BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII TRONG SỮA BỘT Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : VƯƠNG MINH ĐẠT MSSV: 0811110013 Lớp: 08CSH1 TP. Hồ Chí Minh, 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, với sự hỗ trợ từ Giáo viên hướng dẫn. Những số liệu trong các bảng biểu và hình ảnh phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác, và đề tài cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả khóa luận của mình. TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011 Sinh viên Vương Minh Đạt LỜI CẢM ƠN Trải qua ba năm học dưới mái trường đại học kỹ thuật công nghệ, được sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô, nay đã hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp. Nhờ trong quá trình làm bài khóa luận, mà em đã học được nhiều kiến thức mà trước đó em chưa hề biết. Em xin chân thành cám ơn các thầy cô khoa Môi trường và công nghệ sinh học, đã giúp đỡ em tận tình trong ba năm học vừa qua để hoàn thành khóa học. Em xin cám ơn giáo viên hướng dẩn đã tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình làm bài khóa luận tốt nghiệp. Một điều không thể thiếu, đó chính là gia đình, cha mẹ đã động viên em, giúp em có thêm tinh thần, vượt qua được khó khăn về tinh thần, cũng như về vật chất. Nhờ vậy, mà em có thể hoàn thành khóa học và hoàn thành bài khóa luận tốt nghiệp này. Ngoài thầy cô và gia đình ra, một điều quan trọng không thể thiếu, đó chính là tập thể các bạn lớp 08CSH trường Đại học Kỹ thuật Công nghệ. Chính nhờ các bạn, giúp đỡ động viên rất nhiều trong quá trình học tập, cũng như trong đời sống. Em xin chân thành cám ơn!!! TP.HCM, ngày 4 tháng 7 năm 2011 Sinh viên Vương Minh Đạt i MỤC LỤC Danh mục các từ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 1 1.3. Nội dung nghiên cứu 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giá trị dinh dưỡng của sữa bột 2 2.1.1. Đường lactose 2 2.1.2. Protein 2 2.1.3. Chất béo 3 2.1.4. Chất khoáng 5 2.1.5. Vitamin 5 2.1.6. Các hợp chất khác 6 2.2. Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột 6 2.2.1. Listeria monocytogenes 6 2.2.1.1. Giới thiệu 6 2.2.1.2. Phân loại 6 2.2.1.3. Đặc điểm 7 2.2.1.4. Yếu tố độc lực 7 2.2.1.5. Khả năng gây bệnh 8 2.2.1.6. Các thực phẩm liên quan 9 2.2.2. Escherichia Coli 9 2.2.2.1. Giới thiệu 9 2.2.2.2. Phân loại 9 2.2.2.3. Hình thái, cấu trúc 10 2.2.2.4. Đặc điểm 10 ii 2.2.2.5. Khả năng gây bệnh 11 2.2.2.6. Các thực phẩm liên quan 12 2.3. Tổng quan về Enterobacter sakazakii 13 2.3.1. Lịch sử phát hiện 13 2.3.2. Phân loại 13 2.3.3 Đặc điểm 14 2.2.3.1. Đặc điểm chung 14 2.2.3.2. Đặc điểm sinh hóa 16 2.3.4. Cấu trúc 16 2.3.4.1. Thành tế bào 17 2.3.4.2. Màng sinh học 18 2.3.4.3. Tiên mao 19 2.3.5. Yếu tố độc lực 20 2.3.6. Cơ chế gây bệnh 21 2.2.6.1. Các nguồn nhiễm bệnh 21 2.2.6.2. Triệu chứng 21 2.2.7. Các biện pháp phòng và xử lí bệnh 22 2.2.7.1. Các biện pháp phòng bệnh 22 2.2.7.2. Xử lí bệnh 22 2.2.8 Tình hình nhiễm E. sakazakii trong sữa bột 22 2.2.8.1. Việt Nam 22 2.2.8.2. Thế giới 23 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII 3.1. Phương pháp truyền thống 25 3.1.1. Nguyên tắc 25 3.1.2. Môi trường nuôi cấy 25 3.1.3. Thiết bị, dụng cụ 25 3.1.4. Lấy mẫu 25 3.1.5. Chuẩn bị mẫu thử 27 iii 3.1.6. Quy trình phân tích 28 3.1.7. Cách tiến hành 29 3.1.7.1. Phần mẫu thử 29 3.1.7.2. Tiền tăng sinh 29 3.1.7.3. Tăng sinh chọn lọc 29 3.1.7.4. Phân lập Enterobacter sakazakii giả định 29 3.1.7.5. Khẳng định 30 3.1.8. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường vi sinh Brilliance Enterobacter sakazakii Agar 31 3.1.9. Phân lập Enterobacter sakazakii trên môi trường MacConkey 32 3.1.10. Khẳng định sinh hóa 33 3.1.10.1. Môi trường và thuốc thử trong thử nghiệm sinh hóa 33 3.1.10.2. Phép thử Oxydase 34 3.1.10.3. Phép thử L-Lysin decarboxylase, L-Ornithin decarboxylase 34 3.1.10.4 Phép thử L- arginin dihydrolase 34 3.1.10.5. Phép thử lên men các loại đường khác nhau 34 3.1.10.6. Phép thử chỉ sử dụng Citrate 34 3.1.10.7. Thử nghiệm Nitrate 35 3.1.10.8. Thử nghiệm ONPG 36 3.1.10.9. Thử nghiệm tính di động trên thạch mềm 37 3.1.9.10. Thử nghiệm VP (voges-proskauer) 38 3.2. Các phương pháp hiện đại 39 3.2.1. Phương pháp PCR 39 3.2.1.1. lịch sử phát triển 40 3.2.1.2. Nguyên tắc 40 3.2.1.3. Các thành phần tham gia vào quá trình PCR 41 3.2.1.4. Phương pháp xác định Enterobacter sakazakii bằng phản ứng PCR 43 3.2.2. Phương pháp real time PCR 46 3.2.2.1. Lịch sử phát triển 46 iv 3.2.2.2. Khái niệm và nguyên lí hoạt động 47 3.2.2.3. Phương pháp tiến hành 49 CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 52 4.2. Kiến nghị 53 Tài liệu tham khảo 55 PHỤ LỤC 56 v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ATVSTP: An toàn Vệ sinh thực phẩm FDA : Cơ quan Thực phẩm và Dược phẩm Mỹ TCVN: Tiêu chuẩn việt nam PCR: Polymerase Chain Reaction BPW: Buffered Pepton Water mLST: Canh thang tryptoza lauryl sulfat cải biến ESIA TM : Môi trường phân lập Enterobacter sakazakii giả định TSA: Tryptone Soya Agar EE: Enrichment Enterobacteriaceae ONPG: O-Nitrophenyl-p-D-galactopyranoside MR-VP: Methyl red – Voges Proskauer KIA: Kligler Iron Agar TSI: Triple Sugar Iron Agar PCR: Polymerase Chain Reaction vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột Bảng 2.2. Thành phần chất béo có trong sữa bò Bảng 2.3. Thành phần chất khoáng có trong sữa bột Bảng 2.4. Các thành phần vitamin trong sữa vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1: Vi khuẩn Listeria monocytogenes Hình 2.2: Vi khuẩn Escherichia Coli Hình 2.3: Trẻ em bị viêm màng não do sử dụng sữa bột nhiễm E. sakazakii Hình 2.4: E.sakazakii dưới kính hiển vi Hình 2.5: Tế bào vi khuẩn E. sakazakii Hình 2.6: Cấu trúc tế bào Gram – Hình 2.7: 5 bước phát triển của màng sinh học Hình 2.8: Cấu trúc tiên mao Hình 2.9: Hai loại sữa điển hình nhiễm E. sakazakii Hình 3.1: E. sakazakii trong môi trường ESIA Hình 3.2: E. sakazakii trên môi trương thạch TSA Hình 3.3: Khuẩn lạc Enterobacter sakazakii trên môi trường Brilliance Enterobacter sakazakii Agar Hình 3.4: E. sakazakii trên môi trường Macconkey Hình 3.5: Kết quả thử nghiệm nitratase (+) khi xuất hiện màu đỏ Hình 3.6: Kết quả thử nghiệm ONPG (+) ống nghiệm màu vàng Hình 3.7: Kết quả thử nghiệm VP ( Voges-Proskauer) Hình 3.8: Cơ chế của phản ứng PCR Hình 3.9: Kết quả sau khi điện di Hình 3.10: Sơ đồ phát quang của Taqman-probe Hình 3.11: Kết quả được đọc bằng máy real time 7500. Hình 3.12: Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại của mồi và mẫu dò trên gene OmpA của E. sakazakii [...]... hành thực hiện bài khóa luận: “Qui trình phát hiện Enterobacter sakazakii trong sữa bột Để có cái nhìn tổng quan về vi sinh vật này 1.2 Mục đích Tìm hiểu về vi khuẩn Enterobacter sakazakii và qui trình phân lập và phát hiện E sakazakii trong sữa bột 1.3 Nội dung nghiên cứu - Tìm hiểu về giá trị dinh dưỡng của sữa bột và các mối nguy trong sữa bột - Tìm hiểu tổng quan về E sakazakii - Các qui trình phân... Ngoài ra trong sữa bò còn chứa các loại đường khác nhưng hàm lượng rất thấp Bảng 2.1 khối lượng đường lactose trong các loại sữa bột[ 1] Loại sữa bột Khối lượng lactose/100g bột Sữa bột 78.0 g Sữa bột tách kem 52,9 g Sữa bột cho trẻ sơ sinh 50,9 g 2.1.2 Protein - Casein Casein là tên của một nhóm protein chủ yếu trong sữa Trong sữa bò casein chiếm gần 80% tổng số protein hay khoảng 26 g cho 1 lít sữa Có... 2.2.8Tình hình nhiễm E sakazakii trong sữa bột 2.2.8.1 Việt Nam Tình hình sữa nhiễm khuẩn E sakazakii tại Việt nam hiện nay chưa có trường hợp nào được công bố Tuy nhiên các sản phẩm sữa bột nhập khẩu vẫn là mối đe dọa hiện nay 22 Để phát hiện trong sữa có vi khuẩn nhóm E sakazakii hay không thì phải thực hiện thêm nhiều công đoạn xét nghiệm Vì vậy, đến thời điểm này, theo Cục An toàn Vệ sinh thực phẩm (ATVSTP)... chứa Enterobacter sakazakii Hình 2.9 : Hai loại sữa điển hình nhiễm E sakazakii 24 CHƯƠNG 3: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN ENTEROBACTER SAKAZAKII 3.1 Phương pháp truyền thống 3.1.1 Nguyên tắc Mẫu sữa nghi ngờ có sự hiện diện của Enterobacter sakazakii đễ phát hiện ta thông qua các bước + Tiền tăng sinh + Tăng sinh chọn lọc trên môi trường nuôi cấy đặc trưng + Khẳng định vi khuẩn bằng các thử nghiệm sinh. .. nhiễm khuẩn Enterobacter sakazakii ở trẻ sơ sinh nuôi bằng sữa bột dinh dưỡng Các cụm nhiễm E sakazakii đã được báo cáo một loạt các địa điểm trong vài năm qua của các trẻ sơ sinh ăn sữa bột do các nhà sản xuất khác nhau sản xuất Một nghiên cứu kiểm tra sữa bột trẻ sơ sinh dựa trên công thức sản phẩm thu được từ một số quốc gia khác nhau và thấy rằng E sakazakii có thể được thu hồi từ 20 (14%) trong 141... cho sự phát triển: nhiệt độ tối thiểu là 5,5 - 8°C, tối đa là 45 - 46°C và nhiệt độ tối ưu để phát triển là 37-43°C Ở nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu như thế sẽ giúp E sakazakii phát triển trong tủ lạnh nhà từ 7 đến 10°C nếu có trong sữa bột dành cho trẻ em Còn khi E sakazakii phát triển ở nhiệt độ lên tới 45-46°C có thể còn sống sót trong các thiết bị sấy và máy trộn được sử dụng sản xuất sữa bột cho... khá rộng Có loại sữa ít 3 béo, khoảng 3g trong 100 ml sữa, có loại sữa nhiều chất béo khoảng 5-6g trong 100 ml sữa Đối với sữa bò hàm lượng béo khoảng 3.9% Thông thường, chất béo chiếm khoảng 2,5 đến 6,0% thành phần sữa, tùy thuộc vào giống bò và chế độ dinh dưỡng Mỡ sữa tồn tại dưới dạng hạt nhỏ lơ lửng trong nước sữa Trong thành phần chất béo của sữa có tới 20 loại acid béo khác nhau, trong đó 2/3 là... tạo màng sinh học - Môi trường sống E sakazakii không phải là dạng sinh vật cư trú trong đường ruột của con người Ta có thể phân lập hàng loạt từ các mẫu môi trường (đất, nước), các loài gây hại như (ruồi, chuột), từ thực phẩm và từ môi trường bệnh viện E sakazakii cũng có thể được tìm thấy trong sữa bột, ngũ cốc, chocolate, bột mì và các khu vực sản xuất - Nhiệt độ tăng trưởng Enterobacter sakazakii. .. tích sữa Hormone do các tuyến nội tiết ra và giữ vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng của động vật Trong sữa có nhiều loại hormone được chia làm 3 nhóm: proteohormone, hormone peptide, hormone steoride 2.2.Các vi sinh vật gây hại trong sữa bột 2.2.1.Listeria monocytogenes 2.2.1.1 Giới thiệu Trong vấn đề ngộ độc thực phẩm, bệnh Listeriosis do vi khuẩn Listeria monocytogenes gây ra Nó là một trong. .. nghiệm trên 9.624 tấn sữa bột của công ty Đài Loan Wei Quan và phát hiện có Enterobacter sakazakii, một 23 loại vi khuẩn có thể gây bệnh viêm màng não cho trẻ nhỏ Đây là căn bệnh rất nguy hiểm và gây tỉ lệ tử vong cho tới 50% số trẻ mắc bệnh Ngoài sữa bột Đài Loan thì nhãn hiệu sữa Pauls do công ty Parmalat Australia sản xuất, một chi nhánh của tập đoàn thực phẩm của Ý cũng nằm trong 852 loại thực phẩm, . đã học được nhiều kiến thức mà trước đó em chưa hề biết. Em xin chân thành cám ơn các thầy cô khoa Môi trường và công nghệ sinh học, đã giúp đỡ em tận tình trong ba năm học vừa qua để hoàn. tức là nguồn máy phòng vệ tối quan trọng của tế bào chủ. Ngày 15/2 trong tạp chí Thực nghiệm Y Khoa, tiến sĩ Laurel Lenz và đồng sự đã công bố, đại thực bào bị Listeria xâm nhiễm phóng ra interferon. trạng nhiễm khuẩn do tiếp xúc hoặc ăn phải các loại thực phẩm bị nhiễm một loại vi khuẩn có tên khoa học là Listeria monocytogenes. Loại vi khuẩn listeria này được Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào