BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN s NGUYỄN VĂN BỐN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC BUÔN MA THU ỘT, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN NGUYỄN VĂN BỐN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH CHITINASE CAO TẠI TỈNH ĐẮK LẮK Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ: SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Anh Dũng BUÔN MA THUỘT, NĂM 2011 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Nguyễn Văn Bốn LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn: Thầy PGS.TS Nguyễn Anh Dũng ñã dành nhiều thời gian, tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn này. Cô TS. Võ Thị Phương Khanh, thầy TS. Ngô Đại Nghiệp ñã có nhiều ý kiến quý báu ñóng góp, giúp ñỡ tôi hoàn thành luận văn này. Quý thầy cô giáo trường Đại học Tây Nguyên, khoa KHTN và CN, Phòng Đào tạo Sau ñại học, ban giám hiệu nhà trường ñã tận tình giảng dạy và tạo ñiều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian khoá học. Các bạn sinh viên: Hạnh, Vui, Cương, Cường, Lữ lớp CN Sinh K07 và Được, Thảo, Hoài, Danh, Lựu, Ana, Oánh, Luận lớp CN Sinh K08 ñã tham gia tích cực trong quá trình tôi thực hiện ñề tài này. Các thầy cô trong bộ môn Sinh học thực nghiệm ñã tạo mọi ñiều kiện về thời gian, ñộng viên tinh thần cho tôi trong suốt khóa học. Các anh chị em trong lớp Cao học Sinh học thực nghiệm K3 ñã ñoàn kết giúp ñỡ, chia sẻ và ñộng viên tôi trong suốt 3 năm học cao học. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc những người thân trong gia ñình: Bố, mẹ, Các anh trai, các chị dâu, các cháu, vợ và con trai, gia ñình bố mẹ vợ ñã là chỗ dựa vững chắc cho tôi về tình cảm cũng như vật chất cần thiết giúp tôi có nghị lực ñể công tác, và phấn ñấu. Nguyễn Văn Bốn CÁC CHỮ VIẾT TẮT - HTch: Hoạt tính chung chitinase - HTr: Hoạt tính riêng chitinase - [chitin]: Nồng ñộ chitin - ĐC: Đ ối chứng - GlcNAc: N-acetyl glucosamine - DNS: Acid 3,5 dinitrosalicylic - UI: ñơn vị hoạt ñộ MỤC LỤC Mở ñầu 1. Đặt vấn ñề 1 2. Mục tiêu của ñề tài 1 3. Ý nghĩa khoa học 2 4. Ý nghĩa thực tiễn 2 Chương 1. Tổng quan tài liệu 1.1. Tổng quan về chitin và chitinase 3 1.1.1. Chitin 3 1.1.1.1. Cấu tạo chitin 3 1.1.1.2. Phân bố và số lượng 3 1.1.1.3. Đặc ñiểm khác 4 1.1.1.4. Ứng dụng 5 1.2. Chitinase (EC 3.2.1.14) 6 1.2.1. Khái niệm 6 1.2.2. Phân loại chitinase 7 1.2.2.1. Dựa vào cấu trúc phân tử 7 1.2.2.2. Dựa vào trình tự amino acid 7 1.2.2.3. Dựa vào phản ứng phân cắt 9 1.2.3. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 9 1.2.3.1. Chitinase vi khuẩn 9 1.2.3.2. Chitinase nấm 10 1.2.3.3. Chitinase thực vật 10 1.2.3.4. Chitinase ñộng vật 11 1.2.4. Các ñặc tính cơ bản của enzyme chitinase 11 1.2.4.1. Khối lượng phân tử 11 1.2.4.2. Điểm ñẳng ñiện - Phổ hấp thu - Hằng số Michaelis 11 1.2.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ 12 1.2.4.4. Ảnh hưởng của pH 12 1.2.4.5. Chất tăng hoạt, chất ức chế 12 1.2.4.6. Sự ổn ñịnh 14 1.2.5. Các loại cơ chất của enzyme chitinase 14 1.2.5.1. Chitin 14 1.2.5.2. Các dẫn xuất của chitin 14 1.2.6. Cơ chế tác ñộng của các loại enzyme chitinase 15 1.3. T ổng quan về nấm mốc 15 1.3.1. Khái niệm 15 1.3.2. Hình dạng và kích thước 16 1.3.3. Cấu tạo tế bào sợi nấm 17 1.3.4. Dinh dưỡng và tăng trưởng của nấm mốc 17 1.3.5. Vị trí và vai trò của nấm mốc 18 1.4. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 19 Chương 2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.1. Nội dung nghiên cứu 23 2.2. Vật liệu và thiết bị 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1. Địa ñiểm thu thập mẫu 23 2.3.2. Các loại môi trường 23 2.3.3. Phương pháp phân lập 24 2.3.4. Phương pháp tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 24 2.3.5. Xác ñịnh hoạt ñộ chitinase theo phương pháp ñịnh lượng ñường khử với thuốc thử DNS 25 2.3.6. Phương pháp ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28 2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao 28 2.3.8. Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân tủa phù hợp 29 2.3.9. Xác ñịnh tính chất cơ bản của chitinase 30 2.3.9. Xử lý số liệu 33 Chương 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase tại Đăk Lăk 34 3.2. Tuyển chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 40 3.3. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao 42 3.3.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin trong môi trường nuôi cấy 42 3.3.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy 43 3.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy 45 3.3.4. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy 46 3.3.5. Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc 48 3.3.6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy 49 3.4. Tác nhân tủa phù hợp cho quá tình tách chiết chitinase từ nấm mốc Penicillium janthinellum 50 3.5. Xác ñịnh một số tính chất cơ bản của chitinase từ nấm mốc Penicillium janthinell 52 3.5.1. Xác ñịnh nhiệt ñộ tối ưu cho hoạt tính chitinase 52 3.5.2. Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt tính chitinase 53 3.5.3. Xác ñịnh nồng ñộ cơ chất tối ưu cho hoạt tính chitinase 54 3.5.4. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56 3.5.5. Xác ñịnh thời gian phản ứng tối ưu 57 3.5. Tinh sạch chitinase 58 Kết luận và kiến nghị 61 Tài liệu tham khảo 62 Phụ lục 67 DANH MỤC BẢNG Bảng 3 .1. Đặc ñiểm khuẩn lạc của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 34 Bảng 3.2. Hàm lượng ñường khử trong dịch nuôi cấy và hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc 37 Bảng 3.3. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các nồng ñộ chitin khác nhau 43 Bảng 3.4. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy bổ sung các nguồn nitơ khác nhau 44 Bảng 3.5. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các nhiệt ñộ khác nhau 46 Bảng 3.6. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các pH khác nhau 47 Bảng 3.7. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy ở các tốc ñộ lắc khác nhau 48 Bảng 3.8. Hoạt tính chitinase của 3 chủng nấm mốc trong môi trường nuôi cấy trong các khoảng thời gian khác nhau 49 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi và hoạt tính chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum 51 Bảng 3.10. Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 55 Bảng 3.11. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57 Bảng 3.12. Hàm lượng protein, HTch, HTr trước và sau khi lọc gel 59 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của chitin 3 Hình 2.1. Phản ứng phân cắt chitin bằng chitinase 25 Hình 2.2. Phản ứng của ñường khử với thuốc thử DNS 25 Hình 3.1 . Hoạt tính chitinase của các chủng nấm mốc phân lập tại Đăk Lăk 39 Hình 3.2 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 43 Hình 3.3 . Ảnh hưởng của nguồn Nitơ ñến hoạt tính chitinase 44 Hình 3.4 . Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 46 Hình 3.5 . Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 47 Hình 3.6 . Ảnh hưởng của tốc ñộ lắc ñến hoạt tính chitinase 49 Hình 3.7 . Ảnh hưởng của nhiệt ñộ nuôi cấy ñến hoạt tính chitinase 49 Hình 3.8 . Ảnh hưởng của tác nhân tủa ñến hiệu suất thu hồi protein và hoạt tính chitinase của nấm mốc Penicillium janthinellum 52 Hình 3.9 . Ảnh hưởng của nhiệt ñộ phản ứng ñến hoạt tính chitinase 53 Hình 3.10 . Ảnh hưởng của pH ñến hoạt tính chitinase 54 Hình 3.11 . Ảnh hưởng của nồng ñộ chitin ñến hoạt tính chitinase 55 Hình 3.12 . Ảnh hưởng của một số ion kim loại ñến hoạt tính chitinase 56 Hình 3.13 . Ảnh hưởng của thời gian phản ứng ñến hoạt tính chitinase 57 Hình 3.14 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau lọc gel Sephadex 59 Hình 3.15 . Ảnh hưởng của phương pháp lọc gel tới hàm lượng protein, HTch, HTr của chitinase 60 Hình 3.16 . Kết quả ño mật ñộ quang dịch protein sau tinh sạch bằng cột chitin 60 Hình 3.17 . Hình 3.17. Vòng phân giải chitin 60 [...]... 25-40kDa [23] M t s chitinase có kh i lư ng phân t kho ng 4090kDa Enzyme chitinase c a các loài thân m m, chân t, ng v t có xương (cá, lư ng cư, thú) có kh i lư ng phân t cao hơn, kho ng 120kDa Kh i lư ng phân t c a enzyme chitinase thu nh n t n m và vi khu n có kho ng bi n i r ng, t 30 n 120kDa M t s enzyme chitinase có kh i lư ng phân t th p có th ư ct o ra t m t enzyme l n hơn b ng cách phân c t m t ph... v khác Chitinase thương ph m có giá r t t, c bi t là chitinase tinh s ch Vì v y vi c s d ng chitinase thô tr nên ph bi n, thú v hơn trong vi c s n xu t GluNAc và các oligomer có ngu n g c t chitin 7 1.2.2 Phân lo i chitinase 1.2.2.1 D a vào c u trúc phân t Chitinase ư c s p x p vào 2 h Glycohydrolase (enzyme th y phân ư ng): - H glycohydrolase 18: là h chitinase l n nh t v i kho ng 180 chi, có c u... chitinase acid gi ng v i các chitinase base, ch khác Xét v ch chúng không có vùng u N hevein c tính phân c t, chitinase th c v t thư ng là endochitinase phân c t ng u nhiên M t s chitinase th c v t có ho t tính lysozyme c t liên k t β-1,4 gi a acid N-acetylmuramic và các g c N-acetylglucosamine trong peptidoglycan Ví d như chitinase phân l p t 1.2.3.4 Chitinase T m ts u , Rubus hispidus và Parthenocissus quinquefolia... v chitinase [13] Tuy nhiên, hi n nay v n chưa có m t nghiên c u nào v phân l p và sàng l c các ch ng n m m c Tây Nguyên, c th là nư c thu nh n chitinase mang tính h th ng khu v c k L k ư c công b trên các t p chí trong và ngoài góp ph n tham gia vào vi c nghiên c u enzyme chitinase t vi sinh v t t i Tây Nguyên, chúng tôi xu t tài Phân l p và tuy n ch n m t s ch ng n m m c có ho t tính chitinase cao. .. t nh nhi t t i ưu c a enzyme chitinase côn trùng không cao 1.2.4.4 nh hư ng c a pH pH t i ưu c a enzyme chitinase t 4-9 cao và t o, enzyme chitinase i v i các chitinase ng v t có vú là 4,8-7,5 và th c v t b c vi sinh v t là 3,5-8,0 Theo các nhà khoa h c, pH t i thích c a enzyme chitinase có th có s ph thu c vào cơ ch t ư c s d ng a s các enzyme chitinase ã ư c nghiên c u có pH t i thích kho ng 5,0 khi... Các oligosaccharide thư ng ư c th y phân bên trong trên m t vài v trí xác nh ho c m t cách ng u nhiên M t s enzyme chitinase có kh năng th y phân trisaccharide, m t s khác thì không Cũng có 2 d ng chitinase th y phân pentasaccharide: m t phân c t bên trong t o disaccharide và trisaccharide, m t phân c t bên ngoài t o các monosaccharide và tetrasaccharide Tóm l i, chitinase th c ch t là enzyme c t ng... bean) v i ho t tính kháng n m [31]; Woo-Jin Jung và c ng s (2006) nghiên c u tinh s ch và xác nh tính ch t c a exo-B-glucosaminidase t Aspergillus fumigatus S-26 [32]; Jayme A Souza-Neto và c ng s (2003) cũng ã nghiên c u ho t tính chitinase trong u trùng mu i [33], V n tuy n ch n các ch ng vi sinh v t có ho t tính chitinase cao và t i ưu môi trư ng cũng như i u ki n nuôi c y chúng thu nh n chitinase ã... enzyme chitinase còn ư c thu nh n t d ch bi u bì c a giun tròn trong su t quá trình phát tri n và d ch ti t bi u bì c a các loài chân t vào th i i m thay v , l t da Enzyme chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticle) trong quá trình bi n thái hay l t xác 1.2.4 Các c tính cơ b n c a enzyme chitinase 1.2.4.1 Kh i lư ng phân t Enzyme chitinase tìm th y th c v t b c cao và t o bi n có kh i lư ng phân. .. vai trò trong vi c phân tách t bào m kh i các t bào ch em thu c lá và nhi u loài th c v t khác, các chitinase này n m trong không bào và ư c c m ng t s nhi m n m, vi khu n hay virus Chitinase nhóm I c a thu c lá có vùng u C giàu cystein óng vai trò là vùng g n chitin - Nhóm II: là nh ng ng phân enzyme trong phân t ch có tâm xúc tác có trình t amino acid tương t và peptid nh n bi t chitinase nhóm I,... là glycol chitin có nhi t nh n mà enzyme chitinase có th có nh ng nhi t t i ưu khác nhau Thí d , nhi t t i ưu c a chitinase t khoai tây ng t là 25oC [12] các enzyme t c t t i ưu là 45-70oC [5] Diosscorea opposita THUNB nhi t Các enzyme chitinase th c v t thu c nhóm III và các chitinase t Bacillus licheniformis phân l p trong su i nư c nóng cho th y có kh năng ch u cao n 80oC M t khác, chitinase t côn . chọn và ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.1. Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 37 3.2.2. Định danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao. phần tham gia vào việc nghiên cứu enzyme chitinase từ vi sinh vật tại Tây Nguyên, chúng tôi ñề xuất ñề tài Phân lập và tuyển chọn một số chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao tại tỉnh Đắk Lắk” ñịnh danh các chủng nấm mốc có hoạt tính chitinase cao 28 2.3.7. Tối ưu hóa môi trường và ñiều kiện nuôi cấy các chủng nấm mốc tuyển chọn nhằm thu nhận chitinase có hoạt tính cao 28 2.3.8.