Luận văn thạc sỹ Sinh học VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐỖ TIẾN MẠNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2015 Luận văn thạc sỹ Sinh học VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ĐỖ TIẾN MẠNH NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Bình Hà Nội - 2015 ii Luận văn thạc sỹ Sinh học LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu trình bày Luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu khác Tôi xin cam đoan thông tin trích dẫn Luận văn rõ nguồn gốc Tôi xin chịu trách nhiệm nghiên cứu Học viên Đỗ Tiến Mạnh i Luận văn thạc sỹ Sinh học LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới Q Thầy, Cơ giảng dạy chương trình Cao học khóa 17 - Viện Sinh thái Tài nguyên Sinh vật Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, người truyền đạt cho kiến thức hữu ích làm sở giúp thực tốt luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới PGS.TS Nguyễn Thị Thanh Bình, người Thầy ln tận tình hướng dẫn, dìu dắt tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn thạc sĩ khoa học Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cô chú, anh chị làm việc Phịng Cơng nghệ Gen Động vật – Viện Cơng nghệ Sinh học quan tâm giúp đỡ suốt q trình thực tập phịng thí nghiệm Viện Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình bạn bè tạo điều kiện, động viên để tơi hồn thành khóa học thực luận văn thạc sĩ với kết tốt Học viên Đỗ Tiến Mạnh ii Luận văn thạc sỹ Sinh học MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nấm Cordyceps spp 1.1.1 Giới thiệu nấm Cordyceps spp 1.1.2 Quá trình xâm nhiễm nấm Cordyceps spp vào thể côn trùng 1.1.3 Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps giới 1.1.3.1 Đa dạng phân bố 1.1.3.2 Tình hình nhân ni nấm Cordyceps spp giới 1.1.4 Tình hình nghiên cứu Cordyceps Việt Nam 1.1.4.1 Đa dạng phân bố 1.1.4.2 Tình hình nhân ni nấm Cordyceps spp Việt Nam 12 1.1.5 Thành phần hóa học, hoạt chất sinh học giá trị dược liệu nấm Cordyceps spp 13 1.1.5.1 Thành phần hóa học hoạt chất sinh học 13 1.1.5.2 Giá trị dược liệu nấm Cordyceps spp 14 1.2 Sơ lƣợc hoạt chất Adenosine 16 1.2.1 Cấu trúc hóa học Adenosine 16 1.2.2 Ứng dụng Adenosine 16 1.3 Sơ lƣợc hoạt chất Beauvericine 17 1.3.1 Cấu trúc hóa học Beauvericine 17 1.3.2 Ứng dụng Beauvericine 18 CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên liệu 20 iii Luận văn thạc sỹ Sinh học 2.1.1 Nguyên liệu 20 2.1.2 Hóa chất sử dụng 20 2.1.3 Thiết bị sử dụng 21 2.1.4 Môi trường nuôi cấy 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 22 2.2.1.1 Phân lập khiết vi nấm 22 2.2.1.2 Hoạt hóa giống 22 2.2.1.3 Nghiên cứu khả tổng hợp hoạt chất sinh học môi trường lỏng môi trường rắn chủng nấm nghiên cứu 23 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử 24 2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 24 2.2.2.2 Định lượng DNA quang phổ kế 26 2.2.2.3 PCR 26 2.2.2.4 Điện di kiểm tra DNA tổng số sản phẩm PCR 27 2.2.2.5 Xác định trình tự gen 27 2.2.3 Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC) 28 2.2.4 Xử lý số liệu 29 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Thu thập, phân lập tuyển chọn chủng nấm 30 3.2 Đánh giá khả tạo thể chủng nấm phân lập 33 3.3 Xác định tên khoa học chủng nấm phân lập trình tự ITS 34 3.4 Lựa chọn mơi trƣờng thạch thích hợp cho nhân giống 36 3.5 Lựa chọn mơi trƣờng lỏng thích hợp cho nhân giống 38 3.6 Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối tạo hoạt chất sinh học 40 3.6.1 Nhân nuôi môi trường lỏng tĩnh 40 3.6.2 Nhân nuôi môi trường rắn 42 3.7 Nghiên cứu khả tổng hợp Adenosine Beauvericine môi trƣờng lỏng tĩnh môi trƣờng rắn 44 3.7.1 Kết hệ thống LC/MS 44 iv Luận văn thạc sỹ Sinh học 3.7.1.1 Định lượng Adenosine 44 3.7.1.2 Định lượng Beauvericine 47 3.7.2 Nghiên cứu khả tổng hợp Adenosine Beauvericine môi trường lỏng tĩnh môi trường rắn 48 3.7.2.1 Trong môi trường lỏng tĩnh 48 3.7.2.1 Trong môi trường rắn 49 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận .52 4.2 Kiến nghị 52 PHỤ LỤC 53 Tài liệu tham khảo 54 v Luận văn thạc sỹ Sinh học DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng 20 Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 21 Bảng 2.3 Thành phần môi trường sử dụng nghiên cứu (g/l) 21 Bảng 2.4 Thành phần PCR 27 Bảng 2.5 Chu trình nhiệt PCR 27 Bảng 2.6 Gradient nồng độ thiết lập 28 Bảng 3.1 Khả tạo thể chủng nấm phân lập 33 Bảng 3.2 Khả sinh bào tử chủng A9 môi trường hoạt hóa lỏng 39 Bảng 3.3 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên sinh khối lỏng tĩnh 41 Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng lên trình tạo thể 42 Bảng 3.5 Các nồng độ Adenosine sử dụng xây dựng đường chuẩn định lượng 46 Bảng 3.6 Các nồng độ Beauvericine sử dụng xây dựng đường chuẩn định lượng 48 Bảng 3.7 Hàm lượng Adenosine, Beauvericine sinh khối lên men lỏng tĩnh 49 Bảng 3.8 Hàm lượng Adenosine Beauvericine sinh khối lên men rắn 50 vi Luận văn thạc sỹ Sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Nấm C.takaomontana /thể vơ tính hữu tính Hình 1.2 Nấm Isaria tenuipes / thể vơ tính C.takaomontana Hình 1.3 Nấm Cordyceps crinalis Hình 1.4 Nấm Cordyceps sinensis (Beck) Hình 1.5 Nấm Cordyceps militaris Hình 1.6 Nấm C.nutans 11 Hình 1.7 Nấm C.sphecocephala 11 Hình 1.8 Nấm Cordyceps prolifica 12 Hình 1.9 Nấm Cordyceps pseudomilitaris 12 Hình 1.10 Cấu trúc hóa học Adenosine 16 Hình 1.11 Cấu trúc hóa học Beauvericin 17 Hình 3.1 Mẫu VN3 30 Hình 3.2 Mẫu VN4 30 Hình 3.3 Mẫu VN6 30 Hình 3.4 Mẫu VN7 30 Hình 3.5 Mẫu VN8 30 Hình 3.6 Mẫu VN9 30 Hình 3.7 Đĩa khuẩn lạc ria khuẩn lạc chấm điểm chủng A3 32 Hình 3.8 Đĩa khuẩn lạc ria khuẩn lạc chấm điểm chủng A6 32 Hình 3.9 Đĩa khuẩn lạc ria khuẩn lạc chấm điểm chủng A7 32 Hình 3.10 Đĩa khuẩn lạc ria khuẩn lạc chấm điểm chủng A8 32 Hình 3.11 Đĩa khuẩn lạc ria khuẩn lạc chấm điểm chủng A9 33 Hình 3.12 Ảnh điện di DNA chủng A9 34 Hình 3.13 Ảnh điện di sản phẩm PCR 35 Hình 3.14 Trình tự ITS chủng A9 35 Hình 3.15 Sơ đồ phân loại chủng C.takaomontana A9 36 Hình 3.16 Biểu đồ tốc độ tăng trưởng đường kính khuẩn lạc chủng C.takaomontana A9 37 vii Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.17 Hình ảnh khuẩn lạc chủng A9 môi trường 38 Hình 3.18 Hình ảnh bào tử chủng C.takaomontana A9 kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần) 40 Hình 3.19 Hình ảnh bào tử chủng C.takaomontana A9 kính hiển vi quang học (độ phóng đại 400 lần) 40 Hình 3.20 Chủng nấm A9 ni lỏng tĩnh mơi trường 42 Hình 3.21 Sinh khối tươi chủng A9 môi trường 42 Hình 3.22 Chủng C.takaomontana A9 nảy mầm mơi trường DD 43 Hình 3.23 Thể tươi chủng A9 môi trường DD 44 Hình 3.24 Sắc kí đồ HPLC UV 260 nm chất thị Adenosine (A) mẫu (B) 45 Hình 3.25 Sắc kí đồ MS ESI Positive chất thị Adenosine 46 Hình 3.26 Sắc kí đồ Sim 806,0 chất thị Beauvericine (A) mẫu (B) 47 Hình 3.27 Sắc kí đồ MS - ESI Positive chất thị Beauvericine 48 viii Luận văn thạc sỹ Sinh học Adenosine A B Adenosine Hình 3.24: Sắc kí đồ HPLC UV 260 nm chất thị Adenosine (A) mẫu (B) 45 Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.25: Sắc kí đồ MS ESI Positive chất thị Adenosine Hình 3.24 3.25 cho thấy, thời gian lưu bắt đầu xuất pic 13,4 phút đến 13,8 phút, pic phân tử Adenosine xuất với cường độ cao thời gian lưu 13,6 - 13,7 phút, không xuất pic tương tự thời gian lưu khác Đối chiếu với pic Adenosine chuẩn, pic Adenosine C.takaomontana A9 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu Adenosine chuẩn Đường chuẩn định lượng Adenosine tính tốn dựa diện tích pic UV 260 nm thời gian lưu Rt 13.5-13.6 phút (phụ lục 1) Bảng 3.5 Các nồng độ Adenosine sử dụng xây dựng đường chuẩn định lượng Mức nghiên cứu Nồng độ Adenosine (g/ml) 0.02 0.05 0.1 0.2 0.5 Dựa kết thu được, thiết lập phương trình đường chuẩn adenosine có dạng: y = 2309.5x + 8.5 46 Luận văn thạc sỹ Sinh học 3.7.1.2 Định lượng Beauvericine Các mẫu bơm vào hệ thống LC/MS với điều kiện phân tích thiết lập trình bày phần phương pháp Trên sắc kí đồ bắt ion mảnh (SIM), pic ion phân tử Beauvericine xuất ổn định với cường độ cao thời gian lưu 27,1 - 27,3 min, không xuất pic thời gian lưu khác; đồng thời sắc kí đồ ion tổng (TIC) cho kết MS phù hợp với phổ khối Beauvericine, kết trình bày hình 3.26 hình 3.27 Từ hình 3.26 hình 3.27thấy rằng, thời gian lưu bắt đầu xuất pick 26,9 phút chi đến 27,7 phút Pick phân tử Beauvericine xuất với cường độ cao thời gian lưu 27,2 – 27,3, không xuất pick tương tự thời gian lưu khác Đối chiếu với pick Beauvericine chuẩn, pick Beauvericine chiết từ C.takaomontana A9 có thời gian lưu trùng với thời gian lưu Beauvericine chuẩn A Beauvericine B Beauvericine Hình 3.26 Sắc kí đồ Sim 806,0 chất thị Beauvericine (A) mẫu (B) 47 Luận văn thạc sỹ Sinh học Hình 3.27 Sắc kí đồ MS - ESI Positive chất thị Beauvericine Đường chuẩn định lượng Beauvericine xây dựng dựa phương pháp tính lượng ion tổng m/z 806,0 sắc ký đồ SIM thời gian lưu 27.1 – 27,3 phút (phụ lục 2) Bảng 3.6 Các nồng độ Beauvericine sử dụng xây dựng đường chuẩn định lượng Mức nghiên cứu Nồng độ Beauvericine (g/ml) 0.01 0.02 0.05 0.1 0.2 Dựa kết thu được, chúng tơi thiết lập phương trình đường chuẩn Beauvericine có dạng: y = 1.54652E7x + 58972 3.7.2 Nghiên cứu khả tổng hợp Adenosine Beauvericine môi trường lỏng tĩnh môi trường rắn 3.7.2.1 Trong môi trường lỏng tĩnh Sinh khối nấm thu hoạch mơi trường lỏng tĩnh LT1, LT2, LT3 thí nghiệm làm khô nhiệt độ độ 500C tiến hành định lượng hoạt chất Adenosine Beauvericine Kết thể bảng 3.7 48 Luận văn thạc sỹ Sinh học Bảng 3.7 Hàm lượng Adenosine, Beauvericine sinh khối lên men lỏng tĩnh Môi trƣờng LT1 LT2 LT3 Chỉ tiêu Adenosine (mg/g khô) 0,425±0,001 0,025±0,001 0,289±0,003 Beauvericine (mg/g khô) 4,817±0,013 0,642±0,002 3,525±0,002 Số liệu xử lý Anova one – way có P < 0,05, nên giá trị thu có ý nghĩa thống kê Kết bảng 3.7 cho thấy, hàm lượng Adenosine sinh khối thu từ môi trường lỏng tĩnh không giống Sinh khối thu từ môi trường LT1 cao nhất, đạt 0,425 mg/g, sau đến sinh khối thu từ mơi trường LT3, đạt 0,289 mg/g Thấp sinh khối thu từ môi trường LT2, đạt 0,025 mg/g Kết từ bảng 3.7 cho thấy, sinh khối thu từ mơi trường LT2 có hàm lượng Beauvericine thấp nhất, đạt 0,642 mg/g Trong mơi trường LT3 hàm lượng cao lần, đạt 3,525 mg/g hàm lượng Beauvericine lớn nuôi môi trường LT1 4,817 mg/g Như môi trường lên men lỏng tĩnh, môi trường LT1 thích hợp cho tổng hợp Adenosine Beauvericine chủng A9 Sự khác hàm lượng hoạt chất giải thích khác thành phần môi trường hàm lượng chất môi trường nuôi lỏng tĩnh 3.7.2.1 Trong môi trường rắn Thể sau thu hoạch, làm khô thiết bị đông khô (bổ sung thêm chiếu sáng lux), sau tiến hành định lượng Adenosine Beauvericine Kết trình bày bảng 3.8 49 Luận văn thạc sỹ Sinh học Bảng 3.8 Hàm lượng Adenosine Beauvericine sinh khối lên men rắn Môi trƣờng Chỉ tiêu DD1 DD2 DD3 Adenosine (mg/g khô) 0,032±0.001 0,073±0.002 0,059±0.002 Beauvericine(mg/g khô) 0,807±0.015 1,344±0.034 1,023±0.023 Số liệu xử lý Anova one – way có P < 0,05, nên giá trị thu có ý nghĩa thống kê Kết bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng Adenosine sinh khối thu từ môi trường DD1 có giá trị thấp nhất, đạt 0,032 mg/g Trong đó, mơi trường DD3, hàm lượng Adenosine thu gấp 1,8 lần so với môi trường DD1, đạt 0,059 mg/g Môi trường DD2 cho hàm lượng Adenosine thu cao nhất, đạt 0,073 mg/g Bảng 3.8 cho thấy, hàm lượng Beauvericine thu từ sinh khối môi trường DD2 cao nhất, đạt 1,344 mg/g Tiếp theo môi trường DD3, đạt 1,023 mg/g thấp môi trường DD1, đạt 0,807 mg/g Dữ liệu thu từ bảng 3.8 cho thấy, mơi trường DD1, DD2, DD3 mơi trường dinh dưỡng DD2- với nguồn carbon glucose cho khối lượng thể hàm lượng Adenosin, Beauvericine cao so với hai môi trường DD1 DD3 So sánh hàm lượng hai hoạt chất Adenosine Beauvericine từ sinh khối lên men chủng A9 môi trường lỏng tĩnh từ thể lên men bề mặt môi trường gạo lứt (có bổ sung dinh dưỡng DD), nhận thấy sinh khối môi trường lên men lỏng tĩnh, hàm lượng Adenosin Beauvericine cao so với thể phát triển môi trường gạo lứt Trong môi trường lên men lỏng tĩnh, hàm lượng Adenosin Beauvercicin đạt 0,425 4,817 mg/g môi trường LT1 Trong lượng Adenosine thể nhỏ gần lần, đạt 0,073 mg/g, lượng Beauvericine thấp 3,5 lần, đạt 1,344 mg/g DD2 so với hàm lượng hoạt chất có sinh khối nuôi lỏng tĩnh Giá thành sinh khối nhân nuôi lỏng tĩnh thấp nhân nuôi rắn, điều kiện nuôi đơn giản Kết gợi mở 50 Luận văn thạc sỹ Sinh học khả phát triển sản phẩm nuôi lỏng tĩnh tạo hoạt chất Adenosine Beauvercicine Từ thể quả, hàm lượng beauvericin chủng Cordyceps takaomontana A9 trung bình khoảng 1,058 mg/g, cao so với chủng có nguồn gốc Thái Lan (0,915 mg/g) lên men mơi trường rắn Trong đó, chủng tự nhiên Thái Lan hàm lượng Beauvericine dao động từ 0,0056 đến 0,038 mg/g (theo Sumalee Supothina cộng sự, 2011) Như vậy, hàm lượng Beauvericine từ Cordyceps takaomontana A9 Việt Nam cao so với chủng C takaomontana có nguồn gốc Thái Lan lên men môi trường rắn 51 Luận văn thạc sỹ Sinh học CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ sáu mẫu Cordcyeps spp thu thập vườn Quốc gia Hồng Liên, Lào Cai, phân lập chủng có khả sinh trưởng phát triển tốt, ba chủng tạo thể quả, chủng A9 tạo nhiều thể Bằng phương pháp xác định trình tự ITS so sánh Ngân hàng gen Tên khoa học chủng A9 xác định Cordyceps takaomontana A9 Môi trường thạch SDAY (glucose 40g/l, cao nấm men 20g/l, agar 20 g/l) mơi trường thích hợp cho nhân giống cấp I Môi trường HHL1 (glucose 25g/l, cao nấm men 5g/l, pepton 10g/l, KH 2PO4 1g/l, MgSO4 0,5g/l) môi trường tốt cho trình hoạt hóa lỏng chủng Cordyceps takaomonta A9 Mơi trường lỏng tĩnh LT1 (glucose 25g/l, peptone 10g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 1g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l) cho sinh khối hoạt chất cao nhất, tương ứng với trọng lượng tươi 33,30g/bình, Adenosine 0,425mg/g khơ, Beauvericine 4,817 mg/g khơ Mơi trường rắn với dinh dưỡng DD2 (glucose 20g/l, peptone 5g/l, cao nấm men 5g/l, KH2PO4 1,5g/l, MgSO4.7H2O 0,5g/l), gạo lứt bột nhộng tằm tạo thể tổng hợp hoạt chất nhiều nhất, tương ứng với trọng lượng tươi 16,60g/lọ, Adenosine 0,073mg/g khô, Beauvericine 1,334 mg/g khô 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu xác định số hoạt chất có khả hỗ trợ hệ tim mạch, ức chế tế bào ung thư, tăng cường khả miễn dịch Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp độc tính bán trường diễn sản phẩm: sinh khối lỏng tĩnh thể 52 Luận văn thạc sỹ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Đƣờng chuẩn định lượng Adenosine mẫu phân tích Phụ lục 2: Đƣờng chuẩn định lượng Beauvericine mẫu phân tích 53 Luận văn thạc sỹ Sinh học Tài liệu tham khảo Tài liệu tiếng Việt Lê Văn Vẻ, Trần Thu Hà, Nguyễn Thị Bích Thủy, Ngơ Xuân Nghiễn (2015) Bước đầu nghiên cứu công nghệ nuôi trồng nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.) Việt Nam Tạp chí Khoa học Phát triển, 13(3): 445-454 Nguyễn Lân Dũng (1981) Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng Nxb Khoa học kỹ thuật Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Liên Hoa, Lê Hồng Yến, Nguyễn Văn Bắc (2005), Chương trình Vi sinh vật học - Nấm sợi Nxb Nông nghiệp Nguyễn Mậu Tuấn, Trương Phi Hùng, Nguyễn Thái Huy, Dương Thị Ngọc (2009) Hiệu dịch chiết nấm Đông trùng Hạ thảo tằm dâu, Paecilomyces tenuipes đến khả bơi chuột Tạp chí khoa học cơng nghệ nơng nghiệp Việt Nam 2(15): 110-115 Nguyễn Thị Thúy (2015) Một số đặc điểm sinh vật học loài nấm ký sinh côn trùng Isaria javanica (Frider & Bally) Samsom & Hywel-Jones vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An Tạp trí Khoa học Phát triển, 13(5): 687 – 693 Phạm Quang Thu (2009) Điều tra phát nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps nutants Pat phân bố khu bảo tồn thiên nhiên Tây Yên Tử, Sơn Động, Bắc Giang Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn, Bộ NN & PTNT, 4: 91-94 Phạm Quang Thu (2009) Phát nấm Đông trùng Hạ thảo Cordyceps gunnii (Berk) vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, Bộ NN & PTNT, 4: 96-99 Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân (2011) Thành phần loài nấm ký sinh côn trùng vườn Quốc gia Pù Mát, Nghệ An Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nơng thơn, Bộ NN & PTNT, 22: 97-102 Phạm Quang Thu, Nguyễn Mạnh Hà (2010) Phát nấm đông trùng hạ thảo Cordyceps takaomontana Yakushiji Kumazawa Việt Nam Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 06: 127-130 10 Phạm Thị Thùy (2004) Công nghệ sinh học Bảo vệ thực vật Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội 54 Luận văn thạc sỹ Sinh học 11 Tô Quang Huyên, Lê Thị Xuân (2012) Thành phần loài nấm ký sinh trùng khu rừng di tích lịch sử cảnh quan môi trường Mường Phăng huyện Điện Biên, tỉnh Điện Biên Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp 12 Trần Ngọc Lân (2008) Đa dạng sinh học nấm ký sinh côn trùng vuồn Quốc Gia Pù Mát đành giá khả ký sinh số loài nấm loài sâu hại trồng Đề tài cấp Giáo dục đào tạo Mã số: B2007-27-25 13 Trần Ngọc Lân, Thái Thị Ngọc Lam, Nguyễn Thị Thúy, Trần Văn Cảnh, Nguyễn Thị Thu (2011) Nghiên cứu đặc điểm sinh học nấm ký sinh côn trùng Isaria tenuipes (Peck) Samson vườn Quốc gia Pù Mát khu bảo tồn thiên nhiên Pù Huống, Nghệ An Báo cáo hội nghị khoa học toàn quốc Sinh thái Tài nguyên Sinh vật, lần thứ 4: 1185 – 1191 14 Trần Văn Mão (2002) Sử dụng côn trùng vi sinh vật có ích, tập Nxb Nông nghiệp, Hà Nội 15 Trịnh Tam Kiệt (1996), “Danh mục loài nấm lớn Việt Nam” Nhà Xuất Nông Nghiệp, Hà Nội 16 Trịnh Tam Kiệt, Đặng Vũ Thanh, Hà Minh Trung (2001) Lớp Ascomycetes, Danh mục lồi thực vật Việt Nam Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội 17 Trịnh Thị Xuân, Trần Văn Hai Bùi Xuân Hùng Trường, Đặng Thị Cúc Huỳnh Thanh (2009) Ứng dụng chế phấm nấm xanh Metarhizium anisopliae phòng trừ rầy nâu hại lúa tỉnh Sóc Trăng Thơng tin Khoa học Cơng nghệ Sóc Trăng, 3/2009 Tài liệu tiếng Anh 18 Aphidech Sangdee and Kusavadee Sangdee (2013) Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand African Journal of Microbiology Research, 7(2): 137-146 19 Bhushan Shrestha, Won-Ho Lee, Sang-Kuk Han and Jae-Mo Sung (2006) Observations on Some of the Mycelial Growth and Pigmentation Characteristics of Cordyceps militaris Isolates Entomopathogenic Fungal Culture Collection (EFCC): Mycobiology 34(2): 83-91 55 Luận văn thạc sỹ Sinh học 20 Bunyapaiboonsri T, Yoiprommarat S, Intereya K, Rachtawee P, Hywel-Jones NL, Isaka M (2009) Isariotins E and F, spirocyclic and bicyclic hemiacetals from the entomopathogenic fungus Isaria tenuipes BCC 12625 J Nat Prod 72(4): 756-759 21 Dong C.H., Yao Y.J (2005) Nutritional requirements of mycelial growth of Cordyceps sinensis in submerged culture Journal of Applied Microbiology 99: 483492 22 Gi-Ho Sung, Nigel L Hywel-Jones, Jae-Mo Sung, J Jennifer Luangsa-ard, Bhushan Shrestha and Joseph W Spatafora (2007) Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi Studies in Mycology, (57): 5–59 23 Gu YX, Wang ZS, Li SX, Yuan QS (2007) Effect of multiple factors on accumulation of nucleosides and bases in Cordyceps militaris Food Chem., 102: 13041309 24 Guo C, Zhu J, Zhang C, Zhang LJ (1998) Determination of adenosine and 3'deoxyadenosine in Cordyceps militaris (L.) Link by HPLC J.Chinese Med., 23: 236237 25 Guo FQ, Li A, Huang LF, Liang YZ, Chen BM (2006) Identification and determination of nucleosides in Cordyceps sinensis and its substitutes by high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection J Pharmaceut Biomed., 40: 623-630 26 Hung LT, Keawsompong S, Hanh VT, Sivichai S, Hywel-Jones NL (2009) Effect of temperature on cordycepin production in Cordyceps militaris Thai J Agric Sci., 42(4): 219-225 27 In-PyHong et al Synema production by isariatenuipes using Corlloed cocoon Silk Worm, Golden Silk Int J Indust.(1): 1-4 28 Kobayashi Y., (1982) Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Toruiella Trans Mycol Soc Jpn., 23: 329-364 29 Laurentia Lellia MiHai, Ioanina Parlatescu, Carmen Larisa Gheorghe, Luminita Lazar, Edwin Sever Bechir, Mircea Suciu, Grigore Lazarescu (2015) Biochemical effects on Adenosine in the treatment of Oral Acute Ulcers REV CHIM (Bucharest), 6(8): 1190 – 1192 56 Luận văn thạc sỹ Sinh học 30 Lee H., Kim Y J., Kim H W., Lee D H., Sung M K., Park T (2006) Introduce off apoptosis by Cordyceps Militaris though actication off caspase-3 leukemia HL-60 cels Biol.Pharm.Bull, (29): 670-674 31 Lei Huang, Qizhang Li, Yiyuan Chen, Xuefei Wang and Xuanwei Zhou (2009) Determination and analysis of cordycepin and adenosine in the products of Cordyceps spp African Journal of Microbiology Research, 3(12): 957 - 961 32 Li Cui, Ming Sheng Dong, Xiao Hon chen, Mei Jiang, Xin Lv, Guijun Yan (2008) A novel fibrinolytic enzyme from Cordyceps militaris, a Chinese traditional medicinal mushroom.World J Microbiol biotechol, (24): 483 - 489 33 Li SP, Yang FQ, Tsim KW (2006) Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine J Pharmaceut Biomed., (41): 1571- 1584 34 Luangsa-ard J.J., Tasanathai K., Monkolsamrit S., and Hywel – Jones, N L (2007) Atlas of Invertebratepathogenic Fungi of Thailan, 1(82): 229-522 35 Mao X.L 2000 The macrofungi in China, Henam Technical and Science Publication House 36 Nam K.S., Jo Y.S., Kim Y.H., Hyun J.W., Kim H.W (2001) Cytotoxic activities of acetoxyscirpenediol and ergosterol peroxide from Paecilomyces tenuipes Life Sci., 69(2): 229-233 37 Nan J.X, Park E.J, Yang B.K, Song C.H, Ko G., Sohn D.H, (2001) Antibiotic effect of extra cellula biopolymer from submerged mycelial cultures of cordyceps militariss on liver fibrosis induced by bile cut ligation ans scission in rats Arch Phram.Rres (24): 327-322 38 Oh, G S., K H Hong, H O Pae, I K Kim, N Y Kim, T O Kwon, M K Shin and H T Chung (2001) 4-Acetyl-12,13-epoxy1-9-trichothecene-3,15-diol isolated from the fruiting bodies of Isaria japonica Yasuda induces apoptosis of human leukemia cell (HL-60) Bio Pharm Bull 24: 785-789 39 Peeters, H.; Zocher, R.; Madry, N.; Kleinkauf, H Incorporation of radioactive precursors into beauvericin produced by Paecilomyces fumoso-roseus, (22): 1719– 1720 40 Peng L, Song X, Shi X, Li J, Ye C (2008) An improved HPLC method for simultaneous determination of phenolic compounds, purine alkaloids and theanine in Camellia species J Food Compos Anals., 21:559-563 57 Luận văn thạc sỹ Sinh học 41 Pramer D (1965) Fungal Parasites of Insects and Nematodes Bacteriological Review, (29): 382 – 387 42 Qinggui Wang and Lijian Xu (2012) Beauvericin, a bioactive compound produced by fungi: short review Molecules., 17(3): 2367-2377 43 Rupesh Kumar Arora, Nimisha, and R.P.Singh (2013) Characteriziation of an Entomophagous medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc of Uttarakhand, India The bioscan 8(1): 195-200 44 Samson, R.A., and H.C Evans (1982) Two new Beauveria spp from South America Journal of Invertebrate Pathology, 39(1): 93-97 45 Samson, R.A., H.C Evans, and J.P Latgé (1988) Atlas of Entomopathogenic Fungi Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, New York 187pp 46 Shih IL, Tsai KL, Hsieh C (2007) Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of Cordyceps militaris Biochem Eng J., 33: 193-201 47 Shin C.G., An D.G., Song H.H., Lee C (2009) Beauvericin and enniatins H, I and MK1688 are new potent inhibitors of human immunodeficiency virus type-1 integrase J Antibiot, (62): 687–690 48 Shoemake R.H, Scudiero D.A, Suasville.E.A (2002) Application of highthroughput, molecular – targeted screening to anticancer drug discovery Curr Top Med Chem 2(3): 229 – 246 49 Sun HC, Jong CK, Jung SL, Chul SY, Jong HK, Hyo IC, Seung WK (2006) Morphological chaharacteristic of Cordyceps sinensis 16 and production of mycelia and exo-biopolyner from molasses in submerged culter Journal of industrial and Engineering Chemisstry, 12(1): 115 -120 50 Sung Hak Lee, Hwang H.S., Yun J.W (2009) Antitumor activity of water extract of a mushroom, Inonotus obliquus, against HT-29 human colon cancer cells Phytother Res, 23(12): 1784-1789 51 Sung Jae Mo (2000) Insect – born fungus of Korea Kangwon National University, Korea 52 Sung G H (2007) Phylogenetic classification of Cordyceps and the clavicipitaceous fungi Studies in Mycology (57): 55–59 58 Luận văn thạc sỹ Sinh học 53 Thungrabeab M and Tongma S (2007) Effect of entomopathogenic fungi, Beauveria bassiana (Balsam) and Metarhizium anisopliae (Metsch) on non target insects, KMITL Science technology 54 Tsuguo Hongo Masana Izawa, 1994, Mushroom in Japan, Yama – Kei Publisher, Japan 55 Wang Y, Guo Y, Zhang L, Wu J (2012) Characterizations of a new Cordyceps cicadae isolate and production of adenosine and cordycepin Braz J Microbiol: 449455 56 Won S.Y and Park E.H (2005) Anti-inflammatory and related pharmacological activities of cultured mycelia and fruiting bodies of Cordyceps militaris J Ethnopharmacol., 96: 555- 561 59