiến hành kiểm tra khả tổng hợp Pfu DNA pol với đoạn gen có kích thước 234 bp 2.5 kb theo phương pháp ghi mục 2.2.13 Kết phản ứng PCR điện di gel agarose % thể Hình 3.11 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 47 Hình 3.11: Kết điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol tái tổ hợp Th gel agarose 1% A Kết điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol với đoạn gen 234 bp N gu gel agarose 1% Trong đó: ĐC1: mẫu âm tính PCR chạy Pfu DNA pol; ĐC 2, ye 3, 4, 5: sản phẩm PCR mẫu dương tính chạy Pfu DNA pol độ pha loãng 1, 3, n 10, 100 lần; ĐC 6: mẫu âm tính PCR chạy Taq DNA pol thương mại; ĐC 7: mẫu U dương tính PCR chạy Taq DNA pol thương mại; ĐC M: marker DNA S plus ve ni B Kết điện di sản phẩm PCR thử hoạt tính Pfu DNA pol với đoạn gen 2.5 kb gel agarose 1% Trong đó: ĐC1, 2: sản phẩm PCR mẫu dương tính chạy Pfu rs ity DNA pol độ pha loãng 10; ĐC M: marker DNA S plus; ĐC 3: mẫu âm tính PCR chạy Taq DNA pol thương mại; ĐC 4: sản phẩm PCR mẫu dương tính chạy Taq DNA pol thương mại Sau tinh hoàn nguyên Pfu DNA pol tái tổ hợp, chúng tơi tiến hành pha lỗng Pfu DNA pol 3, 10 100 lần để chạy phản ứng PCR cặp mồi LmA/B với kích thước đoạn gen tạo 234 bp Kết điện di Hình 3.11 A cho thấy, ĐC số tương ứng với Pfu DNA pol khơng pha lỗng cho sản phẩm có kích thước 234 bp sáng rõ lại có băng phụ Trong ĐC 3, tương ứng với Pfu DNA pol pha loãng 10 lần cho kết tương đương so với enzyme Taq DNA pol thương mại chạy điều kiện (ĐC số 7) Tuy pha lỗng đến 100 lần khơng có băng phát gel Từ kết khẳng định Pfu Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 48 DNA pol tái tổ hợp tạo có hoạt tính tối ưu sử dụng µl enzyme nồng độ pha lỗng đến 10 lần cho phản ứng 25 µl Khả kéo dài tốc độ kéo dài Pfu DNA pol tái tổ hợp thông số quan trọng phản ứng PCR Để đánh giá khả kéo dài, phản ứng PCR với cặp mồi pMAL F/R khuếch đại đoạn 2,5 kb theo thành phần chương trình nhiệt ghi mục 2.2.13 thực Kết phản ứng thể Hình 3.11B, ĐC số sản phẩm PCR dùng Pfu DNA pol không pha loãng pha loãng lần cho sản phẩm mong muốn đoạn 2,5 kb Tuy nhiên ĐC Pfu DNA pol khơng pha lỗng sản phẩm tạo băng phụ, kết tương ứng với kết thử hoạt tính với đoạn 234 bp Hình 3.11 A, cịn ĐC cho băng sáng rõ nét Th tương tự chạy enzyme Taq DNA pol thương mại (ĐC 4) Ngoài kết cho thấy Pfu DNA pol tái tổ hợp có tốc độ tổng hợp phút/ 1kb N Như qua nghiên cứu khẳng định biểu thành gu công Pfu DNA polymerase tế bào E coli Pfu DNA pol tái tổ hợp tạo có khả ye tổng hợp đoạn lên đến 2,5 kb với tốc độ tổng hợp phút/ kb Pfu DNA pol n ity rs ve ni nghiệm sinh học phân tử U lẫn băng phụ đảm bảo hoạt tính kéo dài DNA cho thí PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 49 Từ kết thu trên, đưa số kết luận sau:  Đã thiết kế xây dựng vector biểu pMAL-c5X – His – Pfu mang gen mã hóa Pfu DNA polymerase E.coli biểu protein Pfu DNA tái tổ hợp dạng dung hợp với Maltose – binding protein (His)8 có kích thước khoảng 135 kDa  Protein Pfu DNA pol trạng thái dung hợp với MBP bị kết tủa xử lý với nhiệt độ cao nên áp dụng phương pháp xử lý nhiệt cho mục đích tinh  Bước đầu tinh Pfu DNA pol qua giai đoạn: sắc ký qua cột amylose, hoàn nguyên Factor Xa sử dụng bi từ có gắn Ni2+ nhiên sản phẩm sau tinh sach cịn băng phụ có kích thước khoảng 70 kDa Băng phụ bị đứt gãy trình Th tinh việc tổng hợp protein tế bào bị dừng lại gặp codon  Pfu DNA pol tái tổ hợp có khả tổng hợp đoạn 234 bp 2,5 kb với tốc độ ye gu KIẾN NGHỊ N phút/ kb n  Thay đổi hệ vector biểu để protein tạo không bị kết tủa nhiệt độ ity rs ve ni U  Tăng độ dài đuôi His để tăng hiệu suất tinh qua việc sử dụng lực với Ni2+ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết giải trình tự đoạn His-Pfu DNA pol từ vector pMAL-c5X Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 50 Th n ye gu N ity rs ve ni U Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 51 Th n ye gu N ity rs ve ni U Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 52 Th n ye gu N ity rs ve ni U Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 53 Th n ye gu N Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật ity rs ve ni U Phụ lục 2: Vùng polylinker vector pMAL – c5X 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Hồng Loan, et al (2005) Một số tính chất Pfu DNA polymerase Báo cáo toàn văn Hội nghị khoa học tồn quốc Cơng nghệ sinh học nghiên cứu Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội Phan Tuấn Nghĩa, et al (2005) "Nhân dòng biểu gen DNA polymerase Pyrococcus furiosus E coli sử dụng vector pET28a." Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Phan Tuấn Nghĩa, et al (2005) "Nghiên cứu số tính chất Taq DNA Th polymerase." Tạp chí Khoa học, Đại học Quốc Gia Hà Nội 21 TÀI LIỆU TIẾNG ANH N Amir Ghasemi, et al (2011) "Cloning, expression and purifcation of Pwo polymerase gu from Pyrococcus woesei." Iranian Journal Microbiology 3(3): 118-122 ye Austin BP, et al (2009) "Hexahistidine-tagged maltose-binding protein as a fusion n ve ni Methods Mol Biol 498:157-72 U partner for the production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli." rs Bae H, et al (2009) "Characterization of DNA polymerase from the hyperthermophilic 657-667 ity archaeon Thermococcus marinus and its application to PCR." Extremophiles 13(4): Bedford, E., et al (1997) "The thioredoxin binding domain of bacteriophage T7 DNA polymerase confers processivity on Escherichia coli DNA polymerase I." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94: 479-484 Bemad, A., et al (1987) "Structural and functional relationships between prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases." The EMBO J(6) Biles BD and Connolly BA (2004) "Low-fidelity Pyrococcus furiosus DNA polymerase mutants useful in error-prone PCR." Nucleic Acids Research 32(22) Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 55 10 Braithwaite, D., K, and J Ito (1993) "Compilation, alignment, phylogenetic relationships of DNA polymerases." Nucleic Acids Research 21: 787-802 11 Brautigam CA and Steitz TA (1998) "Structural and functional insights provided by crystal structures of DNA polymerases and their substrate complexes." Current Opinion in Structural Biology 8(1): 54-63 12 Bullard, J M., et al (2002) "DNA polymerase III holoenzymee from Thermus thermophilus identification, expression, purification of components and use to reconstitute a processive replicase." Journal of Biologycal Chemistry 277: 1340113408 13 Chunlin Lu and Harold P Erickson (1997) "Expression in Escherichia coli of the Th Thermostable DNA Polymerase from Pyrococcus furiosus." Protein expression and purification 11 N 14 Clark, J M (1988) "Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by gu prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases." Nucleic Acids Research 16: 9677-968 ye 15 Dabrowski, s and J Kur (1998) "Cloning and expression in Escherichia coli of the n U recombinant His-Tagged DNA polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus ve ni woesei." Protein expression and purification 14: 131-138 16 Eckert, K A and T A Kunkel (1990) "High fidelity DNA synthesis by the Thermus rs aquaticus DNA polymerases." Nucleic Acids Research 18: 3739-3744 ity 17 Hashimoto H, et al (2011) "Crystal structure of DNA polymerase from hyperthermophilic archaeon Pyrococcus kodakaraensis KOD1." Journal of Molecular Biology 306(3): 469-477 18 Hogrefe, H H., et al (2002) "Archaeal dUTPase Enhances PCR Amplifications with Archaeal DNA Polymerases by Preventing dUTP Incorporation." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99(2): 596-601 19 Hopfner, K P., et al (1999) "Crystal structure of a thermostable type B DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 3600-3605 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 56 20 Hubscher, U., et al (2002) "Eukaryotic DNA polymerase." Annual Review of Biochemistry 71: 133-163 21 Janice Cline, et al (1996) "PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases." Nucleic Acids Research 14: 3546-3551 22 Jean-Michel Flaman, et al (1994) "A rapid PCR fidelity assay." Nucleic Acids Research 22(15): 3259-3260 23 Ji Hye Heo and Suhng Wook Kim (2013) "Cloning the Pfu DNA polymerase from DNA contaminants in preparations of commercial Pfu DNA polymerase." African Journal of Microbiology Research 7(9): 745-750 24 Joyce, C M and T A Steitz (1994) "Function and structure relationships in DNA Th polymerases." Annual Review of Biochemistry 63: 777-822 25 Kornberg (1988) "DNA Replication." Journal of Biologycal Chemistry 265(5 of gu N January): 1-4 26 Kristina Böhlke, et al (2000) "PCR performance of the B-type DNA polymerase from ye the thermophilic euryarchaeon Thermococcus aggregans improved by mutations in the n U Y-GG/A motif." Nucleic Acids Research 28(20): 3910-3917 ve ni 27 Kuroita, T., et al (2005) "Structural mechanism for coordination of proofreading and polymerase activities in archaeal DNA polymerases." Journal of Molecular Biology ity rs 351: 291-298 28 Lawyer, F G., et al (1993) "High level expression, purification and enzymeatic characterization of full-length Thermits aquaticus DNA polymerase and a truncated from deficient in ’ to 3’ activity." PCR methods Appl 2: 257-287 29 Lei Young and Q Dong (2004) "Two-step total gene synthesis method." Nucleic Acids Research 32(7) 30 Li, Y., et al (1998) "Crystal structures of the Klenow fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I complexed with deoxyribonucleoside triphosphates." Protein Science : A Publication of the Protein Society 7(5): 1116-1123 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 57 31 Liu EP, et al (2015) "Whole Blood PCR Amplification with Pfu DNA Polymerase and Its Application in Single-Nucleotide Polymorphism Analysis." Genet Test Mol Biomarkers 32 Lundberg, K S., et al (1991) "High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus." Gene 108: 1-6 33 Miladi, B., et al (2013) "An improved strategy for easy process monitoring and advanced purification of recombinant proteins." Mol Biotechnol 55(3): 227-235 34 Mroczkowski, B S., et al (1994) "Secretion of thermostable DNA polymerase using a novel baculovirus vector." Journal of Biologycal Chemistry 269: 13522–13528 35 Myers TW and Gelfand DH (1991) "Reverse transcription and DNA amplification by a Th Thermus thermophilus DNA polymerase." Biochemisty 30(31): 7661-7666 36 P S Freemont, et al (1988) "Cocrystal structure of an editing complex of Klenow N fragment with DNA." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United gu States of America 85: 8924-8928 ye 37 Pavlov, A R., et al (2002) "Helix-hairpin-helix motifs confer salt resistance and n U processivity on chimeric DNA polymerases." Proceedings of the National Academy of ve ni Sciences of the United States of America 99: 13510-13515 38 Peter McInerney, et al (2014) "Error Rate Comparison during Polymerase Chain rs Reaction byDNA Polymerase." Molecular Biology International: ity 39 Pryor KD and Leiting B (1997) "High-level expression of soluble protein in Escherichia coli using a His6-tag and maltose-binding-protein double-affinity fusion system." Protein expression and purification 10(3) 40 Singh, M I and V Jain (2013) "Tagging the expressed protein with histidines: rapid cloning of an amplicon with three options." PLoS One 8(5): e63922 41 Suhng Wook Kim, et al (2008) "Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus." International Journal of Biological Macromolecules 42: 356-361 Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 58 42 Y Kim, et al (1995) "Crystal structure of Thermus aquatics DNA polymerase." Nature 376: 612-616 43 Yan Wang, et al (2004) "A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performancein vitro." Nucleic Acids Research 32(3): 11971207 Th n ye gu N ity rs ve ni U Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 59