BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN TIẾN DŨNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN TIẾN DŨNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ: Sinh học Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Nguyễn Tiến Dũng ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn tất khóa luận này, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới: Trường Đại học Tây Nguyên, các Phòng ban và Khoa chức năng ñã tổ chức ñào tạo, quản lý và tạo ñiều kiện thuận cho tôi hoàn tất khóa học và luận văn. Các thầy, cô giáo trong và ngoài trường ñã nhiệt tình giảng dạy và cung cấp những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. PGS. TS Nguyễn Anh Dũng, người quan tâm, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận. PGS. TS Nguyễn Hữu Hiệp thuộc viện nghiên cứu và phát triển Công Nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ ñã có những trao ñổi quý báu và tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Bộ môn Sinh học thực vật, Bộ môn SHTN, Bộ môn khoa học ñất, Trại thực nghiệm Khoa Nông Lâm và Phòng thí nghiệm CNSH&MT là các ñơn vị ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ, giáo viên trường THCS Tô Hiệu, huyện Krông Ana, tỉnh Đăklăk ñã tạo ñiều kiện thuận lợi ñể tôi thực hiện và hoàn tất khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K03 ñã cùng tôi san sẻ những buồn vui, cùng tôi học tập và trao ñổi kiến thức trong suốt khóa học. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới em Nguyễn Xuân Tài lớp Khoa học cây trồng K2007, em Lê Thị Hương lớp Cử nhân Sinh K2007 ñã cùng tôi tham gia nghiên cứu ñề tài. Đặc biệt, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới những người thân trong gia ñình ñã luôn quan tâm, tin tưởng, ñộng viên tôi trong suốt quá trình học cũng như thực hiện luận văn. Buôn Ma Thuột, tháng 09 năm 2011 Nguyễn Tiến Dũng iii MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 2. Mục tiêu của ñề tài 2 3. Ý nghĩa của ñề tài 2 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 Giới thiệu về cây ngô 3 1.1.1 Phân loại thực vật 3 1.1.2 Đặc ñiểm hình thái cây ngô 3 1.1.3 Yêu cầu sinh thái của cây ngô 4 1.1.3.1 Yêu cầu nhiệt ñộ 4 1.1.3.2 Yêu cầu về ánh sáng 4 1.1.3.3 Yêu cầu về nước 5 1.1.3.4 Yêu cầu về ñất 5 1.1.3.5 Yêu cầu chế ñộ không khí trong ñất 5 1.1.4 Vai trò các chất dinh dưỡng với cây ngô 6 1.1.4.1 Vai trò của ñạm 6 1.1.4.2 Vai trò của lân 6 1.1.4.3 Vai trò của kali 6 1.1.4.4 Vai trò các nguyên tố vi lượng 7 1.2 Tổng quan về vi khuẩn cố ñịnh Nitơ (N) 7 1.2.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do 7 1.2.1.1 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do hiếu khí 7 1.2.1.2 Vi khuẩn cố ñịnh N tự do kỵ khí Clostridium 9 1.2.2 Vi khuẩn cố ñịnh N cộng sinh 9 1.2.2.1 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây họ Đậu 9 1.2.2.2 Các vi khuẩn sống cộng sinh với cây không thuộc họ Đậu 10 iv 1.3 Tình hình nghiên cứu ngoài nuớc 13 1.4 Nghiên cứu trong nước 15 PHẦN II. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nội dung nghiên cứu 17 2.2 Vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 17 2.2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 17 2.2.2 Địa ñiểm nghiên cứu 18 2.2.3 Thời gian nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp thu mẫu 18 2.3.2 Phương pháp phân lập 18 2.3.3 Phương pháp mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng Azospirillum 20 2.3.4 Phương pháp xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum 20 2.3.5 Phương pháp tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 21 2.3.6 Phương pháp ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR 23 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn 23 2.3.7.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 23 2.3.7.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25 2.3.7.3 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25 2.3.7.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25 v 2.3.7.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 25 2.3.8 Phương pháp ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng 26 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu thống kê 28 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Phân lập các chủng vi khuẩn Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa ñiểm của tỉnh Đăk Nông 29 3.2 Mô tả ñặc ñiểm hình thái, ñặc ñiểm sinh học của các chủng Azospirillum 30 3.3 Kết quả nghiên cứu xác ñịnh khả năng tạo IAA của các chủng Azospirillum 34 3.4 Kết quả tuyển chọn các chủng Azospirillum có khả năng cố ñịnh ñạm bằng nghiên cứu thử nghiệm trên cây ngô 37 3.4.1 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến sinh trưởng của cây ngô trong bầu ñất 37 3.4.2 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng ñạm trong lá ngô 41 3.4.3 Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng diệp lục trong lá 43 3.5 Kết quả ñịnh danh các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn bằng kỹ thuật PCR 45 3.6 Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân sinh khối của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn 46 3.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 46 3.6.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 47 3.6.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 49 3.6.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 51 vi 3.6.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt ñộ môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum 53 3.7 Kết quả ñánh giá khả năng cố ñịnh ñạm của các chủng vi khuẩn Azospirillum ñược tuyển chọn trên ñồng ruộng 55 3.7.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến sinh trưởng của cây ngô 55 3.7.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến chiều cao cây ngô 55 3.7.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến số lá của cây ngô 58 3.7.1.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến chiều dài lá cây ngô 61 3.7.1.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến ñường kính gốc 63 3.7.1.5 Kết quả xác ñịnh hàm lượng diệp lục trong lá 65 3.7.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñược tuyển chọn ñến năng suất của cây ngô 66 PHẦN IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 72 4.1 Kết luận 72 4.2 Kiến nghị 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic acid BNF Biological nitrogen fixation bp Base pairs Cs Cộng sự Cl Clo DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotide triphotphate ĐC Đối chứng EtBr Ethidium bromide GA Gibberillins IAA Indole - 3 - acetic acid IBA Indole - 3 - butyric acid K 2 O Kali nguyên chất Mg Magie N Đạm NT Nghiệm thức PCR Polymerase chain reaction PHB Poly hydroxybutyrate P 2 O 5 Lân nguyên ch ất S Lưu huỳnh VK Vi khuẩn viii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc ñiểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Azospirillum 30 Bảng 3.2. Kết quả nhuộm gram của các chủng Azospirillum 33 Bảng 3.3. Giá trị OD 530nm ño ñược ở các nồng ñộ IAA pha loãng khác nhau 34 Bảng 3.4. Kết quả nghiên cứu khả năng tổng hợp IAA của các chủng Azospirillum (mg/l) 35 Bảng 3.5. Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây ngô trồng trong bầu ñất 37 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến sinh khối tươi và khô của cây ngô 39 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của các chủng Azospirillum ñến hàm lượng N tổng số trong lá ngô. 41 Bảng 3.8. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) 43 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) 46 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) 48 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) 50 Bảng 3.12. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) 52 Bảng 3.13. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến sinh khối của các chủng Azospirillum ( x 10 9 tế bào/ml) 54 Bảng 3.14. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến chiều cao cây (cm) 56 Bảng 3.15. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến số lá của cây ngô (lá/cây) 59 Bảng 3.16. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến chiều dài lá của cây ngô (cm) 61 Bảng 3.17. Ảnh hưởng của nghiệm thức ñến ñường kính gốc cây ngô (mm) 64 Bảng 3.18. Hàm lượng diệp lục trong lá ngô (mg/g) 65 [...]... lư ng phân vi sinh là vi c làm h t s c c n thi t Trong ó, vi c phân l p và tuy n ch n các ch ng vi sinh v t là khâu u tiên và quan tr ng trong quy trình t o ra ch ph m [5] Hư ng n m t n n s n xu t nông nghi p sinh thái b n v ng, trong vài ch c năm g n ây ngày càng gia tăng các nghiên c u vi khu n có ích khu trú trong r cây tr ng không thu c cây h Doebereiner, vi khu n Azospirillum u, c bi t cây ngũ... làm phân sinh h c chuyên d ng cho cây ngô 3 Ý nghĩa c a tài Ý nghĩa khoa h c Xác nh ư c m t s ch ng Azospirillum có kh năng c nh m, s ng n i sinh trong r cây ngô Ý nghĩa th c ti n K t qu c a tài là cơ s cho vi c l a ch n các ch ng Azospirillum s ng n i sinh trong r cây ngô có ho t tính c hi u qu , nâng cao phì nhiêu c a nh m s n xu t phân vi sinh có t, h n ch bón phân hóa h c, tăng năng su t cây ngô. .. u nào v thành ph n loài c a chi Azospirillum trong r cây ngô t i m t s a phương c a t nh ăk Nông Xu t phát t th c t ó, chúng tôi ti n hành nghiên c u tuy n ch n m t s ch ng vi khu n c t im ts nh tài: Phân l p, m Azospirillum trong r cây ngô a i m c a t nh ăk Nông 2 M c tiêu c a tài - Phân l p và tuy n ch n ư c m t s ch ng Azospirillum c nh m trong r cây ngô - Xây d ng qui trình nhân sinh kh i m t... Tính c p thi t c a U tài Phân vi sinh có nhi u ưu i m so v i phân hóa h c, ngoài tác d ng nâng cao năng su t và ch t lư ng cây tr ng, ti t ki m phân vô cơ, gi m chi phí s n su t thì phân vi sinh còn góp ph n quan tr ng trong vi c b o v môi trư ng và phát tri n nông nghi p b n v ng Tuy nhiên tình hình s n xu t phân vi sinh v n chưa áp ng nư c ta nhu c u th c ti n s n xu t c a n n nông nghi p, do quy mô... năng su t cây tr ng, h n ch bón phân hóa h c và phát tri n n n nông nghi p sinh thái b n v ng [35] Vi t Nam ã có m t s nghiên c u, phân l p các ch ng vi khu n thu c chi Azospirillum trong r lúa Bên c nh ó, ngô là m t sinh trư ng và phát tri n tương tr ng ph i ng n, ít i u tư, hi u qu kinh t cao, ư c bi n Tuy nhiên, nh ng nghiên c u v Azospirillum trong r cây ngô còn r t ít i tư ng có vòng vi khu n c... cây ngô và góp ph n phát tri n m t n n nông nghi p sinh thái b n v ng 3 PH N I T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Gi i thi u v cây ngô 1.1.1 Phân lo i th c v t Ngô có tên khoa h c là Zea mays L (Zea: T Hi L p t Mays là t “Mahix” tên g i cây ngô c a ngư i b n Mays là t “Maya” tên m t b t c da ch cây ngũ c c và a da [7] Cũng có th vùng Trung M - xu t x c a cây ngô) [18] Cây ngô thu c: Ngành : Maopholiophyta L p... d n m ngô: cây th p, lá nh có màu vàng, các lá già có , cây sinh trư ng ch m, c n c i, c ít, b p nh , năng su t th p 1.1.4.2 Vai trò c a lân Lân có vai trò quan tr ng v i cây ngô tuy nhiên kh năng hút lân giai o n cây non l i r t y u Th i kỳ 3 – 4 lá, cây ngô hút không ư c nhi u lân, ó là th i kỳ kh ng ho ng lân c a ngô, n u thi u lân trong giai o n này s làm gi m năng su t nghiêm tr ng Cây ngô hút... Trung bình cây ngô trong m t chu kỳ s ng c n kho ng 200 lít nư c sinh trư ng và phát tri n các th i kì sinh trư ng khác nhau cây ngô yêu c u lư ng mưa và lư ng nư c tư i khác nhau Cây ngô không ch u ư c úng, mc a t quá cao, l n hơn 80% có nh hư ng x u trư ng phát tri n c a cây ngô, c bi t là t lúc cây m c n sinh n khi cây ư c 8 lá Vào giai o n này ch c n ng p nư c 1 – 2 ngày cây ngô cũng có th b ch... không khí trong t thu ho ch s n lư ng ngô cao, ngoài vi c cung c p nư c và dinh dư ng còn ph i chú ý n ch không khí trong t Ch không khí nh hư ng gián ti p thông qua nhi u khâu khác nhau như là vi sinh v t, quá trình bi n hóa h c trong t Cây ngô i c bi t là r ngô phát tri n t t trong i u ki n háo 6 khí, n u t ch t bí thi u tơi x p thì r ngô phát tri n kém, ăn nông, r ng n ít lông hút, kh năng hút dinh... c i m hình thái cây ngô [7],[15],[16] R ngô: trong quá trình sinh trư ng phát tri n, cây ngô có 3 lo i r ó là: r m m, r t và r chân ki ng Thân ngô: thân c, ư ng kính thân kho ng 2 – 4cm tùy thu c vào gi ng, mùa v và trình thâm canh, thân có nhi u lóng Trong i u ki n bình thư ng ngô cao t 1,8 – 2m, t khi m c ch m, t lúc 8 – 9 lá n khi cây có 6 – 7 lá thân phát tri n n nhú c , n hoa cây phát tri n nhanh . PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230. NGUYỄN TIẾN DŨNG PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CỐ ĐỊNH ĐẠM Azospirillum TRONG RỄ CÂY NGÔ TẠI MỘT SỐ ĐỊA ĐIỂM CỦA TỈNH ĐĂK NÔNG LUẬN VĂN THẠC SĨ:. phương của tỉnh Đăk Nông. Xuất phát từ thực tế ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài: Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn cố ñịnh ñạm Azospirillum trong rễ cây ngô tại một số ñịa