BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN HOÀNG NGỌC DUYÊN “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI NẤM ĐỐI KHÁNG TRÊN TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HẠI CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK NÔNG” MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM Buôn Ma Thuột, năm 2010 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN HOÀNG NGỌC DUYÊN “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI NẤM ĐỐI KHÁNG TRÊN TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HẠI CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK NÔNG” LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC THỰC NGHIỆM NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN VĂN NAM Buôn Ma Thuột, năm 2010 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa ñược ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Người cam ñoan Hoàng Ngọc Duyên ii LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng sâu sắc, tôi xin bày tỏ sự biết ơn với Tiến sĩ Nguyễn Văn Nam, người Thầy ñã tận tình truyền ñạt kiến thức, theo dõi, dìu dắt, hướng dẫn, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành ñề tài này. Tôi vô cùng biết ơn ThS. Nguyễn Quang Tuấn, Chi cục trưởng chi cục BVTV tỉnh Đăk Nông ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong thời gian thực hiện ñề tài. Tôi xin dành sự kính trọng và tình cảm sâu sắc của mình ñến các thầy cô bộ môn sinh học, bộ môn Bảo vệ thực vật, các thầy cô khoa khoa học tự nhiên, khoa Nông lâm nghiệp, trường Đại học Tây Nguyên ñã hết lòng truyền ñạt kiến thức, kinh nghiệm, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện ñề tài. Xin ñược cảm ơn Ban lãnh ñạo Chi cục Bảo vệ thực vật tỉnh Đăk Nông, các ñồng chí ñồng nghiệp trong cơ quan ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi, hỗ trợ cho tôi ñược học tập và hoàn thành luận văn này. Chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn lớp Cao học SHTN K2 khóa II, các em sinh viên ñang thực tập tại phòng thí nghiệm bộ môn BVTV ñã luôn ñộng viên, tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho người cha kính yêu, ñã luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi vượt qua mọi khó khăn. Xin dành tặng gia ñình, những người bạn, ñồng nghiệp và những người thân yêu của tôi những tình cảm chân thành nhất. Buôn Ma Thuột, ngày 18 tháng 09 năm 2010 Học viên Hoàng Ngọc Duyên iii MỤC LỤC Nội dung Trang Trang phụ bìa Lời cam ñoan i L ời cảm ơn i i M ục lục i ii Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình vẽ, ñồ thị vii MỞ ĐẦU 1 1. Đ ặt vấn ñề 1 2. M ục ti êu nghiên c ứu 2 3. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2 3.1. Ý nghĩa khoa học 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn và hiệu quả ứng dụng 3 4. Giới hạn của ñề tài 3 Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Gi ới thiệu c hung v ề cây h ồ ti êu 4 1.1.1. Ngu ồn gốc cây ti êu 4 1.1.2. Công dụng của cây tiêu 4 1.1.3. Đặc ñiểm hình thái của cây tiêu 5 1.2. Giới thiệu chung về tuyến trùng thực vật. 7 1.3. Đặc ñiểm của tuyến trùng Meloidogyne spp. 9 1.3.1. Đặc ñiểm sinh học 10 1.3 .2. Các y ếu tố sinh thái, môi tr ư ờng ảnh h ư ởng ñến mật ñộ tuy ến tr ùng 11 1.3 .3. T ập quán sinh sống v à gây h ại 1 2 1.3.4. Quá trình phát triển của bệnh 13 1.3.5. Các yếu tố lan truyền tuyến trùng ở hồ tiêu 14 1.3.6. Các loài Meloidogyne spp. gây hại quan trọng 15 1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tuyến trùng Meloidogyne spp. 15 1.4.1. Các nghiên cứu về tuyến trùng Meloidogyne spp. trên thế giới 15 1.4 .2. Các nghiên c ứu về tuyến tr ùng Meloidogyne spp. t ại Việt Nam 1 9 1.5 . M ột số biện pháp p hòng tr ừ tuyến tr ùng Meloidogyne spp. 21 1.5.1. Biện pháp chọn giống 22 1.5.2. Biện pháp canh tác 22 1.5.3. Biện pháp hóa học 24 1.5.4. Biện pháp phòng trừ tổng hợp 25 1.5 .5. Bi ện pháp sinh học 2 6 1.6 . Vi sinh v ật ñối kháng v à ký sinh tuy ến tr ùng gây h ại cây trồng 2 6 Chương II: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.1. Đối tượng nghiên cứu 31 2.2. Nội dung nghiên cứu 31 2.3. Thời gian và ñịa ñiểm thực hiện 31 2.4. Vật liệu, hóa chất và dụng cụ thí nghiệm 32 2.4.1. V ật li ệ u 32 2.4.2. Hóa ch ấ t , d ụ ng c ụ và thi ế t b ị 32 iv 2.4.3. Các công thức môi trường 33 2.5. Phương pháp nghiên cứu 35 2.5.1. Phương pháp thu mẫu 35 2.5.2. Phương pháp x ử lý mẫu 3 6 2.5.3. Phương pháp ly trích tuy ến tr ùng 3 6 2.5.4. Nhân nuôi tuy ến tr ùng M eloidogyne spp. t rong phòng thí nghi ệm 3 7 2.5.5. Phân lập nấm và giữ mẫu nấm 37 2.5.6. Xác ñịnh khả năng ñối kháng của các loài nấm phân lập ñược lên tuy ến trùng Meloidogyne spp. trong ñiều kiện invitro 38 2.5.7. Phương pháp nhân nuôi các chủng nấm ñược tuyển chọn 39 2.5.8. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng ñến khả năng ký sinh của nấm 40 2.6. Thử nghiệm tính ñối kháng của một số chủng nấm có tính ñối kháng cao trong ñiều kiện nhà lưới 41 2.7. Phương pháp xác ñ ịnh số l ư ợng b ào t ử 43 2.8. Phương pháp x ử lý số liệu 4 4 Chương III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 45 3.1. Phân lập, làm thuần và lưu giữ các chủng nấm bản ñịa ở các ñịa ñiểm nghiên cứu 45 3.2. Sàng lọc và tuyển chọn các chủng nấm có khả năng KS tuyến trùng 47 3.2.1. Sàng lọc khả năng ký sinh tuyến trùng của các chủng nấm 47 3.2.2. Hình thức ký sinh trứng tuyến trùng của các chủng nấm trong ñiều kiện nghiên cứu 50 3.2.3. Khả năng ký sinh của các chủng nấm tuyển chọn 50 3.3. Nghiên c ứ u các y ế u t ố ả nh hư ở ng ñ ế n kh ả năng KS c ủ a n ấ m lên tuy ế n trùng Meloidogyne spp. 52 3 .3.1. Ả nh hư ở ng c ủ a môi trư ờ ng nuôi c ấ y ñ ế n kh ả năng KS c ủ a n ấ m 52 3.3.2. Ả nh hư ở ng c ủ a nhi ệ t ñ ộ ñ ế n kh ả năng ký sinh c ủ a n ấ m 5 5 3.3.3. Ảnh hưởng của pH ñến khả năng ký sinh của nấm 56 3.3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng ñến khả năng KS của nấm 57 3.3.5. Một số yếu tố sinh học của nấm liên quan ñến khả năng ký sinh của nấm 57 3.4. Đặc ñiểm hình thái và phân loại của các chủng nấm tuyển chọn 59 3.4.1. Đặc ñiểm hình thái 59 3.4.2. V ị trí phân lo ạ i c ủ a các ch ủ ng n ấ m C07, C22, DY16 và T7 61 3.5. N hân nuôi các dòng n ấ m tuy ể n ch ọ n 6 4 3.5.1. Môi trường nhân nuôi cấp 1 64 3.5.2. Môi trường nhân nuôi cấp 2 65 3.6. Khảo sát khả năng ký sinh của các chủng nấm lên tuyến trùng Meloidogyne spp. trên cây tiêu trong ñiều kiện nhà lưới 67 3.6.1. Diễn biến chỉ tiêu sinh trưởng của cây tiêu ở các CT thí nghiệm 67 3.6.2. Sự biến ñộng mật ñộ tuyến trùng Meloidogyne spp. trong ñất và trong rễ tiêu thí nghiệm theo thời gian 71 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 K ết luận 7 5 Ki ến nghị 7 6 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA ĐỀ TÀI v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT BVTV: Bảo vệ thực vật CBM: Chitin Broth Medium CT: Công thức IJ1: Infective Juvenile 1 (Ấu trùng tuổi 1) IJ2: Infective Juvenile 2 (Ấu trùng tuổi 2 dạng cảm nhiễm) M.: Meloidogyne MA: Maize Agar MM: Minimum Mineral MT: Môi trường KDTV: Kiểm dịch thực vật KHVQH: Kính hiển vi quang học KD: Kinh doanh KS: Ký sinh KT: Kích thước KTCB: Kiến thiết cơ bản SXL: Sau xử lý PGA: Potato Glucose Agar PL: Phụ lục PTSH: Phòng trừ sinh học PRBA: Peptone Rose Bengal Agar T.: Trichoderma TCA: Trichloroacetic WA: Water Agar vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Nội dung Trang Bảng 3.1. Số lượng các chủng vi nấm phân lập ñược tại các ñịa ñiểm nghiên cứu…………………………………………………………………… 45 Bảng 3.2. Mật ñộ vi nấm phân lập từ ñất tại các ñịa ñiểm nghiên cứu………… 45 Bảng 3.3. Thành phần vi nấm phân lập ñược từ các mẫu ñất, mẫu rễ của bốn ñịa ñiểm nghiên cứu…………………………………………………. 47 Bảng 3.4. Khả năng ký sinh trứng tuyến trùng của các chủng nấm……………. 48 Bảng 3.5: Tỷ lệ ký sinh của 04 chủng nấm có hoạt tính ký sinh cao trên tuyến trùng Meloidogyne spp………………………………………………. 51 Bảng 3.6. Đặc ñiểm khuẩn lạc sau 5 ngày nuôi cấy và tỷ lệ ký sinh của nấm trên các môi trường khác nhau………………………………………. 54 Bảng 3.7. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm ở các nhiệt ñộ khác nhau………… 55 Bảng 3.8. Tỷ lệ ký sinh trứng tuyến trùng Meloidogyne spp. ở các mức pH khác nhau……………………………………………………………. 56 Bảng 3.9. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 ở các thời gian chiếu sáng khác nhau………………………………………… 57 Bảng 3.10. Hoạt tính enzyme Chitinase của 04 chủng nấm C07, C22, DY16, T7 sau 12 ngày………………………………………………………… 58 Bảng 3.11. Hoạt tính protease, chitinase và tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16, T7………………………………………………… 59 Bảng 3.12. Đặc ñiểm hình thái của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy……… 59 Bảng 3.13. Khả năng sinh bào tử của 04 chủng C07, C22, DY16 và T7 trên môi trường PGA………………… …………………………………… 65 Bảng 3.14. Số lượng bào tử thu ñược của 04 chủng C07, C22, DY16 và T7 ở 02 tỷ lệ cơ chất khác nhau trên môi trường nhân nuôi…………………. 66 Bảng 3.15. Số lượng tuyến trùng/100g ñất, trứng/5g rễ và tỷ lệ nốt sần trên bộ rễ tiêu sau khi chủng nấm và xử lý tuyến trùng ở kỳ ñiều tra tuần 8 72 vii DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Nội dung Trang Hình 3.1. Tỷ lệ (%) mật ñộ vi nấm phân lập ñược tại các ñịa ñiểm nghiên cứu 46 Hình 3.2. Tỷ lệ các giống nấm chính xuất hiện tại mẫu ñất và mẫu rễ tại các ñịa ñiểm nghiên cứu……………………………………………… 46 Hình 3.3. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm sàng lọc 49 Hình 3.4. Tỷ lệ ký sinh sau 3 ngày của các chủng nấm 49 Hình 3.5. Khả năng ký sinh của các chủng nấm lên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp…………………………………………………… 50 Hình 3.6. Tỷ lệ ký sinh của 04 chủng nấm có hoạt tính ký sinh cao trên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp………………………………………. 51 Hình 3.7. Khả năng ký sinh của các chủng nấm ñược tuyển chọn lên trứng tuyến trùng Meloidogyne spp………………………………………. 52 Hình 3.8. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 ở các môi trường nuôi cấy khác nhau…………………………………………. 53 Hình 3.9. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm C07, C22, DY16 và T7 ở các mức nhiệt ñộ khác nhau……………………………………………. 55 Hình 3.10. Tỷ lệ ký sinh của các chủng nấm ở các mức pH khác nhau……… 56 Hình 3.11. Hoạt tính enzyme chitinase của các chủng nấm C07, C22, DY16, T7 sau 12 ngày…………………………………… 58 Hình 3.12. Khuẩn lạc chủng C07 (A); C22 (B); DY16 (C) và T7 (D)………… 60 Hình 3.13. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm C07…………………………… 62 Hình 3.14. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm C22…………………………… 62 Hình 3.15. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm DY16…………………………. 63 Hình 3.16. Đặc ñiểm hình thái của chủng nấm T7…………………………… 64 Hình 3.17. Khả năng sinh bào tử của chủng C07, C22, DY16 và T7 trên môi trường PGA………………………………………………………… 65 Hình 3.18. Số lượng bào tử thu ñược của 04 chủng C07, C22, DY16 và T7 ở 02 tỷ lệ cơ chất khác nhau trên môi trường nhân nuôi…………… 66 Hình 3.19. Diễn biến chiều cao cây tiêu ở các công thức thí nghiệm qua các1 thời ñiển nghiên cứu……………………………………………… 68 viii Hình 3.20. Diễn biến số lá/cây tiêu ở cácc công thức thí nghiệm qua các thời ñiểm nghiên cứu……………………………………………………. 68 Hình 3.21. Cây tiêu sau 06 tuần chủng tuyến trùng và xử lý nấm…………… 69 Hình 3.22. Diễn biến chiều dài/bộ rễ qua các thời ñiểm nghiên cứu… ……… 69 Hình 3.23. Bộ rễ tiêu sau khi chủng tuyến trùng và xử lý nấm sau 6 tuần…… 70 Hình 3.24. Diễn biến trọng lượng tươi và trọng lượng khô/cây……… 70 Hình 3.25. Diễn biến trọng lượng tươi và trọng lượng khô/bộ rễ……………… 71 Hình 3.26. Số lượng tuyến trùng Meloidogyne spp. trong 100g ñất, trứng tuyến trùng trong 5g rễ qua các kỳ ñiều tra………………………… 72 [...]... spp gây h i cây h tiêu t i ăk Nông 2 M c tiêu nghiên c u - Phân l p và tuy n ch n m t s dòng vi n m b n a có kh năng ký sinh trên tuy n trùng Meloidogyne spp gây h i trên cây h tiêu t i a bàn t nh ăk Nông - Xác n m nh m t s y u t nh hư ng n tính ký sinh tuy n trùng c a vi i kháng - ánh giá hi u qu phòng tr tuy n trùng Meloidogyne spp c a các dòng n m tuy n ch n trên cây tiêu trong i u ki n nhà lư i... vùng ng b ng sông C u Long 1.4 Các nghiên c u trong và ngoài nư c v tuy n trùng Meloidogyne spp 1.4.1 Các nghiên c u v tuy n trùng Meloidogyne spp trên th gi i B nh vàng lá tiêu hay “B nh héo ch m” ã ư c Van der Vecht báo cáo l n u tiên vào năm 1932 trên o Bangka, Indonesia (Van der Vecht, 1950) [73] Tri u ch ng tương t cũng ư c tìm th y trên cây cây tiêu tr ng tiêu trên th gi i như n các nư c (Nambiar... hi m i v i cây h tiêu T i Indonesia, năm 1975 làm gi m s n lư ng h tiêu kho ng 10%, còn Malaysia nhi u cánh ng tr ng tiêu 19 ã b ch t tr i do tuy n trùng ký sinh gây n t s n M sp (Nguy n Vũ Thanh, 1983) [23] 1.4.2 Các nghiên c u v tuy n trùng Meloidogyne spp t i Vi t Nam Riêng Vi t Nam, b nh tuy n trùng h tiêu ư c coi là m t trong nh ng b nh nan gi i nh t, ã và ang gây h i l n cho các vư n tiêu hi n... [8] Tuy n trùng n t s n gây h i trên tiêu kinh doanh, ki n thi t cơ b n và ngay trong các vư n ươm (Nguy n Vũ Thanh, 1983) [23], (Nguy n Ng c Châu và Nguy n Vũ Thanh, 1993) [8] Vi n BVTV (2008) [30], tuy n trùng gây h i h tiêu ăk Nông ch y u là loài Meloidogyne incognita, khi k t h p v i m t s Phytophthora, Pythium, Fusarium làm cho cây r ng n m gây h i: t, b nh n ng gây ch t cây Quá trình gây h i di... tr ng tiêu tr ng i m t i nghiên c u ch ư c th c hi n ăk Nông ng th i, t t c quy mô phòng thí nghi m, chưa ư c ưa vào th nghi m phòng tr cây tiêu trên ng ru ng nên chưa ánh giá ư c kh năng th c nghi m phòng tr tuy n trùng Meloidogyne spp c a các loài n m phân l p ư c 4 Chương I: T NG QUAN TÀI LI U 1.1 Gi i thi u chung v cây h tiêu 1.1.1 Ngu n g c cây tiêu Tiêu có ngu n g c vùng Ghats mi n Tây tiêu hoang... i kháng cao trên tuy n trùng h i tiêu là v n a áng quan tâm, nh m gi m thi t h i và nâng cao năng su t, s n lư ng, ch t lư ng s n ph m M t trong nh ng bi n pháp hi u qu góp ph n m b o an toàn cho con ngư i và không gây ô nhi m môi trư ng là dùng bi n pháp sinh h c mà chúng tôi th c hi n phòng tr Do v y tài: Nghiên c u tuy n ch n m t s vi n m i kháng trên tuy n trùng Meloidogyne spp gây h i cây h tiêu. .. i ăk Nông, b nh h i r do n m và tuy n trùng làm ch t 969 ha tiêu trong năm 2005 M t trong nh ng i tư ng gây h i quan tr ng trên cây tiêu hi n nay là tuy n trùng s n r (root knot nematodes) Meloidogyne spp ây ư c coi là nhóm tuy n trùng ký sinh quan tr ng nh t trong ngành nông nghi p Nhóm tuy n trùng này phân b r ng kh p th gi i và ký sinh trên h u h t các lo i cây tr ng các vùng khí h u khác nhau Hi... ng tuy n trùng ký sinh k t h p v i tiêu n Kuriyan et al., 1981 [47] quan sát tuy n trùng ký sinh Kerala, n vùng r tiêu tr ng nh n th y: t t c tiêu trong vùng này u b nhi m M incognita, R similis và Helicotylenchus spp., trong ó tuy n trùng M incognita chi m ưu th Tuy n trùng Meloidogyne incognita (Kofoid & White, 1919; Chitwoot, 1949) là loài tuy n trùng có ph m vi phân b r ng trên ph m vi toàn th... n trùng M incognita có ph bi n t thì ch có: 15 m u m u trong t và r c a cây h tiêu, trong 100 m u r và t và không có m u r nào là không có tuy n trùng, 11 t và 25 m u r có m t tuy n trùng cao > 1.000 con / 50g Như v y các tác gi ngoài nư c và trong nư c t và 5 g r u cho r ng Meloidogyne incognita là loài tuy n trùng gây h i chính và ph bi n trên cây tiêu 1.5 M t s bi n pháp phòng tr tuy n trùng Meloidogyne. .. th gây ch t th c v t Ngoài ra, m t vài tuy n trùng có th làm gi m kh năng c a th c v t kháng l i s xâm nh p c a các tác nhân vi sinh v t gây b nh khác và làm cho tác h i i v i th c v t càng tr m tr ng thêm M t s tuy n trùng ký sinh chuy n hóa có kh năng mang truy n virus gây b nh cho th c v t Tuy n trùng ký sinh có th làm gi m 12,5% s n lư ng cây tr ng và thi t h i do tuy n trùng ký sinh i v i cây . Nghiên cứu tuyển chọn một số vi nấm ñối kháng trên tuyến trùng Meloidogyne spp. gây hại cây hồ tiêu tại Đăk Nông . 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn một số dòng vi nấm bản địa. NGUYÊN HOÀNG NGỌC DUYÊN “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI NẤM ĐỐI KHÁNG TRÊN TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HẠI CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK NÔNG” MÃ SỐ: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN. NGUYÊN HOÀNG NGỌC DUYÊN “NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ VI NẤM ĐỐI KHÁNG TRÊN TUYẾN TRÙNG MELOIDOGYNE SPP. GÂY HẠI CÂY HỒ TIÊU TẠI ĐĂK NÔNG” LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH