MỞ ĐẦU Việt Nam quốc gia ven biển nằm bên bờ Tây Biển Đơng, có địa trị địa kinh tế quan trọng quốc gia có Với bờ biển dài 3.260 km trải dài từ Bắc xuống Nam, đứng thứ 27 số 157 quốc gia ven biển, quốc đảo lãnh thổ giới Chỉ số chiều dài bờ biển diện tích đất liền nước ta xấp xỉ 0,01 (nghĩa 100 km2 đất liền có 1km bờ biển) Trong 63 tỉnh, thành phố nước 28 tỉnh, thành phố có biển gần nửa dân số sinh sống tỉnh, thành ven biển Các nghiên cứu trước cho thấy, vùng biển nước ta số vùng biển có hệ đa dạng sinh học phong phú Đồng thời, VSV biển có phân bố dồi đa dạng, nhiên nay, nước ta chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu hợp chất thứ cấp sinh tổng hợp từ VSV biển Ngược lại, việc nghiên cứu hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học sản sinh từ VSV biển giới thu nhiều thành tựu đáng kể, nhiều hợp chất thứ cấp với cấu trúc hóa học hoạt tính sinh học lý thú phát Đồng thời nhiều hợp chất số thử nghiệm sâu nhằm ứng dụng y dược Nhiều loại kháng sinh chiết xuất từ nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn, mà xạ khuẩn chiếm phần lớn có xạ khuẩn biển Do đại dương chiếm 70% diện tích bề mặt trái đất, nơi có đa dạng sinh học lớn trái đất Vì mơi trường biển biết đến nguồn phong phú cung cấp hợp chất thiên nhiên, kho dược liệu khổng lồ chờ khai thác khám phá Đặc thù mơi trường sống khắc nghiệt biển sâu điều kiện để hình thành hợp chất hữu với đặc điểm cấu trúc hóa học độc đáo hoạt tính sinh học quý giá Hơn nữa, ngày nhiều VSV gây bệnh có vi khuẩn lao kháng với kháng sinh có bệnh ung thư Do đó, cơng tìm kiếm loại thuốc chống lao, ung thư bệnh truyền nhi m khác v n vấn đề mang tính cấp bách tồn cầu Vì thực luận án với mục đích: “Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất ngoại bào xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Đông Bắc miền Trung Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án: - Nghiên cứu hoạt tính sinh học số hợp chất ngoại bào xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Đông Bắc miền Trung Việt Nam - Tìm kiếm chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao từ nguồn xạ khuẩn biển thông qua đánh giá sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, kháng lao gây độc tế bào Những đóng góp luận án - Từ 140 m u vật thu thập từ số vùng biển Việt Nam, 130 chủng vi sinh vật phân lập - Sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ (6 chủng vi khuẩn chủng nấm) kháng lao (H37Rv) cặn chiết chủng xạ khuẩn phân lập cho thấy 105/ 130 chủng thể hoạt tính kháng chủng VSVKĐ, chủng thể hoạt tính kháng lao - Đã lựa chọn xác định tên khoa học mười chủng có hoạt tính cao giải trình tự gen 16S rRNA Trong chủng G017, G019, G043, G044, G047, G068, G120 thuộc chi Micromonospora, chủng G039, G065 thuộc chi Stretomyces, chủng G057 thuộc chi Nocardiopsis - Dịch lên men chủng có hoạt tính cao nghiên cứu thành phần hóa học phương pháp sắc ký Đã xác định 44 hợp chất Tai Lieu Chat Luong Trong số 44 hợp chất tách chiết xác định cấu trúc hóa học, xác định hợp chất 3,4-dihydroxy-6,7-dimethyl-quinoline-2-carboxylic (G019-1), 2-[(5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy]ethanol (G019-2), 2-[(2Rhydroxypropanoyl)amino]benzamide (G057-1), chất lần tách chiết từ tự nhiên 3,3’-bis-indole (G057-2), 3-acetyl-4-hydroxycinnoline (G0573) hoạt chất bis(2-ethylhexyl) adipate (G043-12) có hoạt tính kháng lao CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN Phần tổng quan liệu tổng hợp nghiên cứu nước nước đề cập đến vấn đề sau: 1.1 Đa dạng vi sinh vật biển 1.2 Sự hình thành chất kháng sinh xạ khuẩn 1.3 Xạ khuẩn biển 1.3.1 Họ Streptomycetaceae: 1.3.2 Họ Micromonosporaceae: 1.3.3 Các họ khác xạ khuẩn biển 1.4 Hoạt hính sinh học xạ khuẩn biển 1.4.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Hoạt tính kháng lao Hoạt tính kháng sinh Hoạt tính chống ung thư 1.4.2 Tình hình nghiên cứu nước CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu - Tổng số m u thu thập 140 m u, có: 76 m u Vịnh Bái Tử Long, 29 m u Đảo Cô Tô – Thanh Lân , m u trầm tích Hạ Long - Cát Bà, 10 m u Hải miên Hải Vân – Sơn Chà 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa lưu giữ tiêu Viện Hóa sinh biển, Viện Tài ngun mơi trường biển Hải Phịng PGS.TS Đỗ Công Thung định tên - Cặp mồi dùng để khuếch đại gen 16s rARN xạ khuẩn - Các chủng vi sinh vật kiểm định chuẩn quốc tế: chủng vi khuẩn Gram – (Escherichia coli ATCC25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, S enterica ATCC12228), chủng Gram + (E faecalis ATCC13124, Stapphylococus aureus ATCC25923, Bacillus cereus ATCC 13245), chủng Nấm men Candida albicans ATCC10231 cung cấp viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia - Các dòng tế bào ung thư người cung cấp ATCC gồm: KB - ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 - ung thư vú (HTB – 22TM) LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) cung cấp đại học UIC – Hoa Kỳ - Chủng vi khuẩn lao H37Rv (ATCC 27294, American Type Culture Colection, Rockville, MD) cung cấp đại học UIC – Hoa Kỳ 2.1.2 Hóa chất: Các hóa chất dùng cho nghiên cứu vi sinh vật biển tách chiết hợp chất thứ cấp mua hãng uy tín Đức, Ý, Ấn độ 2.1.3 Thiết bị: Máy móc thiết bị sử dụng nghiên cứu vi sinh bao gồm : Máy sốc nhiệt; máy vortex; máy khuấy từ ; tủ cấy an toàn sinh học Class II; tủ nuôi cấy; máy ly tâm Centrifuge 5430; cân phân tích; máy PCR Mygenie 96 Thermal Block; máy điện di; máy lắc; tủ lạnh -80 oC -20 oC; máy khử trùng; thiết bị lặn Scuba, thuyền đánh cá loại vừa, thiết bị lấy m u thông thường cuốc, tời, máy đo tọa độ, máy đo độ sâu;kính hiển vi điện tử quét SEM; máy quang phổ Hewlett Packard; máy đo phổ hồng ngoại FTIR-Impact-410; máy đo phổ khối Quardrupole LC MS- Agilent Technologes theo kiểu phun mù điện tử (ESI); máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Brucker Avance 500 (500 MHz), sử dụng TMS làm chất chuẩn; máy độ quay cực Tasco P-2000; máy đo điểm nóng chảy Mel Temp 3.0 nước Mỹ Châu Âu Các dụng cụ dùng nghiên cứu vi sinh thông thường như: que cấy (Đức); đĩa pepri (Đức, Ý); bình tam giác; que ria; que trang (Đức); Ống eppendof 1.5 ml; ml; 15 ml; 50 ml; đầu típ loại: 10, 100, 200, 1000 µl; Bình tam giác loại dung tích từ 125 ml – 5000 ml 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu 2.2.2 Phương pháp phân lập chủng xạ khuẩn biển 2.2.3 Phương pháp làm chủng que cấy vòng 2.2.4 Phương pháp giữ giống xạ khuẩn sau phân lập 2.2.5 Phương pháp hoạt hố ni cấy 2.2.6 Phương pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy để sàng lọc hoạt tính sinh học 2.2.7 Phương pháp định danh chủng xạ khuẩn nghiên cứu 2.2.8 Phương pháp sinh khối lượng lớn 2.2.9 Phương pháp tách chiết hợp chất thứ cấp, định lượng hợp chất 2.2.10 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất tách chiết 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính kháng VSVKĐ 2.2.12 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào 2.2.13 Phương pháp thử hoạt tính kháng lao CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết thu mẫu: Thu thập 140 m u, có: 76 m u Vịnh Bái Tử Long, 29 m u Đảo Cô Tô – Thanh Lân , m u trầm tích Hạ Long - Cát Bà, 10 m u Hải miên Hải Vân – Sơn Chà 16 m u Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa Các m u lấy tọa độ độ sâu khác 3.2 Kết phân lập chủng xạ khuẩn: Từ 140 m u nuôi cấy môi trường khác (M1, NZSG, ISP1, ISP2, A1, SWA), chọn 130 chủng xạ khuẩn Đa số chủng mọc môi trường A1 M1 Các chủng phát triển tốt mơi trường A1 Vì chúng tơi chọn môi trường A1 để nuôi cấy giữ chủng A1+ 10% glycerol – 80oC 3.3 Khảo sát hoạt tính sinh học chủng phân lập đƣợc Kết thử hoạt tính kháng VSVKĐ với cặn thơ thu 105 130 chủng phân lập có tính kháng chủng VSVKĐ 80,8%, có 29 130 chủng phân lập có hoạt tính kháng từ chủng VSV kiểm định trở lên, chiếm 22,3% 59 130 chủng có hoạt tính kháng nấm chiếm 45,4% Ngồi ra, có 11 130 chủng phân lập có hoạt tính kháng VSVKĐ Gram âm, chiếm 8,5% Đặc biệt, chủng G002, G004, G026, G057, G119, G120, G124, G126,G039,G065, LC09 LC19 thể hoạt tính phổ rộng vi khuẩn vi khuẩn Gram (+),vi khuẩn Gram (-) nấm Các cặn chiết chủng xạ khuẩn phân lập được khảo sát sàng lọc hoạt tính kháng lao Kết khảo sát cho thấy số chủng thử nghiệm, có chủng G017, G019 G043 thể hoạt tính Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC 21, 25 18 μg ml Từ kết sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ hoạt tính kháng lao, luận án lựa chọn 10 chủng xạ khuẩn có hoạt tính tốt để thực nghiên cứu 3.4 Kết định danh 10 chủng xạ khuẩn có hoạt tính 3.4.1 Quan sát đặc điểm hình thái chủng nghiên cứu Các chủng nghiên cứu nuôi cấy 14 ngày 30 ºC mơi trường thạch (ISP2) Kết quan sát hình thái cho thấy sợi khuẩn ty chất phát triển tốt chất môi trường, sợi khuẩn ty khí sinh mọc yếu Màu sắc sợi khí sinh phong phú, màu vàng, trắng sang màu cam sống động từ nâu đen sang màu đen sau hình thành bào tử (Hình 3.13) Thêm vào việc quan sát kính hiển vi điện tử SEM, bào tử sinh đơn lẻ có đường kính khoảng 0,5-1 µm Các bào tử dạng nốt mịn bề mặt khơng di chuyển (xem Hình 3.13) Các hình thái bào tử coi đặc điểm quan trọng việc định lồi xạ khuẩn Hình 3.13 Hình ảnh khuẩn lạc đĩa thạch bào tử kính hiển vi điện tử quét (SEM) tương ứng 10 chủng nghiên cứu 3.4.2 Nhân gen 16S rRNA Từ DNA genom 10 chủng nghiên cứu, sử dụng cặp mồi 16SF,16SR, tiến hành PCR nhân đoạn gen 16S rRNA , với chu trình nhiệt: Nhiệt độ Thời gian (phút) 94oC 94oC (30 cycles) 46oC 72oC 1,5 72oC 4o C Với cặp mồi thiết kế dựa trình tự bảo thủ gen 16S rRNA xạ khuẩn khuôn DNA genom theo lý thuyết sản phẩm PCR có độ dài xấp xỉ 1500 bp (Hình 3.14) M 10 Ghi chú: Giếng M: thang DNA chuẩn Thermo 250bp; Giếng 1- 10 sản phẩm PCR theo thứ tự chủng G017, G019, G039, G043, G044, G047, G057, G065, G068 G120 Hình 3.14 Điện di đồ sản phẩm PCR gen 16S rRNA 10 chủng nghiên cứu 3.4.3 Giải trình tự gen dựng phân loại chủng 12 HF674982 Micromonospora sp S6 Egypt JX503975 Micromonospora sp PVA 112-08 Norway 17 KR906525Micromonosporasp.HBUM179191China 97 KF678405 Micromonospora sp NEAU-GLH9 China 46 22 KF793800 Micromonospora sp SW3 Tunisia G068 CO TO THANH LAN VN 55 GU002092 Micromonospora sp FXJ6.144 China 97 31 EU437824 Micromonospora sp 206203 China G043 CO TO THANH LAN VN GQ339909Micromonosporasp.JSM5-1Thailan 92 G044 CO TO THANH LAN VN 21 94 AY040625Micromonosporasp.CNH394USA 12 G047 CO TO THANH LAN VN 10 GQ339909 Micromonospora sp JSM5-1 Thailand EU714258Micromonosporasp.R1Mexico FJ263420Micromonosporasp.213425China HF674981Micromonosporasp.S12Egypt 99 KM456226Micromonosporasp.MSSRFM60India KM456224Micromonosporasp.MSSRFM95India 34 EU437804Micromonosporasp.202203China G019 HA LONG CAT BA VN KP339505Micromonosporasp.S7-SC13Thailand KM456224Micromonosporasp.MSSRFM95India G017 HA LONG CAT BA VN 33 KM456225Micromonosporasp.MSSRFM107India G039 Ha Long Cat Ba VN EU214935 Streptomyces sp CNQ-153 SD01 USA 100 JQ670764 Streptomyces sp 135001 China HQ873939 Streptomyces sp AML828 Mexico 97 G065 VAN PHONG VN 100 34 GU808333 Streptomyces sp VITTK3 India AY336514Nocardiopsissp.20039China G057 CO TO THANH LAN VN 100 90 KM886195Nocardiopsissp.13-33-8China G120 BAI TU LONG VN Hình 3.15 Cây phát sinh lồi dựa trình tự gen 16S rRNA chủng nghiên cứu Cây phát sinh lồi dựa trình tự gen 16S rRNA hồn chỉnh cho thấy mối quan hệ chủng nghiên cứu với thành viên đại diện chi Micromonospora sp., Stretomyces sp., Nocardiopsis sp Nghiên cứu quan hệ chủng phát sinh lồi (Hình 3.15) cho thấy: Chủng G017, G019,G043, G044, G047, G068, G120 có mối quan hệ gần gũi với chủng thuộc chi Micromonospora sp., chủng G039, G065 thuộc chi Stretomyces sp., chủng G057 thuộc chi Nocardiopsis sp Trong số chủng thể hoạt tính kháng VSVKĐ kháng lao, chủng (G019, G043, G057, G065 G120) lựa chọn sinh khối lượng lớn (30 l) tiến hành nghiên cứu hợp chất thứ cấp 3.5 Kết sinh khối lƣợng lớn chủng có hoạt tính cao Tiến hành thao tác nêu phần phương pháp, đĩa cấy nuôi tủ ấm 28oC, sau ngày kiểm tra độ khiết khuẩn lạc Khuẩn lạc chủng lựa chọn có màu sắc, bề mặt, hình dạng đặc trưng, khơng có màu sắc sắc tố lạ Tiến hành nhân giống cấp 1: Dùng que cấy lấy số khuẩn lạc riêng rẽ cấy vào bình tam giác 125 ml chứa 10 ml môi trường A1 Nuôi lắc (200 vịng phút) 28oC ngày, sau nhân giống cấp 2: Chuyển 10 ml dịch nuôi giống cấp vào bình tam giác 1000 ml chứa 500 ml môi trường A1 (với tỉ lệ bổ sung giống 2%), chế độ nuôi tương tự nhân giống cấp (Hình 3.16) Hình 3.16 Hình ảnh hoạt hố nhân giống cấp chủng nghiên cứu Tiến hành lên men 30 lít cho chủng: Chuẩn bị 30 bình tam giác 2800 ml có chứa sẵn 1000 ml môi trường A1+, khử trùng để nguội Bổ sung bình 20ml dịch nhân giống cấp (với tỉ lệ bổ sung giống 2%) Sinh khối với điều kiện trình bày (Bảng 3.10), sau - 14 ngày thu hồi sản phẩm (Hình 3.17) Hình 3.17 Hình ảnh nhân giống cấp sinh khối 30 lít 1chủng Bảng 3.10 Điều kiện ni cấy lượng lớn chủng nghiên cứu STT Ký hiệu Tên định danh Điều kiện nuôi cấy Thời gian lên men ngày, nhiệt độ 28 o C tốc độ lắc 200 vòng phút Thời gian lên men ngày, nhiệt độ 28 oCG043 Micromonospora sp G043 30oC, tốc độ lắc 200 vòng phút Thời gian lên men ngày, nhiệt độ 28 G057 Nocardiopsis sp G057 o C tốc độ lắc 200 vòng phút Thời gian lên men 10 ngày, nhiệt độ 28 oCG065 Streptomyces sp G065 30oC, tốc độ lắc 200 vòng phút Thời gian lên men 14 ngày, nhiệt độ 28 oCG120 Micromonospora sp G120 30oC, tốc độ lắc 200 vòng phút 3.6 Tách chiết xác định cấu trúc hóa học hợp chất thứ cấp 36.1 Các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Micromonospora sp G019 Quá trình chiết xuất tách chiết hợp chất thứ cấp từ chủng Micromonospora sp G019 thực phương pháp sắc ký Từ cặn chiết từ dịch lên men, 10 hợp chất ký hiệu từ G019-1 đến G019-10 thu Cấu trúc hóa học hợp chất xác định phương pháp phổ, đặc biệt phổ MS NMR Hợp chất 3,4-Dihydroxy-6,7-dimethyl -quinolin-2-carboxylic (G019-1) Hợp chất G019-1 thu dạng chất rắn màu vàng Phổ khối phân giải cao HRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z234,0761 [M+H]+ (tính toán cho CTPT C12H11NO4 m/z 234,0766), cho phép xác định công thức phân tử C16H11NO4 Trên phổ 1H- NMR cho tín hiệu nhóm metin vịng thơm dạng singlet δH 7,89 (1H, s, H-5) 7,68 (1H, s, H-8) , nhóm metyl δH 2,45 (3H, s, CH3-10) 2,48 (3H, s, CH3-11) Dựa vào phổ 13C- NMR, DEPT HSQC cho phép xác định hợp chất G019-1 có 12 nguyên tử cacbon có nhóm metyl δC 19,4 (CH3-10) 20,0 (CH3-11), nhóm cacbonyl δC 160,5 (COOH) cacbon vòng thơm δC 125,8 (C-8), 128,6 (C-5), 129,8 (C-4a), 138,5 (C-8a), 144,8 (C-7), 146,3 (C-2) 149,9 (C-3) Độ chuyển dịch hóa học cacbon bậc phía trường thấp C-8a, C-2, C-3 C-4 cho phép xác định cacbon liên kết với dị tố (nitơ oxy) Các cacbon tương đồng hợp chất 3,4-dihydroxy-quinolin-2-carboxylic tách chiết từ số loài hải miên (Jayatilake GS et al., 1996; Wang L et al., 2012) (xem Bảng 3.1) Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR hợp chất (G019-1) (DMSO, H: 500.13 MHz, 13C: 125.76 MHz) C C C H, mult J (Hz) C H, mult J (Hz) 149,9 4a 129,8 146,3 8a 138,5 128,7 7,89 (s, 1H) CH3-10 19,4 2,46 (s, 3H) 144,8 CH3-11 20,0 2,48 (s, 3H) 139,0 COOH 160,5 125,8 7,68 (s, 1H) G019 Micromonospora sp G019 Phổ HMBC (hình 3.20-3.21 bảng 2.1 phụ lục 3) cho tương tác xa proton nhóm CH3 δH 2,45 (CH3-10) với C-6, C-5, C-7 cho phép xác định nhóm metyl gắn với cacbon C-6 Tương tác xa proton nhóm CH3 δH 2,48 (CH3-11) với C-6, C-7, C-8 cho phép xác định nhóm metyl gắn với cacbon C-7 Ngoài tương tác H5 với C-4 C-8a cho phép xác định liên kết C-4a với C-4, C-5 C-8a Kết hợp kiện phổ MS, 1D- NMR 2D- NMR cho phép xác định chất G019-1 3,4-dihydroxy-6,7-dimethyl-quinolin-2-carboxylic Đây hợp chất Cấu trúc hóa học hợp chất G019-1 Hợp chất 2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol (G019-2) Chất G019-2 thu dạng chất dầu không màu Phổ khối phân giải cao HRESI-MS cho pic ion hóa giả phân tử m/z199,0946 [M+Na]+ (theo tính tốn lý thuyết cho CTPT C8H16NaO4 m/z 199,0941), cho phép xác định công thức phân tử C8H16O4 Phổ 13C- NMR DEPT cho thấy phân tử có nguyên tử cacbon, có nhóm metin lai hóa sp3 δC 71,2 (C-2); 75,5 (C-5), nhóm metylen 69,2 (C3), 71,2 (C-10), 71,4 (C-9), 71.5 (C-7) 75,7 (C-6) nhóm metyl δC 17,7 Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu nhóm metyl δH 1,10 (d, J= 6,5 Hz, 3H, CH3-11) 12 proton nằm khoảng δH 3,35 – 3,63 Độ chuyển dịch hóa học nhóm metin metylen phổ 1H- NMR 13C- NMR cho phép xác định tất nhóm gắn với oxy (xem Bảng 3.2) Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR hợp chất G019-2 (CD3)2CO, H: 500.13 MHz, 13C: 125.76 MHz) Cno C (ppm) 71,2 69,2 75,5 75,7 1’ 71,5 3’ 4’ CH3-5 71.4 71,2 17,7 H(ppm), J (Hz) 3,59 (m, 1H) 3,63 (m, 2H) 3,62 (m, 1H) 3,35 (dd, J= 5,0; 10,0 Hz,1H) 3,47 (dd, J= 6,0; 10,0 Hz,1H) 3,56 (m, 1H) 3,58 (m, 1H) 3,59 (m, 2H) 3,59 (m, 2H) 1,10 (d, J= 6,5 Hz, 3H) Phổ HMBC cho tương tác xa proton δH 3,35 and 3,47 (CH2-6) với C2 tương tác proton nhóm CH2-3 3,63 với C-5 cho phép xác định vịng 1,4dioxane Tương tác xa nhóm metyl với C-5 C-6 tương tác nhóm metylen CH2-9 với C-7, tương tác CH2-7 với C-3 cho phép xác định nhóm metyl gắn vị trí C-5 nhóm etylen glycol gắn với C-7 qua nguyên tử oxy Hai proton nhóm CH2-6 cho tương tác lớn (J=10,0 Hz) tương tác nhỏ (J = 5,0 6,0 Hz) Tương tác lớn J=10,0 Hz xác định tương tác germinal proton CH2-6 Hai tương tác nhỏ không đặc trưng cho tương tác anti hay gauche Mặt khác, tín hiệu chồng lấp nên cấu hình tương đối C-2 C-5 không xác định cách rõ ràng Từ liệu phổ 1H- NMR, 13C- NMR, HSQC, HMBC, cho phép xác định chất G019-2 2-((-5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy)ethanol Hợp chất lần cơng bố Cấu trúc hóa học hợp chất G019-2 Hợp chất N-(4-hydroxyphenylethyl)propionamide (G019-3) hợp chất N-(4-hydroxyphenylethyl)acetamide (G019-4) Chất G019-3 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ ESI MS chất G019-3 xuất pic ion giả phân tử m/z 194[M+H]+ Phổ 1H- NMR cho tín hiệu proton vịng thơm hệ A2B2 δH 6,73 (2H, d, J=7,0 Hz, H-3, H-5), 7,04 (2H, d, J=7,0 Hz, H-2, H-6), nhóm methylen δH 2,18 (2H, q, J=7,5 Hz, CH2CH3), 2,70 (2H, t, J=7,5 Hz, CH2-Ar), 3,32 (m, -CH2-N) nhóm metyl có δH 1,11 (t, J=7,5 Hz, CH2CH3) Phổ 13C- NMR DEPT G019-3 cho tín hiệu 11 nguyên tử cacbon có nhóm carbonyl δC 177,0, metin vịng thơm, nhóm metyl, nhóm metylen, nhóm metylen gắn với nitơ δC 42,2 cacbon bậc bốn lai hóa sp2 δC 131,3 (C-1) 156,9 (C-4) Độ chuyển dịch hóa học C-1 δC 131,3 cho phép xác định cacbon gắn với oxy Sự xuất nhóm amide khẳng định tương tác phổ HMBC protons CH2-2’ (δH 3,32) với cacbon carbonyl δC 177,0 (C-4’) Kết hợp liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G019-3là N-(4-hydroxyphenylethyl)propionamide Chất G019-4 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS (negative) xuất pic ion phân tử deproton hóa m/z 178,1 [M-H]- Số liệu phổ NMR chất G019-4 tương tự phổ chất G019-3 So sánh khác phổ hai hợp chất thấy xuất nhóm acetyl thay nhóm propionyl Các liệu phổ NMR G019-4 phù hợp liệu phổ chất N-(4-hydroxyphenylethyl)-acetamide Hợp chất có khả ức chế enzim aldose reductase với giá trị IC50 1,6×10-4M Hợp chất Adenine (G019-5), hợp chất 2’-deoxyadenosine (G019-7) hợp chất Adenosine (G019-8) Phổ khối ESI G019-5 xuất pic ion giả phân tử m/z 136,1 [M+H]+ Trên phổ 1H- NMR G019-5 thấy xuất tín hiệu proton vòng thơm δH 8,13 (1H, s, H-8), 8,20 (1H, s, H-2) Phân tích số liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G019-5 adenine Chất G019-7 thu dạng chất rắn không màu Phổ ESI MS G0197cho pic ion phân tử proton hóa m/z 252,1 [M+H]+ Phổ 1D- NMR (1H 13C) G019-7thấy xuất tín hiệu của2 nửa 2-deoxy-arabionoside cấu tạo G019-6 Tuy nhiên, vùng trường thơm, chất G019-7 cịncó tín hiệu proton cacbon adenine [δC 120,8 (C-5), δC 141,5, δH 8,20 (CH-8), δC 149,9 (C-4), δC 153,6 δH 8,34 (CH-2) δC 157,5 (C-6)] Phân tích chi tiết liệu phổ MS, NMR cho phép xác định hợp chất G019-7là 2'-deoxyadenosine Chất G019-8 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ ESI MS G019-7 pic ion giả phân tử m/z 268,1 [M+H]+ Phổ 1D NMR G019-8 có tín hiệu gần giống với tín hiệu G019-7, ngoại trừ có mặt oxymethine G019-8 thay methylene G019-7 Hơn nữa, proton H-1’ xuất dạng doublet phổ 1H NMR G019-8 Trong đó, proton xuất dạng double doublet phổ 1H NMR G019-7 Điều cho phép giả thiết chất G019-8 adenosine Dữ liệu phổ NMR trùng với báo cáo trước adenosine Cấu trúc hóa học G019-5, G019-7 G019-8 Hợp chất 2’-deoxythymidine (G019-6), hợp chất 2’-deoxyuridine (G019-9) hợp chất Uridine (G019-10) Phổ khối ESI G019-6 xuất pic ion giả phân tử m/z 243.1 [M+H]+ Trên phổ 1H- NMR G019-6 thấy xuất tín hiệu proton olefin δH 7,83 (s, H6), nhóm methyl δH 1,90 (s, CH3-7) dải proton aliphatic δH 2,27 (2H, m, H-2’), 3,75 (1H, dd, J=3,5, 12.0 Hz, Ha-5’), 3,82 (1H, dd, J=3,0, 12,0 Hz, Hb-5’), 3,93 (1H, m, H-4’), 4,42 (1H, m, H-3’), 6,30 (1H, t, J=7,0 Hz, H-1’) Phổ 13C- NMR DEPT G019-6 có 10 carbon vịng thơm, có nhóm carbonyl δC152,4 (C2), 166,4 (C-4), nhóm metin sp2 δC138,2 (C-6), carbon bậc δC 111,5 (C5), nhóm metyl δC12,4 (CH3-7), hai nhóm metylen δC 41,2 (C-2’) 62,8 (C-5’) nhóm metin δC 73,1 (C-3’), 87,1 (C-4’) 89,9 (C-1’) Độ chuyển dịch hóa học CH-3’, CH-4’ CH2-5’ nguyên tố có liên kết với oxy, mặt khác CH-1’ có khă liên kết với nitơ oxy Phân tích số liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G019-6 2’-deoxythymidine Chất G019-9 thu dạng chất rắn màu vàng nhạt Phổ ESI MS G0199xuất pic ion giả phân tử m/z 229,1 [M+H]+ Phổ1D NMR G019-9 cho tín hiệu phần đường 2-deoxy-arabionoside giống chất G019-6 G019-7 Trong vùng trường thấp có tín hiệu doublet 5,72 (1H, d, J=8,0 Hz, H-5) 7,99 (1H, d, J=8,0 Hz, H-6) Phổ 13C- NMR, DEPT G019-9 cho tín hiệu nhóm carbonyl 152,2 (C2) 166,6 (C-4), nhóm metin sp2, nhóm metylen, nhóm oxymetin Phân tích số liệu phổ MS, NMR cho phép xác định G019-9 2’-deoxyuridine Phổ ESI MS chất G019-10 xuất pic ion giả phân tử m/z 245,1 [M+H]+ Phổ H-NMR G019-10 cho tín hiệu gần giống với chất G019-9 Sự khác biệt hai hợp chất diện phân đường arabionoside thay 2-deoxy-arabionoside G019-9, vắng mặt tín hiệu methylene thay vào nhóm oxymethine Như vậy, hợp chất G019-10 xác định uridine Cấu trúc hóa học G019-6, G019-9 G019-10 3.7 Tách chiết xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Nocardiopsis sp G057 3.7.1 Cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng xạ khuẩn Nocardiopsis sp G057 Hợp chất 2-[(2R-hydroxypropanoyl)amino]benzamide (G057-1) Hợp chất G057-1 thu dạng chất rắn màu trắng, độ quay cực [α]D28 +21,2 (c 0,007, acetone) Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử 10 m/z 231,0730 [M+Na]+ (tính tốn cho CTPT C10H12N2NaO3 m/z 231,0746) Trên phổ 13 C- NMR cho thấy có mặt 10 nguyên tử cacbon có nhóm metin lai hóa sp3 δC 68,3 (C-2’), nhóm metyl δC 21,2 (CH3-3’), nhóm cacbonyl 170,8 (C-7); 174,7 (C-1’), cacbon vòng thơm có nhóm metin δC 120,4 (C-3), 132,4 (C-4), 123,2 (C-5), 128,8 (C-6) cacbon bậc Phổ 1H- NMR G057-1 đo CD3OD thấy xuất tín hiệu nhóm metin vịng thơm, nhóm metin sp3 nhóm metyl Giống đo CD3OD, phổ H- NMR G057-1 đo DMSO-d6 cho tín hiệu nhóm metin vịng thơm dạng 1,2-disubstituted δH 8,45 (1H, d, J=7,8 Hz, H-3), 7,46 (1H, dt, J= 1,5; 7,8 Hz, H-4), 7,11 (1H, t, J= 7,8 Hz, H-5), 7,70 (1H, dd, J=1,5; 7,8 Hz, H-6), nhóm metyl nhóm metin dạng A3X δH 1,28 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH3-3’), 4,09 (1H, q, J=7,0 Hz, H-2’), dựa vào độ chuyển dịch hóa học proton H-2’ cho phép dự đốn proton gắn với oxy Ngồi phổ 1H- NMR cịn có thêm tín hiệu proton (exchangeable) dạng singlet δH 11,88 (1H, s, NH), 8,13 (1H, br s, NH2-a), 7,05 (1H, br s, NH2-b), 6,05 (1H, br s, OH) x3m bảng 3.3 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR G057-1 (1H: 500 MHz, 13C: 125 MHz, DMSO-d6) C C C H mult (J in Hz) C H mult (J in Hz) 121,4 1’ 174,7 138,7 2’ 68,3 4,09 q (7,0) 120,4 8,45 d (7,8) 3’ 21,2 1,28 d (7,0) 132,4 7,46 dt (1,5, 7,8) OH 6,05 br, s 123,2 7,11 t (7,8) NH 11,88 s 128,8 7,70 dd (1,5, 7,8) NH2 7,05 br, s 8,13 br, s 170,8 Phổ HMBC cho tương tác xa proton nhóm NH với C-1’, C-3 cho phép xác định C-1’ gắn với C-2 vòng benzen qua nguyên tử nitơ Nhóm cacbonyl C-7 xác định gắn với C-1 vòng benzen dựa vào tương tác phổ HMBC H6 với C-7 Trên phổ HMBC cho tương tác xa nhóm metyl với cacbonyl C-1 proton oxymetin H-2’ với cacbonyl C-1 cho phép xác định liên kết C-3’ C2’ C-1’ OH OH O 1' O 2' NH NH 2' 1' 3' H 3' N O NH O Cấu trúc hóa học hợp chất G051-1 Các kiện phổ (UV, MS, NMR) xác nhận hợp chất G057-1 có cấu trúc phẳng xác định 2-[(2-hydroxypropanoyl)amino]benzamide Độ quay cực G057-1 [α]D +21,2 (c 0.007, acetone) ngược dấu với hợp chất 2-[(2Shydroxypropanoyl)amino]benzamide Dai đồng nghiệp tách chiết từ chủng Penicillium chrysogenum THOM (Dai MC, Tabacchi R, Satumin C., 1993) Do vậy, hợp chất G057-1 xác định đối quang 2-[(2S-hydroxypropanoyl) amino]benzamide Đây hợp chất xác định 2-[(2Rhydroxypropanoyl)amino]benzamide Tín hiệu nhóm NH phía trường thấp dạng singlet sắc nhọn δH 11,88 giả thiết liên kết hydro nội phân tử với nhóm cacbonyl C-7 11 Hợp chất 3,3’-Bis-indole(G057-2) Hợp chất G057-2 thu dạng chất rắn màu vàng Phổ khối phân giải cao HRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 233.1079 [M+H]+ (tính tốn cho CTPT C16H13N2 m/z 233,1086), cho phép xác định công thức phân tử C16H12N2 Trên phổ 1H- NMR cho tín hiệu nhóm metin vịng thơm dạng 1,2disubstituted δH 8,05 (d, J = 7,5 Hz, H-4/H-4’), 7.08 (t, J = 7,5 Hz, H-5/H-5’), 7,12 (t, J = 7,5 Hz, H-6/H-6’), 7,41 (d, J = 7,5 Hz, H-7/H-7’) proton dạng singlet δH 7,84 xem bảng 3.4 Bảng 3.4 Dữ liệu phổ NMR G057-2 (CDCl3) C C H mult (J in Hz) 2, 2' 131,2 7,84 s 3, 3' 110,8 3a, 3'a 126,6 4, 4' 121,2 8,05 d (7,5) 5, 5' 120,5 7,08 t (7,5) 6, 6' 121,8 7,12 t (7,5) 7, 7' 112,0 7,41 d (7,5) 7a, 7'a 136,5 Trên phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy có mặt nguyên tử cacbon có nhóm metin vịng thơm cacbon bậc 4, dựa vào độ chuyển dịch hóa học cho phép xác định cacbon bậc δCδC 136,5 nhóm metin 131,2 gắn với nitơ Từ liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C- NMR cho phép xác định hợp chất G057-2 có cấu trúc đối xứng hợp chất bis-indole Tương tác xa phổ HMBC H-4/H4’ với C-3/C-3’ (δC 110.8) H-2/H-2’ với C-3/C-3’ C-7a/C-7a cho phép ghép nối mảnh phân tử vòng benzen với vòng pyrole vị trí C-3a/C-3’a C-7a/C7’a Kết hợp liệu phổ MS, 1D- NMR 2D- NMR cho phép xác định chất G057-2 3,3’-bis-indole phụ lục 13 Đây hợp chất lần đầu tách chiết từ tự nhiên Hợp chất tổng hợp vào năm 1967 Cấu trúc hóa học hợp chất G057-2 Hợp chất 3-Acetyl-4-hydroxycinnoline (G057-3) Hợp chất G057-3 thu dạng chất rắn màu vàng Phổ IR cho đỉnh hấp thụ đặc trưng nhóm chức hydroxyl ketone  max3412 cm1, 1669 cm-1 Phổ khối phân giải cao HRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 189,0657 [M+H] + (tính tốn cho CTPT C 10H9N2O2 m/z 189,0664), cho phép xác định công thức phân tử C 10H8N2O2 tương ứng với nối đôi tương đương Trên phổ 1HNMR cho tín hiệu nhóm metin vịng thơm dạng 1,2-disubstituted δH 8.36 (d, J = 8.0 Hz, H-5), 7.63 (t, J = 8,0 Hz, H-6), 7.85 (t, J = 8.0 Hz, H-7) and 7.89 (d, J = 8.0 Hz, H-8), nhóm metyl δH 2.77 (s, CH3-9) proton nhóm OH δH 9.95 (br s, OH) 12 Bảng 3.5 Dữ liệu phổ NMR G057-3 (DMSO-d6) xem bảng 3.5 C C H mult (J in Hz) 145,3 160,6 4a 123,5 126,9 8,36 d (8,0) 129,4 7,63 t (8,0) 134,9 7,85 t (8,0) 129,2 7,89 d (8,0) 8a 147,7 194,1 10 24,0 2,77 s OH 9,95 br s Trên phổ 13C- NMR DEPT cho thấy có mặt 10 nguyên tử cacbon có nhóm metyl δC 24,0 (CH3-10), nhóm keton δC 194,1 (C-9), nhóm metin vịng thơm cacbon bậc δC 145,3 (C-3), 160,6 (C-4), 123,5 (C-4a), 147.7 (C-8a), dựa vào độ chuyển dịch hóa học cho phép xác định cacbon bậc δC 160,6 (C-4) gắn với oxy Phổ HMBC cho tương tác xa proton nhóm H-5 với C-8a C-4, tương tác H-8 với C-4a cho phép xác định liên kết C-4a với C-4, C-5 C-8a Tương tự nhóm acetyl xác định liên kết với cacbon C-3 dựa vào tương tác phổ HMBC CH3-10 với C-9 C-3 Kết hợp liệu phổ MS, 1D- NMR 2D- NMR cho phép xác định chất G057-3 3-acetyl-4-hydroxycinnoline Đây hợp chất lần đầu tách chiết từ tự nhiên Hợp chất tổng hợp vào năm 1991 Cấu trúc hóa học hợp chất G057-3 Hợp chất 3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole (G057-4) Hợp chất G057-4 thu dạng chất rắn màu vàng, độ quay cực [α]D25 129o (c 0,17; CDCl3) Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 307,2 [M+H]+ Trên phổ proton, vùng aromatic xuất tín hiệu giống với hợp chất G057-3 tương ứng với nhân indol δH 7,06 (2H, m, H-6’, 6”); 7,15-7,26 (4H, m, H-5’, 5”,2’,2”); 7,26-7,37 (2H, H-4’, 4”); 7,63-7,69 (2H, H-7’, 7”) Kết hợp phổ 1H- NMR với 13 C- NMR DEPT cho biết phân thử cịn có nhóm metin (δH 4,76; δC 37,0), nhóm oximetin (δH4,56; δC65,4) nhóm oximetylen (δH 3,66 3,76; δC 74,8).Phân tích phổ COSY hợp chất G057-4nhận thấy hợp chất G057-4có hệ tương tác spin Hệ thứ vùng aromatic nhân indol H-4’ (δH 8,34) qua H-5’, H-6’ (δH 7,33-7,46) kết thúc H-7’ (δH 7,45) Hệ spin thứ H-1 (δH 4,76) qua H-2 (δH4,56) đến proton thuộc nhóm oximetylen (δH 3,66 3,76) thể tương tác liền kề nhóm CH3 nhóm oximetin Các tương tác phổ COSY trình bày liên kết đậm phụ lục 14 Trên phổ HMBC, proton thuộc nhóm metin δH 4,76 có tương tác đồng thời với nguyên tử cacbon thuộc nhân indol δC 115,5; 116,9; 126,9, 127,4 chứng tỏ có gắn kết C-1 hệ spin 13 thứ với nhân indol C-3’ C-3” nhân indol phụ lục 14 Từ phân tích kết hợp với phổ khối thiết lập nên cấu trúc hợp chất G057-4 hình vẽ xác định hợp chất G057-4 3,3-(2,3-dihydroxypropyl)diindole Cấu trúc hóa học hợp chất G057-4 Hợp chất 2-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-1-propanone (G057-5), Hợp chất 3hydroxyacetylindole (G057-6), Hợp chất acid 3-indolylacetic (G057-7) Hợp chất 3-indolecarbadehyde (G057-8) Hợp chất G57-5 thu dạng chất rắn màu vàng, độ quay cực [α]D25 - 42o (c 0,21; CDCl3) Phổ khối ESI-MS xuất pic m/z 188,07 [M+H]+ Trên phổ 1H- NMR vùng trường thấp xuất tín hiệu proton thuộc vùng aromatic δH 7,36 (2H, m, H-5’,6’); 7,45 (1H, m, H-7’); 7,91 (1H, d, J=3,0 Hz, H-2’); 8,34 (1H, m, H-4’), cịn vùng trường cao có tín hiệu nhóm metyl δH 1,54 (3H, d, J= 7,0 Hz, H-3), phổ proton cho biết có mặt nhóm metin có liên kết với oxi 4,96 (1H, q, J=7,0 Hz, H-2) Phổ 13C- NMR DEPT G57-5 xuất tín hiệu 11 nguyên tử cacbon bao gồm nhóm CH có CH thuộc vùng aromatic δC 111,5; 122,3; 123,1; 124,2; 131,5; 1nhóm CH có liên kết với oxi δC 69,8; nhóm metyl δC 23,6 cacbon bậc có nhóm C=O δC 197,1 Phân tích phổ COSY hợp chất G57-5 nhận thấy hợp chất G57-5 có hệ spin Hệ thứ vùng aromatic H4’ (δH 8,34) qua H-5’, H-6’ (δH 7,33-7,46) kết thúc H-7’ (δH 7,45) Hệ spin thứ thể tương tác liền kề nhóm CH3 nhóm oximetin ( hình 3.13 phụ lục 3) Trên phổ HMBC, tín hiệu proton δH 7,91 (1H, d, J=3,0 Hz, H-2’) δH 7,45 (1H, m, H-7’); δH 8,34 (1H, m, H-4’) có tương tác với C-3’a C-7’a, tương tác H-2’ (δH 7,91) H-4’a (δH 8,34) với C-3’ (δC 113,9) chứng tỏ có mặt nhân indol phân tử hợp chất G57-5 Ngồi ra, proton thuộc nhóm metyl δH 1,54 proton H-2’ thuộc nhân indol (δH 7,91) có tương tác với nhóm C=O phổ HMBC thiết lập nên cấu trúc hợp chất G57-5 Như vậy, cách phân tích kết hợp phổ MS, 1D 2D- NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định cấu trúc chất G57-5 2-hydroxy-1-(1Hindol-3-yl)-1-propanone Cấu trúc hóa học hợp chất G057-5 đến G057-8 Hợp chất G57-6 thu dạng chất rắn màu vàng Trên phổ 1H- NMR, vùng aromatic xuất tín hiệu tương tự hợp chất G57-5 δH 7,31 (2H, m, H-5, 6); 7,45 (1H, m, H-7); 7,92 (1H, br s, H-2); 8,24 (1H, m, H-4) Sự khác phổ proton hai hợp chất G57-5 G57-6 tín hiệu singlet nhóm metylen có liên kết với oxi δH 4,76 phổ G57-6 thay tín hiệu doublet nhóm metyl tín hiệu quartet nhóm oximetin phổ hợp chất G57-5 Từ phân tích kết hợp với tham khảo tài liệu xác định hợp chất G576 d n xuất hợp chất G57-5 có tên 3-hydroxyacetylindol (phụ lục 16) Hợp chất G57-7 thu dạng chất rắn màu hồng, độ quay cực [α]D25 - 72o (c 0,42; CDCl3) Phổ khối ESI-MS xuất tín hiệu m/z 176,07 [M+H]+, 198,05 14 [M+Na]+ Phổ 1H- NMR hợp chất G57-7 vùng aromatic xuất tín hiệu tương tự hợp chất G57-5 G57-6 δH6,93 (1H, t, J=7,5 Hz, H-5); 7,03 (1H, t, J=7,5 Hz, H-6); 7,16 (1H, br d, H-2); 7,30 (1H, d, J=7,5 Hz, H-7); 7,50 (1H, d, J=8,0 Hz, H-4) Tuy nhiên, vùng trường thấp xuất thêm tín hiệu singlet δH 10,75 cịn vùng trường cao xuất tín hiệu singlet δH3,48 Phổ 13C- NMR DEPT hợp chất G57-7 cho biết phân tử có 10 nguyên tử cacbon bao gồm: nhóm metin thuộc vùng aromatic δC 111,0; 117,9; 118,8; 120,6; 123,4; cacbon bậc thuộc vùng aromatic δC 110,0; 127,6 ;136,0; nhóm cacbonyl δC 174,0 cuối nhóm metylen δC 33,0 Từ phân tích phổ 1D- NMR kết hợp so sánh với phổ G57-5 G57-6 thấy sơ phân tử G57-7 bao gồm nhân indol, nhóm metylen nhóm cacbonyl Phân tích phổ HMBC cho thấy tín hiệu singlet nhóm metylen δH 3,48 mặt có tương tác với C-2 (δC 123,4), C-3 (110,0), C-4 (118,0) nhân indol, mặt khác lại có tương tác với nhóm cacbonyl, từ kết hợp với phổ khối thiết lập nên cấu trúc hợp chất G57-7 hình vẽ Từ phân tích phổ NMR, MS kết hợp với tham khảo tài liệu xác định hợp chất G057-7 acid 3-indolylacetic (G057-7) Hợp chất G057-8 thu dạng tinh thể hình kim màu vàng nhạt Trên phổ H- NMR vùng aromatic xuất tín hiệu tương tự hợp chất G057-7 δH (ppm) 7,32 (1H, m, H-5); 7,33 (1H, m, H-6); 7,45 (1H, m, H-7); 7,85 (1H, d, J=3,0 Hz, H-2); 8,32 (1H, m, H-4); cịn vùng trường thấp có tín hiệu δH 10,1 Phổ 13CNMR DEPT xuất tín hiệu tương ứng với nguyên tử cacbon thuộc nhân indol δC 111,4 (C-7); 120,1 (C-7a); 122,0 (C-4); 123,1 (C-5); 124,0 (C-3); 124,5 (C-6); 135,1 (C-2) Tuy nhiên khác với hợp chất G57-7, phổ 13C- NMR hợp chất G57-8 xuất tín hiệu nhóm andehit δC 185,1 thay nhóm cacbonyl δC 174,0 hợp chất G57-7 Phân tích phổ HMBC cho thấy tín hiệu proton δH 10,1 tương tác với C3 nhân indol δC 124,0 Như vậy, kết hợp phổ khối, phổ NMR chiều hai chiều tham khảo tài liệu đến kết luận hợp chất G057-8 3-indolecarbadehyde Hợp chất acid 1-hydroxy-4-methoxy-2-naphthoic (G057-9), Hợp chất 7hydroxy-6-metoxycoumarin (G057-10) Hợp chất Xanthone (G057-11) Trên phổ 1H- NMR xuất tín hiệu proton thuộc vùng aromatic δH 7,29 (1H, s, H-7); 7,51 (1H, dt, J=1,5; 8,0 Hz, H-3); 7,56 (1H, dt, J=1,5; 8,0 Hz, H-2); 8,15 (1H, br d, J= 8,0 Hz, H-1); 8,29 (1H, br d, J= 8,0 Hz, H-4), cịn vùng trường cao có tín hiệu nhóm metoxy δH 3,98 (3H, s, CH3O-8) Phổ 13C- NMR G057-9 xuất tín hiệu 12 nguyên tử cacbon bao gồm nhóm metin vùng aromatic, nhóm metoxy δC 56,1 (8-OCH3); 1nhóm cacbonyl δC 169,8; nhóm metyl δC 23,6 cacbon bậc có nhóm C=O δC 176,3 (C=O) cacbon bậc Phổ HMBC cho thấy tương tác proton nhóm metoxy với C-8, cho phép xác định nhóm metoxy gắn với C-8 Từ liệu phổ 1D- NMR 2D- NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-9 acid 1-hydroxy-4-methoxy-2-naphthoic Cấu trúc hóa học hợp chất G057-9 đến G057-11 Hợp chất G057-10 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ 13C- NMR DEPT hợp chất G057-10 xuất tín hiệu cộng hưởng 10 nguyên tử cacbon gồm có: nhóm metoxy (OCH3) đặc trưng tín hiệu δC 56,4; nhóm metin sp2 cacbon bậc có nhóm cacbonyl (δC 164,4) Trên phổ 1H- NMR 15 hợp chất G057-10 cho thấy: vùng nhân thơm xuất tín hiệu proton δH 6,85 (s,H-5), δH 6,92 (s, H-8), tín hiệu singlet hai proton chứng tỏ chúng vị trí para so với vịng benzen, từ cho biết vòng benzen bị vị trí Ngồi ra, phổ proton cịn xuất proton δH 6,27 (d, J = 9,5 Hz), δH 7,60 (d, J = 9,5 Hz), số tương tác J = 9,5 Hz chứng tỏ hai proton vị trí cis so với nối đơi Trên phổ HMBC, hai proton thuộc liên kết đôi δH 6,27; 7,60 có tương tác với nhóm cacbonyl (δC 161,4), proton H-4 (δH 7,60) có tương tác với C-5 (δC 107,5), C-8a (δC 150,3), độ chuyển dịch hóa học δC 150,3 chứng tỏ C-8a có liên kết với oxi, độ chuyển dịch hóa học C-7 (δC 150,3) chứng tỏ C-7 có liên kết với oxi Sự gắn kết nhóm metoxy C-6 vòng benzen nhờ xuất tương tác C-6 (δC 144,0) với nhóm metoxy (δH 3,96) phổ HMBC (hình 3.17 phụ lục 3) Từ phân tích phổ 1D 2D- NMR chứng tỏ hợp chất G57-10 thuộc khung coumarin có nhóm metoxy liên kết với C-6, nhóm hydroxy liên kết với C-7 vòng benzen thuộc khung coumarin So sánh với tài liệu tham kết luận hợp chất G57-10 7-hydroxy-6-metoxycoumarin Hợp chất G057-11 thu dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 174oC Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa m/z 194,9 [M-H]- Phổ 1HNMR xuất tín hiệu proton vòng thơm δH 6,67 (2H, m, H-2+ H-4); 7,30 (1H, t, J= 7,5 Hz, H-3), 7,92 (1H, d, J= 7,5 Hz, H-1) Trên phổ 13C- NMR DEPT xuất tín hiệu nhóm cacbonyl δC 173,0 (C=O), nhóm metin vịng thơm δC 135,0 (C-3); 132,1 (C-1), 116,8 (C-4); 116,5 (C-2) Dựa vào tín hiệu quan sát dự đốn hợp chất G057-11 có cấu trúc đối xứng Phổ HMBC cho thấy tương tác xa H-1 với C-3, C-4a C-9, tương tác H-3 với C-1 C-4a, tương tác H-2 với C-9a, C-4, C-1, C-3 Từ liệu phổ MS, 1D 2D NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-11 xanthone Hợp chất Cyclo (Tyr-Trp) (G57-13), Hợp chất Cyclo-(Pro-Trp) (G057-14), Hợp chất Cyclo-(Pro-Phe) (G057-15), Hợp chất Cyclo- (Pro-Tyr) (G057-16) Hợp chất Cyclo-(Pro-Leu) (G057-17) Hợp chất G57-13 thu dạng chất rắn màu trắng Trên phổ 1H- NMR hợp chất G57-13, vùng aromatic xuất tín hiệu vịng benzen bị vị trí 1,4 δH 6,46 (2H, d, J=7,5 Hz, H-Tyr); 6,63 (2H, d, J=7,5 Hz, H-Tyr) tín hiệu nhân indol (bao gồm tín hiệu vịng benzen bị vị trí 1,6 proton singlet δH 7,03-7,60), vùng trường cao xuất tín hiệu proton δH1,48 [1H, dd, J=8,5; 13,5 Hz, CH2a(Tyr)]; 2,57 [1H, dd, J=4,0; 14,0 Hz, CH2b(Tyr)]; 2,76 [1H, dd, J=6,0; 14,5 Hz, CH2a(Trp)]; 3,05 [1H, dd, J=4,0; 14,5 Hz, CH2b(Trp)] Phổ 13 C- NMR DEPT cho biết phân tử có 20 nguyên tử cacbon bao gồm: nhóm metylen δC 31,2; 40,6; nhóm metin có liên kết với nitơ δC 57,1; 57,9; nhóm cacbonyl amit δC 169,3; 169,7 14 cacbon thuộc vùng aromatic δC 109,6-157,5 Từ phân tích phổ 1D- NMR gợi ý đến hợp chất G57-13 hợp chất dicyclopeptide hợp phần acid amin tyrosin tryptophan Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo đến kết luận hợp chất G57-13 Cyclo (Tyr-Trp) Cấu trúc hóa học hợp chất G057-13 đến G057-17 16 Hợp chất G057-14 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử ởm/z 284 [M+H]+ Phổ khối HRESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 284,1409 [M+H]+ tương ứng với cơng thức phân tử C16H19N3O2 (theo tính tốn lý thuyết m/z 284,1399) Phổ 1H- NMR thấy xuất proton vịng thơm, có proton singlet δH 7,12 (1H, s, H-2’) proton thơm khác δH 7,02-7,59 (4H, Haromatic) 10 proton vùng trường cao Phân tích phổ 13C- NMR DEPT với hỗ trợ phổ HSQC cho thấy phân tử có 16 nguyên tử cacbon, có nhóm metylen sp3, nhóm metin sp3, cacbon aromatic (5 nhóm metin cacbon bậc 4) nhóm cacbonyl δC 167,4 (C=O), 170,3 (C=O) Phân tích phổ COSY cho phép xác định chuỗi tương tác spin-spin proton: CH2-3/CH2-4/CH2-5/H-6; H9/CH2-10; H-4’ H-5’ H-6’ H-7’(hình 3.22 phụ lục 3) Phổ HMBC cho tương tác đồng thời proton H-10 với C-3 C=O, tương tác proton H-9 với nhóm cacbonyl tương tác proton H-5 H-6 với C-7, từ phân tích thiết lập nên cấu trúc hợp chất G057-14 Từ liệu phổ MS, 1D- NMR, 2D- NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-14 Cyclo-(Pro-Trp) Hợp chất G057-15 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ khối HRESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 245,1316 [M+H]+ tương ứng với công thức phân tử C14H16N2O2 (theo tính tốn lý thuyết m/z 245,1290 [M+H]+) Phổ 1H- NMR cho tín hiệu proton vịng thơm δH 7,33, tín hiệu nhóm metin gắn với nitơ δH 3,59 (1H, m, H-6); 4,22 (1H, t, J = 4.8 Hz, H-9), tín hiệu nhóm metylen gắn với nitơ δH 3,02 (1H, dd, J = 4,8; 13,6 Hz, Ha-3); 3,22 (1H, dd, J = 4,4, 13,6 Hz, Hb-3) Phân tích phổ 13C- NMR, DEPT HSQC cho tín hiệu 14 nguyên tử cacbon có nhóm metylen sp3, nhóm metin sp3, cacbon vịng thơm (5 nhóm metin cacbon bậc 4) nhóm cacbonyl δC 167,4 170,3 Các liệu phổ phân tích cho thấy hợp chất G057-15 thuộc kiểu dicyclopetide, so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-15 Cyclo-(Pro-Phe) Hợp chất G057-16 thu dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 261 [M+H]+ Phổ 1H- NMR, 13C- NMR thấy xuất tín hiệu khung dipetit giống với chất G057-15 Khác với chất G057-15 phổ H- NMR G057-16 có tín hiệu proton hệ vòng thơm A2B2 δH 6,77 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-3’ + H-5’), 7,03 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’ + H6’) Từ liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C- NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-16 Cyclo-(Pro-Tyr).Đây hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tốt chủng P expansum, R solani, F oxyporum A flavus với giá trị MIC 4,0; 8,0; 16,0; 16,0 µg/ml Hợp chất G057-17 thu dạng chất rắn màu trắng, đnc 147- 148oC, độ quay cực [α]D25 -83,8o (c 0,18; MeOH) Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 249 [M+K] + Phổ IR có dải hấp thụ νmax 3475 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm NH, dải hấp thụ ν max 1663 (cm-1) đặc trưng cho dao động hóa trị nhóm cacbonyl (C=O) Phổ 13C- NMR DEPT cho thấy phân tử có 11 nguyên tử cacbon, có nhóm metin lai hóa sp δC 24,7 (C-11); 53,4 (C-9); 59,0 (C-6); nhóm metylen liên kết trực tiếp với nitơ δC 45,5 (C-3); nhóm metylen δC 22,7 (C-4); 28,1 (C-5); 38,7 (C-10); metyl δC 21,2 (C-13); 23,3 (C-12); nhóm cacbonyl 166,2 (C-1); 170,2 (C-7) Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu nhóm methyl δH 0,97 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-13); 1,01 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH312), tín hiệu nhóm metin gắn với nitơ δH 4,03 (1H, dd, J = 3,5; 9,5 Hz; H9); 4,13 (1H, t, J = 8,0 Hz; H-6); tín hiệu nhóm metylen δH 3,56 (2H, m, CH 2-3) 17 Phổ HMBC cho tương tác xa H-10 với CH 3-12, CH3-13, C-11, C-9 C-1 cho phép xác định nhóm isobutyl gắn với cacbon C-9 Từ liệu phổ 1H- NMR, 13 C- NMR, HSQC, HMBC so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-17 Cyclo-(Leu-Pro) Hợp chất Thymine (G057-18), Hợp chất 4-hydroxybenzandehit (G057-19), Hợp chất 2-phenylethanol (G057-20) Hợp chất 4-(2-hydroxyethyl) phenol (G057-21) Hợp chất G057-18 thu đượcdưới dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS G057-18 cho pic ion phân tử proton hóa m/z 127,1 [M+H]+ Phổ 1H- NMR cho tín hiệu 1nhóm metyl δH1,86 (3H, s, CH3) tín hiệu proton vòng thơm 7,06 (1H, s, H-6) Các liệu phổ trùng khớp với liệu phổ Thymin, cho phép xác định chất làThymin (xem phụ lục 28) Hợp chất G057-19 thu dạng chất rắn màu trắng Trên phổ 1H- NMR, vùng aromatic xuất tín hiệu proton chia thành nhóm δH 6,95 (2H, d, J=8,5 Hz) 7,80 (2H, d, J=8,5 Hz) chứng tỏ vòng benzen bị vị trí 1,4 Ở vùng trường thấp xuất tín hiệu proton thuộc nhóm andehit δH9,87 Những phân tích phổ proton kết hợp với tham khảo tài liệu xác định hợp chất G057-19 4-hydroxybenzandehit Cấu trúc hóa học hợp chất G057-18 đến G057-21 Hợp chất G057-20 thu dạng chất rắn màu vàng nhạt Phổ khối ESIMS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 123 [M+H]+ Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu proton vịng thơm nằm khoảng δH 7,26-7,37 (5H-Ph) tín hiệu nhóm metylen dạng triplet δH 2,89 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-7), 3,86 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH2-8) Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-20 2-phenylethanol (xem phụ lục 30) Hợp chất G057-21 thu dạng chất màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 139 [M+H]+ Giống chất G120-2, phổ 1H- NMR xuất tín hiệu hệ A2B2 vòng thơm δH 6,73 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-2+ H-6); 7,05 (2H, d, J = 8,5 Hz; H-3+ H-5) tín hiệu nhóm metylen liên kết với dạng triplet δH 2,73 (2H, t, J = 7,0 Hz; H-7); 3,71 (2H, t, J = 7,0 Hz; H-8) Từ liệu phổ khối ESI-MS NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G057-21 4-(2-hydroxyethyl) phenol 3.8 Cấu trúc hóa học chất tách chiết từ dịch nuôi cấy chủng Micromonospora sp G043 3.8.1 Cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng xạ khuẩn Micromonospora sp G043 Từ cặn chiết của chủng Micromonospora sp G043, có 12 hợp chất tách chiết Trong cyclopeptide G057-14 đến G057-17 hợp chất thymine (G057-18) tách chiết từ chủng G057 Ngoài hợp chất G019-4 tách chiết từ chủng G019 Hợp chất Acid 2-phenylacetic acid (G043-6), n-Butyl–isobutyl phthalate (G043-8) 1H-benzo[d]imidazole (G043-9) Phổ khối ESI-MS G043-6 cho pic ion phân tử proton hóa m/z 138 [M+H]+ Dữ liệu phổ 1H- NMR, 13C- NMR, DEPT G043-6 trùng khớp với liệu phổ chất G120-3 cho phép xác định chất acid 2-phenylacetic 18 Hợp chất G043-8 thu dạng chất rắn vơ định hình màu trắng Phổ khối ESI-MS G043-8 cho pic ion phân tử m/z 279 [M+H] + Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu proton vòng thơm δH7,52 (2H, m, H-4 H-5), 7,72 (2H, m, H-3 H-6), tín hiệu nhóm metyl δH 0,96 (3H, t, J= 7,0 Hz, CH3-4’), 0,98 (6H, d, J= 6,5 Hz, CH3-3” CH3-4) proton vùng trường cao δH 2,04-4,30 Phổ 13CNMR DEPT cho thấy tín hiệu nhóm cacbonyl δC 167,6 (C-7); 167,7 (C-8), cacbon thơm, nhóm metin sp 3, nhóm metylen sp nhóm metyl Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G043-8 nbutyl-isobutyl phthalate Cấu trúc hóa học hợp chất G043-6, G043-8 G043-9 Trên phổ 1H- NMR cho tín hiệu proton vòng thơm δH7,13 (1H, t, J=8,0 Hz, H-5); 7,21 (1H, t, J=8,0 Hz, H-6); 7,38 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-7); 7,62 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4); 8,03 (1H s br, H-2) Các liệu phổ trùng khớp với liệu phổ 1Hbenzo[d]imidazole, cho phép xác định chất G043-9 1H-benzo[d]imidazole Cyclo-(Leu-Tyr) (G043-10) and Bis(2-ethylhexyl) adipate (G043-12) Hợp chất thu dạng chất rắn vơ định hình màu trắng Phổ 13C- NMR DEPT cho tín hiệu 15 nguyên tử cacbon bao gồm nhóm cacbonyl 166,5 (C=O), 167,7 (C=O), nhóm metin vịng thơm δC 115,0 (C3’+C-5’); 131,4 (C2’+C6’), nhóm metylen δC 39,0 (C-9), 43,8 (C-5), nhóm metin δC 23,1 (C-6); 52,4 (C-1); 55,8 (C-3), nhóm metyl δC 21,4 (CH3), 22,9 (CH3) cacbon bậc Phổ H- NMR cho tín hiệu phù hợp với tín hiệu phổ 13C- NMR, đặc trưng cho hợp chất dipeptid vịng bao gồm nhóm metyl δH 0,61 (3H, d, J= 7,5Hz, CH3), 0,62 (3H, d, J= 7,5Hz, CH3), nhóm metin gắn với N 3,59 (H-1), 4,02 (H-3), nhóm metin vịng thơm nhóm metylen Kết hợp liệu phổ so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G043-10 Cyclo-(Leu-Tyr) Hợp chất thu dạng chất rắn vơ định hình màu trắng Phổ khối ESI-MS G043-12 cho pic ion phân tử proton hóa m/z 371 [M+H]+ Phổ 1H- NMR cho tín hiệu nhóm metyl dạng triplet 0,88 (6H, m, CH 3-7, CH3-11) Trên phổ 1HNMR cịn có tín hiệu nhóm metylen gắn với oxy 3,98 (2H, dd, J=6,0; 3,5 Hz, CH2-4) tín hiệu proton aliphatic Phân tích phổ 13C- NMR, DEPT cho tín hiệu 11 nguyên tử cacbon có nhóm cacbonyl δC173,5 (C=O), nhóm metin 38,7 (C-5), nhóm metylen gắn với oxy 66,8 (C-4) nhóm metylen Dựa vào kết phổ khối phổ 1H- NMR, 13C- NMR, DEPT cho phép xác định hợp chất có cấu trúc đối xứng Kết hợp liệu phổ COSY, HSQC, HMBC cho phép xác định chất bis(2-ethylhexyl) adipate Cấu trúc hóa học hợp chất G043-10 G043-12 19 3.9 Các hợp chất thứ cấp từ chủng Micromonospora sp G120 3.9.1 Cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng xạ khuẩn Micromonospora sp G120 Quá trình tách chiết cặn chiết chủng Micromonospora sp G120 trình bày phần thực nghiệm Từ cặn chiết này, 13 hợp chất tách chiết Trong có hợp chất tìm thấy từ chủng G057 G057-2, G057-7, G057-11, G057-17, G057-20 G057-21 Hợp chất 1H-Indole-3-ethanol (G120-1) Hợp chất G120-1 thu dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 59 oC Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 176 [M+H]+ Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu proton vòng thơm δH 7,05 (1H, s, H-2), 7,15 (1H, dt, J= 1,0; 8,0 Hz, H-5), 7,23 (1H, dt, J= 1,0; 8,0 Hz, H-6), 7,36 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-7), 7,64 (1H, J= 8,0 Hz, H-4) nhóm metylen δH3,05 (2H, t, J= 6,5 Hz, CH2-8), 3,92 (2H, t, J= 6,5 Hz, CH2-9), độ chuyển dịch hóa học nhóm metylen δH3,92, cho phép dự đốn nhóm metylen gắn với oxy Phổ 13C- NMR DEPT G120-1 cho tín hiệu 10 nguyên tử cacbon, có gồm nhóm metin vịng thơm cacbon vòng thơm δC 111,3 (C-7); 118,8 (C-4); 119,4 (C-5); 122,2 (C-6); 122,6 (C-2), nhóm metylen δC 28,7 (C-8), 62,6 (C-9) cacbon bậc có cacbon gắn với Nitơ δ C 136,5 (C-7a) Từ việc phân tích phổ 13C- NMR, DEPT 1H- NMR cho phép xác định hợp chất G120-1 hợp chất indole Kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G120-1 1H-Indole-3-ethanol Hợp chất 2-(4-Hydroxyphenyl)EtOAc (G120-2), Hợp chất acid 2-phenylacetic (G120-3) Hợp chất 2-(4-hydroxyphenyl)acetic acid (G120-12) Hợp chất G120-2 thu dạng chất dầu màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 181 [M+H]+ Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu proton hệ A2B2 vịng thơm δH 6,80 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-3 + H-5), 7,08 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-2 + H-6) Tín hiệu nhóm metylen δH 2,88 (2H, t, J= 7,0 Hz, CH2-8), 4,27 (2H, t, J= 7,0 Hz, CH2-7) tín hiệu nhóm metyl δH 2,07 (3H, s, CH3-11) quan sát thấy phổ 1H- NMR Phổ 13C- NMR DEPT cho tín hiệu 10 nguyên tử cacbon, bao gồm nhóm cacbonyl δC 171,8 (C=O), cacbon vòng thơm δC 115,5 (C-3 + C-5), 129,5 (C-1), 129,9 (C-2 + C-6), 154,6 (C-4); nhóm metylen δC 34,2 (C-7), 65,5 (C-8) nhóm metyl δC 21,0 (C-11) Từ liệu phổ MS, NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G120-2 4hydroxyphenethyl acetate Hợp chất G120-3 thu dạng chất màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 138 [M+H] + Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu proton vịng thơm δH 7,25-7,33 (5H, m, Ph-H) nhóm metylen δH 3,59 (2H, s, CH2) Phổ 13C- NMR cho tín hiệu nguyên tử cacbon có cabon vòng thơm δC 127,2 (C-4), 128,6 (C-2 C-6), 129,4 (C-3 C-5), 123,6 (C-6), 133,8 (C-1), nhóm metylen δC 41,4 (CH2) nhóm cacbonyl δC 175,2 (COOH) Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G1203 acid 2-phenylacetic xem 20 Hợp chất G120-12 thu dạng chất màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 153 [M+H] + Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu hệ A2B2 vòng thơm δH 6,73 (2H, d, J= 8,5 Hz, H-2 H-6), 7,11 (2H, d, J= 8.5 Hz, H3 H-5) tín hiệu nhóm metylen δ H 3,48 (2H, s, CH2) Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G120-12 acid 2phenylacetic Hợp chất Cyclo-(Pro-Val) (G120-7), Hợp chất Butane-2,3-diol (G120-9), Hợp chất Uracil (G120-11) Hợp chất 2-acetamidobenzamide (G120-13) Hợp chất G120-7 thu dạng chất rắn màu trắng, phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 197 [M+H]+ Trên phổ 13C- NMR DEPT cho thấy có mặt 10 nguyên tử cacbon có nhóm metin lai hóa sp δC28,5 (C10),58,6 (C-9), 60,1 (C-6); nhóm metylen gắn với nguyên tử nitơ δC 45,5 (C-3) nhóm metylen δC 21,8 (C-4), 28,1 (C-5); nhóm metyl δC15,2 (C-11), 17,4 (C-12); nhóm cacbonyl δC 166,2 (C=O), 171,2 (C=O) Phổ 1H- NMR xuất tín hiệu nhóm metyl dạng doublet δH0,91 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-11), 1,06 (3H, d, J= 6,5 Hz, CH3-12), tín hiệu nhóm nhóm metin gắn với nitơ δH 3,93 (1H, br s, H9), 4,07 (1H, t, J= 7,0 Hz, H-6); tín hiệu nhóm metylen gắn với nitơ δH 3,54 (2H, m, CH2-3) Từ liệu phổ MS, 13C- NMR, DEPT 1H-NMR cho phép xác định hợp chất G120-7 Cyclo-(Pro-Val), hợp chất dipetit vịng thường gặp nhóm xạ khuẩn biển Hợp chất G120-9 thu dạng chất dầu màu trắng Độ quay cực [α]D25 o 13,6 (c 0,25; MeOH) Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 91 [M+H]+ Trên phổ 13C- NMR DEPT xuất tín hiệu nhóm metyl δC 16,5 (CH3) nhóm oximetin δC 70,7 Trên phổ 1H- NMR thấy tín hiệu doublet nhóm metyl δH 1,17 (3H, d, J= 6,0 Hz) tín hiệu quartlet nhóm oximetin δH 3,52 (1H, q, J = 6,5 Hz) Dựa vào liệu phổ ESI-MS NMR cho phép xác định hợp chất G120-9 có cấu trúc đối xứng Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G120-9 butane-2,3-diol Hợp chất G120-11 thu dạng chất rắn màu trắng, đnc 320-323oC Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử deproton hóa m/z 111 [M-H]- Phổ 1H- NMR 13C- NMR cho tín hiệu nhóm metin olefinic nhóm cacbonyl Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G120-11 uracil (xem phụ lục 42) Hợp chất G120-13thu dạng chất rắn màu trắng Phổ khối ESI-MS cho pic ion phân tử proton hóa m/z 179 [M+H] + Phân tích phổ 1H- NMR thấy xuất nhóm metyl δH 2,19 (3H, s, CH3), proton vòng thơm δH 7,36 (1H, dt, J= 1,5; 7,5 Hz, H-4), 8,04 (1H, dd, J= 1,5; 7,5 Hz, H-6), 8,46 (1H, dd, J= 1,5; 7,5 Hz, H2) Trên phổ 13C- NMR DEPT cho tín hiệu nguyên tử cacbon, có nhóm metyl δC 25,1 (CH3), tín hiệu cacbon vịng thơm δC 115,9-141,2 (C-Ph) nhóm cacbonyl 169,1 (C-8), 171,2 (C-7) Từ liệu phổ NMR so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G120-13 2-acetamidobenzamide 21 3.10 Các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G065 3.10.1 Cấu trúc hóa học hợp chất từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp G065 Quá trình tách chiết hợp chất từ cặn chiết chủng Streptomyces sp G065 trình bày phần thực nghiệm Trong số hợp chất thứ cấp tách chiết được, có hợp chất tách chiết từ chủng xạ khuẩn khác Đó hợp chất G043-6, G043-8, G057-14, G057-16, G057-17, G120-7 G120-11 Hợp chất Cyclo-(Pro-Ala) (G065-1) Hợp chất G065-1 thu dạng chất rắn màu trắng, đnc 140- 141oC, độ quay cực [α]D25 -78,2o (c 0,32; MeOH) Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử m/z 207 [M+K] + Trên phổ 13C- NMR cho thấy có mặt nguyên tử cacbon có nhóm metin lai hóa sp δC 51,2 (C-9); 59,3 (C-6); nhóm metylen gắn với nguyên tử nitơ δC 45,5 (C-3) nhóm metylen δC 22,8 (C-4); 28,2 (C5); nhóm metyl δC 16,0 (C-10); nhóm cacbonyl 166,3 (C-1); 170,3 (C-7) Phổ H- NMR xuất tín hiệu nhóm methyl δH 1,47 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH210), tín hiệu nhóm metin gắn với nitơ δH 4,12 (1H, m, H-9); 4,12 (1H, m, H6) Tín hiệu nhóm metylen gắn với nitơ δH 3,57 (2H, m, CH2-3) nhóm metylen δH 1,91 (1H, m, H-4α); 2,03 (1H, m, H-4β); 2,14 (1H, m, H-5α); 2,35 (1H, m, H-5β); 3,57 (2H, m, CH2-3) quan sát thấy xác định dựa vào phổ 1H- NMR HSQC Tương tác xa nhóm metyl (CH 3-10) với C-9 C-1 phổ HMBC cho phép xác định nhóm metyl gắn với cacbon C-9 Từ liệu phổ MS, 1H- NMR, 13C- NMR, HSQC, HMBC so sánh với tài liệu tham khảo cho phép xác định chất G065-1 Cyclo-(Pro-Ala) Đây hợp chất thường gặp nhóm xạ khuẩn biển có hoạt tính kháng VSVKĐ Cấu trúc hóa học hợp chất G065-1 3.11 Kết thử hoạt tính sinh học hợp chất tách chiết đƣợc từ chủng xạ khuẩn có hoạt tính cao Bảng 3.11: cho thấy 17 hợp chất có hoạt tính tốt hợp chất G043-3; G043-6; G043-10 tách chiết từ chủng Micromonospora sp G043, hợp chất G057-1, G057-3, G057-9, G057-10, G057-11, G057-2, G057-19 tách chiết từ chủng Nocardiopsis sp G057, hợp chất G065-1 tách chiết từ chủng Streptomyces sp G065, hợp chất G120-1, G120-2, G120-4 tách chiết từ chủng Micromonospora sp G120 hợp chất G019-1, G019-2 G019-5 tách chiết từ chủng Micromonospora sp G019 Đặc biệt hoạt tính kháng chủng Gram (-) mạnh lên rõ rệt so với cặn chiết thô ban đầu Hai hợp chất G057-11 hợp chất G057-2 thể hoạt tính chủng vi sinh vật kiểm định thử nghiệm Ba hợp chất G19-1, G019-2 G057-1 hợp chất lần đầu tách chiết từ thiên nhiên G057-3 thể hoạt tính kháng VSVKĐ Đáng ý hầu hết 22 hợp chất thể hoạt tính kháng VSVKĐ (14 /17 hợp chất) có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram (-)E coli.Trong số này, số hợp chất ức chế chủng vi khuẩn Gram (-) E coli với giá trị MIC đáng quan tâm G057-19 (8 µg/ml), G120-1 (8 µg/ml), G120-2 (8 µg/ml),G057-1 (16 µg ml) Ngồi ra, hợp chất G065-1thể hoạt tính ức chế nấm tốt với giá trị MIC µg ml Các hợp chất thể hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tốt Các hợp chất tách chiết được khảo sát hoạt tính kháng lao với Mycobacterium tuberculosis H37Rv Tuy nhiên, hầu hết hợp chất khơng thể hoạt tính, ngoại trừ hợp chất bis(2-ethylhexyl)adipate (G043-12) thể hoạt tính trung bình với giá trị MIC 46 µg/ml Hợp chất G043-12 công bố trước đây, nhiên lần hoạt tính kháng lao hợp chất phát Ngoài ra, ba hợp chất G057-1, G019-1, G019-2 hợp chất G0572, G057-3, G057-4, G57-5 tách chiết từ chủng Nocardiopsis sp G057 G019 thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB, Lu, HepG2 MCF7 Kết cho thấy hợp chất 2-hydroxy-1-(1H-indol-3-yl)-1-propanone (G575)thể hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư biểu mơ KB với giá trị IC 50 32 µg ml, hợp chất G057-2, G057-4, G057-12 thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB Lu với giá trị IC 50 nằm khoảng 12,57-29,33 µg/ml Kết luận Trong q trình thực luận án, kết luận án thu tóm tắt sau: - Đã phân lập 130 xạ khuẩn từ 140 m u thu thập vùng biển thuộc Đông bắc Việt Nam (Hạ Long - Cát Bà; Đảo Cô Tô - Thanh Lân Vịnh Bái Tử Long), vùng thuộc miền Trung (Hải Vân - Sơn Chà) vùng thuộc Nam Trung Bộ (Vịnh Vân Phong – Khánh Hòa) Các chủng lưu giữ môi trường A1 + 10% glycerol -80oC - Kết sàng lọc hoạt tính kháng VSVKĐ kháng lao cho thấy 105/130 chủng phân lập có tính kháng chủng VSVKĐ chiếm 80,8%, có 29 130 chủng phân lập có hoạt tính kháng từ chủng VSVKĐ trở lên, chiếm 22,3% 59 130 chủng kháng nấm kiểm định, chiếm 45,4% Ngoài ra, có 11 130 chủng phân lập có hoạt tính kháng vi khuẩn kiểm định Gram âm, chiếm 8,5% Ba chủng G017, G019 G043 thể hoạt tính kháng lao vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis H37Rv 23 - Đã lựa chọn xác định tên khoa học mười chủng có hoạt tính cao giải trình tự gen 16S rARN riboxom Trong chủng G017, G019, G043, G044, G047, G068, G120 thuộc chi Micromonospora, chủng G039, G065 thuộc chi Stretomyces, chủng G057 thuộc chi Nocardiopsis - Đã tiến hành nghiên cứu tách chiết xác định cấu trúc hóa học 44 hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn thể hoạt tính sinh học tốt, bao gồm G019, G043, G057, G065 G120 Trong có hợp chất 3,4-dihydroxy-6,7-dimethylquinoline-2-carboxylic (G019-1), 2-[(5-methyl-1,4-dioxan-2-yl)methoxy]ethanol (G0192), 2-[(2R-hydroxypropanoyl)amino]benzamide (G057-1), chất lần tách chiết từ tự nhiên 3,3’-bis-indole (G057-2), 3-acetyl-4-hydroxycinnoline (G057-3) - Các hợp chất tách chiết được khảo sát hoạt tính sinh học Trong đó, hợp chất (G043-3; G043-6; G043-10) tách chiết từ chủng Micromonospora sp G043, hợp chất (G057-1, G057-3, G057-9, G057-10, G057-11, G057-2, G057-19) tách chiết từ chủng Nocardiopsis sp G057, hợp chất (G065-1) tách chiết từ chủng Streptomyces sp G065, hợp chất (G120-1, G120-2, G120-4) tách chiết từ chủng Micromonospora sp G120 hợp chất (G019-1, G019-2, G019-5) tách chiết từ chủng Micromonospora sp G019 thể hoạt tính kháng VSVKĐ Đối với hoạt tính kháng lao, có hợp chất bis(2-ethylhexyl) adipate (G043-12) thể hoạt tính trung bình Mycobacterium tuberculosis H37Rv với giá trị MIC 46 μg ml Đây lần hoạt tính kháng lao hợp chất G043-12 phát - Ngoài ra, số hợp chất đánh giá hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào ung thư (KB, Lu, HepG2 MCF7) Hợp chất 2-hydroxy-1-(1H-indol-3yl)-1-propanone (G57-5) thể hoạt tính gây độc tế bào dịng tế bào ung thư biểu mô KB với giá trị IC50 32 µg ml, hợp chất G057-2, G057-4, G057-12 thể hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB Lu với giá trị IC 50 nằm khoảng 12,57-29,33 µg/ml Kiến nghị - Cần mở rộng nghiên cứu khu vực biển khác nước ta nhằm phát chủng vi sinh vật biển có khả sản sinh hợp chất có hoạt tính sinh học cao, nhằm nghiên cứu ứng dụng Đồng thời cần tiếp tục nghiên cứu chủng xạ khuẩn phân lập được, điều kiện lên men nhằm tìm kiếm chất có hoạt tính kháng VSVKĐ, kháng lao gây độc tế bào mà khuôn khổ luận án chưa có điều kiện nghiên cứu 24