TRẦN XUÂN ĐẠT BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - SINH HỌC THỰC NGHIỆM Trần Xuân Đạt NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC THỰC NGHIỆM NĂM 2021 Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 Vietnam Academy of Science and Technology BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Xuân Đạt NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus roxburghii) TRONG ĐIỀU KIỆN INVITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : Hướng dẫn 1: PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo Hướng dẫn 2: TS Đồn Chính Chung Thành phố Hồ Chí Minh - 2021 Vietnam Academy of Science and Technology LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu cá nhân tác giả thực hướng dẫn PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo TS Đồn Chính Chung, Học viện Khoa học Công nghệ Số liệu, kết nghiên cứu kết luận luận văn hoàn toàn trung thực Tp Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2021 Tác giả Trần Xuân Đạt Vietnam Academy of Science and Technology LỜI CẢM ƠN Tác giả xin chân thành cảm ơn Gia đình ln ủng hộ tinh thần tạo điều kiện thuận lợi suốt quãng đường học tập Gia đình nguồn động lực lớn để tác giả cố gắng học tập hoàn thiện thân ngày Tác giả xin chân thành cảm ơn Quý Thầy/Cô Học viện Khoa học Công nghệ tận tình dạy trang bị cho tác giả kiến thức cần thiết suốt thời gian vừa qua để luận văn hoàn thành cách tốt Tác giả xin trân trọng cảm ơn PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo TS Đoàn Chính Chung tận tình giúp đỡ, định hướng tư cách làm việc khoa học Đó góp ý q báu khơng q trình thực luận văn mà cịn hành trang tiếp bước cho tác giá trình học tập lập nghiệp sau Trong trình thực nghiệm viết báo cáo luận văn khó tránh khỏi sai sót, mong Q Thầy/Cơ đọc giả thơng cảm Đồng thời, trình độ kiến thức kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên luận văn cịn thiếu sót, tác giả mong nhận ý kiến đóng góp để hồn thiện Chân thành cảm ơn! Tác giả Trần Xuân Đạt Vietnam Academy of Science and Technology MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NGỒI NƯỚC 1.1.1 Tình hình sử dụng dược liệu hỗ trợ điều trị bệnh ung thư 1.1.2 Các nghiên cứu thành phần hóa học Lan Kim Tuyến 11 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY LAN KIM TUYẾN 14 1.3 KỸ THUẬT CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 16 1.3.1 Nguyên liệu chiết xuất 18 1.3.2 Dung môi chiết xuất 18 1.3.3 Quá trình chiết xuất 19 1.4 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU HIỆN NAY 20 1.4.1 Phương pháp ngâm chiết 20 1.4.2 Phương pháp ngấm kiệt 20 1.4.3 Phương pháp chiết hồi lưu cất kéo nước 20 1.4.4 Phương pháp chiết Soxhlet 21 1.4.5 Phương pháp chiết siêu âm 21 1.4.6 Phương pháp chiết siêu tới hạn 22 1.5 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 23 CHƯƠNG VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 27 Vietnam Academy of Science and Technology 2.1.1 Cây Lan Kim Tuyến 27 2.1.2 Các dòng tế bào sử dụng 27 2.1.3 Các kit sử dụng 27 2.1.4 Các mơi trường hóa chất 28 2.2 DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG 28 2.2.1 Dụng cụ 28 2.2.2 Thiết bị 29 2.3 PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 30 2.3.1 Phương pháp thu nhận cao chiết Lan Kim Tuyến 30 2.3.2 Phương pháp phân tích sơ hợp chất cao chiết 30 2.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng 31 2.3.4 Phương pháp giải đông nuôi cấy tăng sinh tế bào 32 2.3.5 Phương pháp xác định độc tính tế bào hay ức chế tăng sinh tế bào in vitro 32 2.3.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng dịch chiết lên ức chế hình thành bào lạc tế bào 33 2.3.7 Phương pháp đánh giá thay đổi hình thái tế bào 34 2.3.8 Phương pháp nhuộm 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) 34 2.3.9 Phương pháp xác định chuyển dịch phân tử PS apoptosis tế bào 34 2.3.10 Phân tích thống kê 35 CHƯƠNG KẾT QUẢ-BÀN LUẬN 36 3.1 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH SƠ BỘ THÀNH PHẦN CÁC NHÓM CHẤT TRONG CÂY LAN KIM TUYẾN 36 3.1.1 Kết phân tích thử tinh khiết 36 3.1.2 Kết phân tích sơ thành phần hóa học 37 3.2 KẾT QUẢ THU NHẬN CAO CHIẾT TỪ CÂY LAN KIM TUYẾN 41 Vietnam Academy of Science and Technology 3.3 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG SINH TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CAO CHIẾT CÂY LAN KIM TUYẾN 43 3.3.1 Ảnh hưởng cao tổng lên tăng sinh tế bào ung thư vú 43 3.3.2 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên hàm lượng enzyme LDH giải phóng từ tế bào ung thư vú 46 3.3.3 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên hình thái tế bào ung thư vú 48 3.3.4 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên hình thành bào lạc tế bào ung thư vú 50 3.3.5 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên tăng sinh nguyên bào sợi 51 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA CAO CHIẾT LAN KIM TUYẾN LÊN SỰ CẢM ỨNG APOPTOSIS CỦA TẾ BÀO UNG THƯ VÚ 54 3.4.1 Ảnh hưởng cao chiết lên hình thái nhân tế bào ung thư 54 3.4.2 Ảnh hưởng cao chiết lên tỉ lệ apoptosis tế bào ung thư 55 CHƯƠNG KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 58 4.1 KẾT LUẬN 58 4.2 KIẾN NGHỊ 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Vietnam Academy of Science and Technology DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Dung môi khác dùng chiết xuất nhóm hoạt chất từ dược liệu 19 Bảng 2.1 Danh sách dụng cụ sử dụng 28 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng 29 Bảng 2.3 Các thuốc thử dùng để phân tích sơ thành phần hóa học 30 Bảng 3.1 Độ ẩm mẫu Lan Kim Tuyến 36 Bảng 3.2 Tro toàn phần mẫu thử Lan Kim Tuyến 36 Bảng 3.3 Số liệu phân tích sơ thử tinh khiết mẫu thử Lan Kim Tuyến 36 Bảng 3.4 Bảng phân tích sơ thành phần hóa thực vật mẫu dược liệu Lan Kim Tuyến 39 Bảng 3.5 Kết kiểm tra độ ẩm cao chiết hiệu suất tách chiết dung môi khác 41 Bảng 3.6 Kết định tính hợp chất có cao chiết Lan Kim Tuyến 41 Bảng 3.7 Kết định lượng hàm lượng flavonoid tổng cao chiết 42 Vietnam Academy of Science and Technology DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Mẫu Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 12 Hình 3.1 Phương trình đường chuẩn quercetin sử dụng định lượng flavonoid tổng 42 Hình 3.2 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên tăng sinh tế bào ung thư vú 45 Hình 3.3 Ảnh hưởng của cao chiết Lan Kim Tuyến lên hàm lượng enzyme LDH giải phóng môi trường nuôi cấy từ tế bào 47 Hình 3.4 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên hình thái tế bào ung thư vú 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng của cao chiết Lan Kim Tuyến lên hình thành bào lạc tế bào ung thư vú 51 Hình 3.6 Ảnh hưởng cao chiết lên tăng sinh nguyên bào sợi 52 Hình 3.7 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên hình thái nhân tế bào ung thư vú MCF7 54 Hình 3.8 Ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên cảm ứng apoptosis tế bào ung thư vú 56 Vietnam Academy of Science and Technology MỞ ĐẦU Theo thống kê Cơ quan Nghiên cứu Ung thư Quốc tế (International Agency for Research on Cancer – IARC ) năm 2018, tồn giới có 18,08 triệu người mắc ung thư, có 9,5 triệu người tử vong bệnh Số ca mắc ung thư Việt Nam ước tính 164.671 ca số ca tử vong 114.871 ca Các loại ung thư phổ biến nam giới ung thư gan (21,5%), ung thư phổi (18,4%), dày (12,3%), đại trực tràng (8,4%) ung thư vòm họng (5%); nữ giới ung thư vú (20,6%), đại trực tràng (9,6%), ung thư phổi (9,4%), dày (8,6%) gan (7,8%) Tỷ lệ mắc ung thư chuẩn hóa theo tuổi hai giới 151,4/ 100.000 người tỉ lệ tử vong 104,4/100.000 người Tại Việt Nam, ước tính có khoảng 70% bệnh nhân ung thư chẩn đoán giai đoạn muộn (III IV), có bệnh thể sàng lọc, phát sớm nhiều phương pháp khác Hiện nay, việc điều trị ung thư chủ yếu dựa hai phương pháp phương pháp truyền thống phương pháp đại Ở phương pháp đại, người ta sử dụng hai phương pháp là: phương pháp điều trị trúng đích (sử dụng liệu pháp kháng thể đơn dòng) phương pháp miễn dịch (sử dụng liệu pháp miễn dich liệu pháp tế bào gốc) Ngồi ra, ung thư cịn điều trị theo phương pháp truyền thống Trong phương pháp truyền thống chủ yếu dựa ba phương pháp bản, gồm phẫu thuật cắt bỏ khối u (có thể kết hợp với hóa trị xạ trị), xạ trị (sử dụng tia xạ để tiêu diệt khối u) hóa trị (sử dụng hóa chất gây độc để tiêu diệt tế bào ung thư) Bên cạnh việc sử dụng phương pháp việc sử dụng dược liệu tự nhiên việc điều trị hay hỗ trợ điều trị ung thư hướng nghiên cứu phương pháp điều trị truyền thống Phương pháp giúp nâng cao hiệu điều trị ung thư hai khía cạnh: tăng cường đáp ứng miễn dịch thể ức chế phát triển khối u, giúp tăng khả sống sót bệnh nhân [1][2] Sự kết hợp Y học đại Y học cổ truyền điều trị ung thư phát huy mạnh thuốc có nguồn gốc từ dược liệu tự nhiên, nâng cao sức đề kháng thể, hạn chế tối đa tình trạng tái phát di khối u tác dụng khơng mong muốn hóa - xạ trị, nên triệu chứng lâm sàng cải thiện Do vậy, hướng nghiên cứu Y học cổ Vietnam Academy of Science and Technology 57 Lan Kim Tuyến gây tượng apoptosis tế bào ung thư vú xác định cô đặc chromatin phân mảnh DNA (Hình 3.7) Ngồi ra, dịch chuyển phân tử PS bên màng tế bào phát phương pháp nhuộm kép Annexin V-FITC PI Sau đó, tỉ lệ tế bào apoptosis xác định kỹ thuật FACS (Hình 3.8) Vietnam Academy of Science and Technology 58 CHƯƠNG KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Kết phân tích sơ thành phần mẫu dược liệu Lan Kim tuyến: Đổ ẩm dược liệu: 13,27%, Độ tro dược liệu: 7,03%, Thành phần sơ số nhóm chất gồm: triterpenoid, alkaloid, flavonoid, glycosid, chất khử acid hữu Dung môi nước dung mơi phù hợp cho q trình chiết xuất thu nhận cao tổng từ Lan Kim Tuyến, với hiệu suất ly trích đạt 15,1 %, độ ẩm hàm lượng flavonoid tổng cao tổng đạt 18,86 % 50,85 ± 3,84 µg QE/mg Ngồi ra, nghiên cứu tiến hành chiết xuất thành công cao phân đoạn từ cao tổng nước Lan Kim Tuyến dung môi khác nhau, gồm cao phân đoạn n-hexan, cao phân đoạn etylacetat cao phân đoạn n-butanol, với độ ẩm phân đoạn cao nằm giới hạn cho phép Trong đó, cao phân đoạn etylacetat có hàm lượng flavonoid cao 61,10 ± 5,15 µg QE/mg Cao chiết cao chiết Lan Kim Tuyến ức chế mạnh tăng sinh tế bào ung thư vú MCF7 BT474 phụ thuộc vào nồng độ cao xử lý Giá trị IC50 cao chiết xác định tế vào MCF7 BT474 82,56 μg/ml 95,02 μg/ml sau 48 giở xử lý Các kết định lượng hàm lượng enzyme LDH, khả hình bào bào lạc, thay đổi hình thái tế bào cho kết tương tự Ngoài ra, cao tổng hay cao phân đoạn không gây độc gây độc dòng tế bào thường nguyên bào sợi WS1 NHDF Cao chiết Lan Kim Tuyến cảm ứng apoptosis dòng tế bào ung thư vú MCF7 Tỉ lệ tế bào apoptosis tăng theo nồng độ cao chiết xử lý 4.2 KIẾN NGHỊ Các nghiên cứu sâu cần thực để làm rõ vai trò đơn chất cao chiết Lan Kim Tuyến việc ức chế tăng sinh tế bào ung thư mơ hình in vitro in vivo Vietnam Academy of Science and Technology 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Schwartsmann G., Ratain M.J., Cragg G.M., Wong J.E., Saijo N., Parkinson D.R., Fujiwara Y., Pazdur R., Newman D.J., Dagher R., Di Leone L Anticancer drug discovery and development throughout the world Journal of Clinical Oncology, 2002, 20(18): 47-59 Vickers A Botanical medicines for the treatment of cancer: rationale, overview of current data, and methodological considerations for phase I and II trials Cancer Investigation, 2002, 20(7-8): 1069-1079 Martin K.P., Geevarghese J., Joseph D and Madassery J In vitro propagation of Dendrobium hybrids using flower stalk node explants, Indian J Exp Biol 2005, 43: 280˗285 Hu S.Y The Orchidaceae of China Quarterly Journal of the Taiwan Museum 1971, 4: 67˗ 103 Chiu N.Y., Chang K.H Anoectochilus formosanus Hayata In: The Illustrated Medicinal Plants of Taiwan SMC Publishing Inc., Taipei, Taiwan 1995,4: 282˗283 Kan W.S Anoectochilus formosanus Hayata In: Pharmaceutical Botany National Research Institute of Chinese Medicine Taipei, Taiwan, 1986 Gutierrez R.M.P Orchids: a review of uses in traditional medicine, its phytochemistry and pharmacology J Med Plant Res 2010, 4: 592˗638 He C.N., Wang C.L, Guo S.X., Yang J.S., Xiao P.G Study on chemical constituents in herbs of Anoectochilus roxburghii II China Journal of Chinese Materia Medica, 2005, 30: 761-763 He C.N, Wang C.L, Guo S.X., Yang J.S., Xiao P.G A Novel Flavonoid Glucoside from Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Journal of Integrative Plant Biology, 2006, 48: 359-363 10 Liu B., Gao Y.Q., Wang X.M., Wang Y.C., Fu L.Q Germacrone inhibits the proliferation of glioma cells by promoting apoptosis and inducing cell cycle Vietnam Academy of Science and Technology 60 arrest Mol Med Rep 2014, 10(2):1046-1050 11 Huang L, Cao Y, Xu H Chen G Separation and purification of ergosterol and stigmasterol in Anoectochilus roxburghii (wall) Lindl by high speed counter current chromatography Journal of Separation Science, 2011, 34: 385-392 12 Wan T., Xiong F Determination of kinsenoside in Anoectochilus roxburghi by HPLC-ELSD Chinese Traditional Patent Medicine, 2014, 13 Du X.M., Sub N.Y., Irino N and Shoyama Y Glycosidic constituents from in vitro Anoectochilus formosanus Chem Pharm Bull 2000, 48: 1803˗1804 14 Du X.M., Sun N.Y., Tamura T., Mohri A., Sugiura M., Yoshizawa T., Irino N., Hayashi J and Shoyama Y Higher yielding isolation of Kinsenoside in Anoectochilus and its anti-hyperliposis effect Biol Pharm Bull 2001, 24: 65˗69 15 Lin C.C., Huang P.C., Lin J.M Antioxidant and Hepatoprotective Effects of Anoectochilus formosanus and Gynostemma pentaphyllum The American Journal of Chinese Medicine 2002, 28(1): 87-96 16 Wu J.B., Lin W.L., Hsich C.C., Ho H.Y., Tsay H.S and Lin W.C The hepatoprotective activity of kinsenoside from Anoectochilus formosanus Phytother Res 2007, 21: 58˗61 17 Wang S.Y., Kuo Y.H., Chang H.N., Kang P.L., Tsay H.S., Lin K.F., Yang N.S., Shyur L.F Profiling and characterization antioxidant activities in Anoectochilus formosanus Hayata J Agric Food Chem 2002, 5:1859–1865 18 Cui S.C., Yy J., Zhang X.H., Cheng M.Z., Yang L.W., Xu J.Y Antihyperglycemic and antioxidant activity of water extract from Anoectochilus roxb urghii in experimental diabetes Exp Toxicol Pathol 2013, 65(5):485-488 19 Zhang J.G., Liu Q., Liu Z.L., Li L., Yi L.T Anti- hyperglycemic activity of Anoectochilus roxburghii polysaccharose in diabetic mice induced by high-fat diet and streptozotocin J Ethnopharmacol 2015, 164:180-185 20 Wu J.B.,Chuang H.R., Yang L.C, Lin W.C A standardized aqueous extract Vietnam Academy of Science and Technology 61 of Anoectochilus formosanus ameliorated thioacetamide-induced liver fibrosis in mice: The role ofKuppercells Biosci Biotechnol Biochem 2010, 74(4): 781˗ 787 21 Shih C.C., Wu Y.W., Lin W.C Aqueous extract of Anoectochilus formosanus attenuate hepatic fibrosis induced by carbon tetrachloride in rats Phytomedicine 2005, 12(6-7):453-60 22 Yang Z Protective effect of Anoectochilus roxburghii polysaccharide against CCl4-induced oxidative liver damage in mice International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 96: 442-450 23 Zhang J.G., Liu Q., Liu Z.L., Li L., Yi L.T Anti- hyperglycemic activity of Anoectochilus roxburghii polysaccharose in diabetic mice induced by high-fat diet and streptozotocin J Ethnopharmacol 2015, 164:180-185 24 Tang T., Duan X., Ke Y., Zhang L., Shen Y., Hu B., Liu A., Chen H., Li C., Wu W., Shen L., Liu Y Antidiabetic activities of polysaccharides from Anoectochilus roxburghii and Anoectochilusformosanus in STZ-induced diabetic mice Int J Biol Macromol 2018, 112:882-888 25 Matsuda H., Ninomiya K., Morikawa T., Yoshikawa M Inhibitory effect and action mechanism of sesquiterpenes from Zedoariae rhizoma on Dgalactosamine/ lipopolysaccharide-induced liver injury Bioorg Med Chem Lett 1998, 8: 339–344 26 Shyur L.F., Chen C.H., Lo C.P., Wang S.Y., Kang P.L., Sun S.J., Chang C.A., Tzeng C.M., Yang N.S Induction of apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells by phytochemicals from Anoectochilus formosanus J Biomed Sci 2004, 11(6):928-939 27 Tseng C.C., Shang H.F., Wang L.F., Su B., Hsu C.C., Kao H.Y., Cheng K.T Antitumor and immunostimulating effects of Anoectochilus formosanus Hayata Phytomedicine 2006, 13(5):366-70 28 Hsieh W.T., Tsai C.T., Wu J.B., Hsiao H.B., Yang L.C., Lin W.C Vietnam Academy of Science and Technology 62 Kinsenoside, a high yielding constituent from Anoectochilus formosanus, inhibits carbon tetrachloride induced Kupffer cells mediated liver damage J Ethnopharmacol 2011, 135(2):440-449 29 Yang Z Protective effect of Anoectochilus roxburghii polysaccharide against CCl4-induced oxidative liver damage in mice International Journal of Biological Macromolecules, 2017, 96: 442-450 30 Huang L, Cao Y, Xu H Chen G Separation and purification of ergosterol and stigmasterol in Anoectochilus roxburghii (wall) Lindl by high speed counter current chromatography Journal of Separation Science, 2011, 34: 385-392 31 Wang L, Chen Q, Zhuang S, Wen Y, Cheng W, Zeng Z, Jiang T, Tang C Effect of Anoectochilus roxburghii flavonoids extract on H2O2 - Induced oxidative stress in LO2 cells and D-gal induced aging mice model J Ethnopharmacol 2020 May 23;254:112670 32 Xiaoling Yu, Shouer Lin, Jinque Zhang, Liying Huang, Hong Yao, Shaoguang Li Purification of polysaccharide from artificially cultivated Anoectochilus roxburghii(wall.) Lindl by high-speed counter current chromatography and its antitumor activity Journal of Separation Science 2017 33 Le Dinh Chac, Bui Bao Thinh, Ha Thi Thanh Huong, Ngo Tuan Kiet, Le Quang Huan Quantification of quercetin, isorhamnetin and ferulic acid in dry extract of Anoectochilus setaceus Blume from VietNam International Journal of Botany Studies 2019, 4(5): 14-18 34 Đỗ Thị Gấm, Hà Việt Hải, Chu Hồng Hà, Phạm Bích Ngọc Khảo sát số đặc điểm hóa học tác dụng chống oxy hóa (antioxydant) hợp chất Flavonoid chiết xuất từ số lồi lan Kim tuyến Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 2017, 33(1S): 104-113 35 Tran Minh Hoi, Tran Van Thai, Chu Thi Thu Ha, Ha Thi Van Anh, Phan Xuan Binh Minh and Nguyen Tien Dat Flavonoids from Anoectochilus annamensis and their Anti-inflammatory Activity Communications 2016, 11(5): 613-614 Vietnam Academy of Science and Technology Natural Product 63 36 Geran RI, Greenberg NH, Macdonald MM, Shumacher AM, Abbott BJ Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems (3rd edition) Cancer Chemoth Rep 1972; 3: 1–91 37 Ho Y., Chen Y.F., Wang L.H., Hsu K.Y., Chin Y.T., Yang Y.S.H., Wang S.H., Chen Y.R., et al Inhibitory Effect of Anoectochilus formosanus Extract on Hyperglycemia-Related PD-L1Expression and Cancer Proliferation Front Pharmacol 2018, 9:807 38 Weng, X.H., Wang, C.L., Yuan, X., Chen, W.J., 2011 Inhibitory effect of Anoectochilus formosanus polysaccharide on human prostate cancer PC-3 cell in vitro Chin J Hosp Pharm 31, 1083–1087 39 Jue, W.C., 2011 The extraction of volatile oil in Anoectochilus and its inhibition effect in lung cancer cell NCI-H446 Fujian Medical University, Fujian 40 Shyur, L.F., Chen, C.H., Lo, C.P., Wang, S.Y., Kang, P.L., Sun, S.J., Chang, C.A., Tzeng, C.M., Yang, N.S., 2004 Induction of apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells by phytochemicals from Anoectochilus formosanus J Biomed Sci 11, 928–939 41 Elmore S Apoptosis: A Review of Programmed Cell Death Toxicologic Pathology, 2007, 35(4): 495-516 42 Hanahan D., Weinberg R.A The hallmarks of cancer Cell, 2000, 100: 5770 43 Johnson V.L., Ko S.C., Holmstrom T.H., Chow S.C Effector caspases are dispensable for the early nuclear morphological changes during chemicalinduced apoptosis”, Journal of Cell Science, 200, 113: 2941-2953 Vietnam Academy of Science and Technology 64 PHỤ LỤC Phụ lục Kết xây dựng đường chuẩn định lượng flavonoid tổng kết định lượng hàm lượng flavonoid tổng mẫu cao chiết Lan Kim Tuyến *: Ống 1, 2, 3, 4, 5, tương ứng với nồng độ kiểm tra 0, 2, 4, 6, 8, 10 µg/ml quercetin Nồng độ Nồng độ thực tế kiểm tra OD415 nm Giá trị Giá trị sai số Lần Lần Lần trung bình - - - - - 20 0,265 0,277 0,287 0,276 0,0110 40 0,577 0,598 0,59 0,588 0,0106 60 0,812 0,831 0,815 0,819 0,0102 80 1,124 1,068 1,052 1,081 0,0378 100 10 1,472 1,402 1,484 1,453 0,0443 Kết xác định hàm lượng flavonoid tổng số mẫu cao phân đoạn khác Vietnam Academy of Science and Technology 65 Mẫu Cao ethanol Cao nước Giá trị OD Lân Lần Nồng độ thực tế Lần Lân Lần Lần TB SS 0,294 0,274 0,331 43,24 40,45 48,41 44,04 4,12 0,378 0,337 0,330 54,97 49,25 48,27 50.85 3.84 Phụ lục Kết ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên tỉ lệ sống (%) dòng tế bào ung thư vú Tế bào MCF7 Đơn vị tính: % Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống (%) Sai số 6h 12h 24h 48h 6h 24h 48h 72h 100 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,5 99,02 97,79 97,74 98,22 2,37 4,48 0,45 1,50 25 98,12 99,13 98,86 99,17 1,58 4,57 3,22 4,45 50 99,02 97,88 96,30 77,38 3,02 3,62 1,83 4,96 75 95,23 96,20 89,29 61,44 2,12 2,99 2,70 5,66 100 94,23 90,06 81,57 40,48 4,02 3,28 3,75 3,72 150 92,02 84,48 68,29 20,38 2,36 2,54 5,17 2,23 200 89,16 80,45 64,96 16,89 3,10 3,22 4,56 2,23 Vietnam Academy of Science and Technology 66 Tế bào BT474 Đơn vị tính: % Nồng độ Tỉ lệ tế bào sống (%) Sai số 6h 12h 24h 48h 6h 24h 48h 72h 100 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 12,5 99,67 98,67 96,91 98,76 2,37 3,70 3,67 2,62 25 98,12 97,23 95,41 98,67 1,58 3,54 5,93 4,69 50 97,25 96,68 94,31 89,15 3,02 5,32 2,79 4,48 75 98,21 95,95 89,51 60,47 2,12 4,07 3,14 3,37 100 95,23 91,80 84,66 47,26 4,02 3,92 3,10 2,94 150 95,02 85,11 82,43 24,93 2,36 3,59 4,77 3,66 200 92,31 83,53 71,89 18,35 3,10 2,00 3,78 2,52 Vietnam Academy of Science and Technology 67 Phụ lục Kết ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên tỉ lệ sống (%) nguyên bào sợi Nguyên bào sợi WS1 Đơn vị tính: % Tỉ lệ tế bào sống (%) Nồng độ Sai số 12h 24h 48h 12h 24h 48h 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 0,00 12,5 101,65 100,20 95,88 3,81 2,36 3,54 25 95,42 97,27 92,23 5,64 4,55 0,44 50 97,28 96,42 98,89 6,12 4,55 4,83 75 92,38 95,13 83,55 0,66 7,50 4,39 100 96,21 92,62 80,57 6,81 4,46 2,42 150 90,53 92,22 71,67 3,01 6,33 6,62 200 82,41 76,39 64,62 5,16 7,50 4,09 Vietnam Academy of Science and Technology 68 Nguyên bào sợi NDHF Đơn vị tính: % Tỉ lệ tế bào sống (%) Nồng độ Sai số 12h 24h 48h 12h 24h 48h 0 100,00 100,00 100,00 0,00 0,00 12,5 12,5 98,74 99,16 95,83 3,81 2,36 25 25 97,49 101,57 94,29 3,64 3,55 50 50 98,36 100,78 94,16 2,12 4,55 75 75 94,45 96,17 90,14 4,66 5,50 100 100 92,71 94,35 84,28 3,81 4,46 150 150 91,97 90,35 80,25 4,01 3,33 200 200 89,88 83,73 68,34 5,16 4,50 Vietnam Academy of Science and Technology 69 Phụ lục Kết ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên hàm lượng LDH môi trường nuôi cấy tế bào ung thư vú Tế bào MCF7 Đơn vị tính: lần Lần Đối chứng 6.25 µg/ml 12.5 µg/ml 25 µg/ml 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml H2O2 1 1,03 0,94 1,26 1,42 2,40 2,63 3,00 1,00 1,02 0,98 1,77 2,18 2,24 2,84 0,94 1,11 1,27 1,50 2,22 2,45 3,21 TB ± SS 1,00 ± 0,00 0,99 ± 0,05 1,02 ± 0,09 1,17 ± 0,16 1,56 ± 0,18 2,27 ± 0,12 2,44 ± 0,20 3,02 ± 0,19 Tế bào BT474 Đơn vị tính: lần Lần Đối chứng 6.25 µg/ml 12.5 µg/ml 25 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 150 µg/ml 200 µg/ml 1 1,00 0,94 1,28 1,68 2,04 2,10 3,56 1,03 0,98 1,18 1,79 2,30 2,34 2,96 0,95 1,03 1,24 1,48 1,86 2,20 3,30 TB ± SS 1,00 ± 0,00 0,99 ± 0,04 0,98 ± 0,05 1,23 ± 0,05 1,65 ± 0,16 2,07 ± 0,22 2,21 ± 0,12 3,27 ± 0,30 Vietnam Academy of Science and Technology 70 Phụ lục Kết ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên khả hình thành bào lạc tế tế bào ung thư vú Tế bào MCF7 Đơn vị tính: số bào lạc Lần Đối chứng 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml 458 366 232 185 435 380 242 228 442 352 208 210 TB ± SS 445 ± 12 366 ± 14 227 ± 18 208 ± 22 Tế bào BT474 Đơn vị tính: số bào lạc Lần Đối chứng 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml 422 359 286 228 410 403 289 270 406 378 260 210 TB ± SS 412 ± 380 ± 22 278 ± 16 236 ± 30 Vietnam Academy of Science and Technology 71 Phụ lục Kết đánh giá ảnh hưởng cao chiết Lan Kim Tuyến lên khả cảm ứng apoptosis tế bào ung vú MCF7 hệ thống flow cytometry Đơn vị tính: % Lần Đối chứng 50 µg/ml 75 µg/ml 100 µg/ml VP-16 1,91 7,21 18,43 29,96 35,67 2,67 10,78 15,70 21,68 29,68 1,48 10,68 20,62 25,02 32,02 TB ± SS 2,02 ± 0,61 9,56 ± 2,04 18,25 ± 2,41 25,56 ± 4,13 32,46 ± 3,02 Vietnam Academy of Science and Technology