1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ 5 MỞ ĐẦU 5 1. Tính cấp thiết của đề tài 7 2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài 8 3. Điểm mới và ý nghóa khoa học, thực tiễn của đề tài 8 Chương 1. TỔNG QUAN 9 1.1. Tổng quan về rong Nâu [1] 9 1.2. Tổng quan về Alginate 11 1.2.1. Alginate[1][11] 11 1.2.2. Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11] 12 1.2.2.1. Đặc điểm, cấu tạo của Alginic 12 1.2.2.2. Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate. 14 1.2.3. Tính chất của một số loại keo Alginate 15 1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase 18 1.4. Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA) 19 1.4.1. Những nghiên cứu trong nước 19 1.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước 21 1.5. Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu 23 1.5.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8] 23 1.5.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 23 1.5.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6] 24 1.5.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận chế phẩm enzyme[3][4][5][7] 25 1.5.4.1. Phương pháp nuôi cấy 25 1.5.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme 26 Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Nội dung nghiên cứu. 28 2 2.2. Các phương pháp nghiên cứu[3][6][7][8] 29 2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 29 2.3.1. Bố trí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp algL 29 2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao 30 2.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật được lựa chọn 32 2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu dòch enzyme algL từ môi trường sinh khối . 33 2.3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phân cắt các loại Natri alginate khác nhau bằng dung dịch enzyme thu được 34 2.3.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác đònh hoạt độ enzyme 35 2.3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL 36 2.3.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL 38 Sơ đồ 2.3.8: Ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL 38 2.3.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL 39 2.3.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để thu hồi algL từ dòch enzyme 40 Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41 3.1. Kết quả nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp enzyme algL 41 3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh algL cao 42 3.3. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật đã chọn 44 3.4. Kết quả thí nghiệm phân cắt các loại natri alginate bằng dung dòch enzyme thu được 45 3 3.5 Kết quả đònh danh vi sinh vật 47 3.5.2. Kết quả nhuộm Gram và sinh hóa đònh danh bằng hệ thống IDS14GNR 48 3.5.3. Kết quả giải trình tự gene 16S trên máy CEQ 8000 và tra cứu trên BLAST SEARCH 49 3.6. Kết quả thí nghiệm xác đònh hoạt độ enzyme 51 3.7. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL do vi sinh vật sinh ra 53 3.8. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng phân cắt của algL 54 3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của algL 56 3.10. Kết quả thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để tách chiết algL từ dòch enzyme 58 3.11. Đề xuất quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL từ vi khuẩn Klebsiella sp 60 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63 4.1. Kết luận 63 4.2. Đề xuất ý kiến 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70 PHỤ LỤC 2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 75 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT E: Enzyme S: Cơ chất Na-alginate dd: dung dòch OA: Oligo Alginate vsv: vi sinh vật algL: Alginate lyase Na-alg: Natri alginate EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid 5 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ STT TÊN BẢNG Trang 1 Bảng 1.2.3. Nhiệt độ phân hủy của các loại Alginte khác nhau 16 2 Bảng 1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ oligo alginate đến khả năng nảy mầm của hạt thóc giống 19 3 Bảng 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dung dòch Na- alginate khác nhau 44 4 Bảng 3.5.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đònh danh 47 5 Bảng 3.10. Ảnh hư ởng của nhiệt độ đến hoạt động của alginate lyase 55 TÊN HÌNH 1 Hình 1.2.2.1a :Công thức cổ điển của hai đơn vò monomeric trong axit Alginic 12 2 Hình 1.2.2.1b: Hình thể dạng ghế của axit Uronic 13 3 Hình 1.2.2.1c: Cấu tạo của axit Alginic 13 4 Hình 1.2.2.1d : Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức cổ điển (công thức phối cảnh) 13 5 Hình 1.2.2.2a: Công thức cấu tạo Na-alginate 14 6 Hình 1.2.2.2b: Công thức cấu tạo Ca-alginate 15 7 Hình 1.4.2a: nh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate (Oligo- M) chưa bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo- G) chưa bảo hoà lên sự dài ra của rể cây cà rốt và cây lúa 20 8 Hình 1.4.2b: Ảnh hưởng của nồng độ hổn hợp oligo- G đến sự dài ra của rể cây càrốt và lúa . Hình 1.4.2c: Ảnh hưởng của mức độ đồng trùng hợp oligo- G đến sự dài ra của rể cây càrốt à lúa . Độ dài của rể xác đònh sau 8 và 15 ngày. (nồng độ 0,75mg/ml) 21 9 Hình 3.1a: VSV có khuẩn lạc màu trắng sữa (C1) 40 10 Hình 3.1b: VSV có khuẩn lạc màu mỡ gà (C2) 40 6 11 Hình 3.3a. Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường thạch I 43 12 Hình 3.3b. Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường thạch chỉ có Na- alginate 1,5% và soi dưới kính hiển vi vật kính 100x 43 13 Hình 3.5.1. Khuẩn lạc vi sinh vật phân lập trên các môi trường khác nhau 46 14 Hình 3.5.2. Hình ảnh tế bào vi sinh vật phân lập được 47 15 Hình 3.5.3. Sơ đồ giải trình tự gene 16S của chủng vi sinh vật phân lập 49 TÊN ĐỒ THỊ 1 Đồ thò 3.2. Mức độ hao tổn độ nhớt của dung dòch Na- alginate 1% theo thời gian phân cắt 41 2 Đồ thò 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dd Na- alginate 1% khác nhau theo thời gian phân cắt 44 3 Đồ thò 3.6a. Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dòch Na- alginate 1% theo nồng độ Enzyme 50 4 Đồ thò 3.6b. Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dòch Na- alginate 1% theo nồng độ Enzyme 51 5 Đồ thò 3.7. Ả nh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của Klebsiella sp và hoạt độ enzyme algL 52 6 Đồ thò 3.8. Ả nh hưởng các ion kim loại đến hoạt lực của enzyme algL 53 7 Đồ thò 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của enzyme algL 55 7 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Rong biển là nguồn lợi biển cung cấp các chất keo quan trọng như Agar, Alginate, Carrageenan dùng trong công nghệ thực phẩm và các ngành công nghiệp khác. Trên thế giới từ những năm 1980 rong biển đã được quan tâm nghiên cứu. Năm 1930 công nghệ chế biến các chất Alginate, Manitol, Agar phát triển mạnh và ngày càng ứng dụng nhiều trong thực tế, đặc biệt là ở các nước Nhật Bản, Mỹ và Trung Quốc. Theo Luning (1990) tổng sản lượng của Alginate là 35.000 tấn.[1] Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng của Alginate trong các ngành công nghiệp như: Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công nghệ dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học, nghiên cứu khoa học… Kết quả của các công trình nghiên cứu ứng dụng alginate trong nông nghiệp cho thấy rằng, mạch alginate sau khi cắt mạch có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát triển đối với cây trồng [9][10][12][13][14]. Với ứng dụng này, thiết nghó việc nghiên cứu các phương pháp cắt mạch alginate để sản xuất chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật là rất cần thiết nhằm tăng năng suất cây trồng và tạo ra các sản phẩm có giá trò tốt từ đó nâng cao giá trò kinh tế là một hướng quan trọng đang được các nhà khoa hoc Việt Nam quan tâm. Chính vì lẽ đó, đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thuỷ phân alginate” là rất cần thiết, góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp và đời sống sản xuất ở nước ta. 8 2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài  Mục đích, nhiệm vụ Đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng sinh tổng hợp alginate lyase cao. Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh vật đã tuyển chọn trong môi trường thích hợp sau đó lựa chọn phương pháp thích hợp để thu nhận chế phẩm alginate lyase từ môi trường nuôi cấy và bước đầu nghiên cứu ứng dụng cắt mạch alginate. Xác đònh hoạt độ của enzyme alginate lyase theo phương pháp đo độ nhớt dung dịch alginate 1% trước và sau khi phân cắt. 3. Điểm mới và ý nghóa khoa học, thực tiễn của đề tài  Điểm mới của đề tài Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về phân cắt alginate bằng phương pháp sinh học. Enzyme alginate lyase có thể ứng dụng được vào nông nghiệp để sản xuất ra chế phẩm tăng trưởng thực vật ít độc hại cho con người và góp phần giảm làm giảm ô nhiễm môi trường.  Ý nghóa khoa học và thực tiễn Kết quả của đề tài góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về công nghệ sinh học và ứng dụng của nó vào các lónh vực của đời sống xã hội đặc biệt là trong công nghệ sản xuất enzyme, nông nghiệp và một số ngành công nghiệp khác. Kết quả của đề tài cũng mở rộng đầu ra cho ngành công nghiệp alginate của Việt Nam. Bên cạnh đó các công ty sản xuất thuốc tăng trưởng thực vật cũng có thể ứng dụng để sản xuất ra một chế phẩm tăng trưởng thực vật ít gây độc hại cho con người và môi trường. 9 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rong Nâu [1]  Ngành rong Nâu là một trong những ngành có giá trò kinh tế cao. Rong Nâu có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số loài và số chi tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm. Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng. Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt.  Thành phần hoá học của rong Nâu + Sắc tố Sắc tố rong Nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xanthophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tuỳ theo tỷ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục. Nhìn chung sắc tố của rong Nâu khá bền. + Gluxit − Monosachride Monosacharide quan trọng trong rong Nâu là đường Manitol được Stenhouds phát hiện năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Manitol có công thức tổng quát là : HOCH 2 – (CHOH) 4 – CH 2 OH Manitol tan được trong ancol, dễ tan trong nước có vò ngọt. Hàm lượng từ 14 ÷ 25% trọng lượng khô tuỳ thuộc vào điều kiện sống. − Polysacharide 10  Alginic: là một polysacharide tập trung giữa ở vách tế bào, là thành phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong Nâu Alginic và muối của nó có nhiều công dụng trong ngành công nghiệp, nông học, y học và thực phẩm. Hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu khoảng 2 ÷ 4% so với rong tươi và 13 ÷ 15% so với rong khô. Hàm lượng phụ thuộc vào loại rong, điều kiện đòa lý môi trường mà rong sinh sống. Theo tài liệu tổng kết của Miyake (1995) cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở các vùng biển Liên Xô cũ là 13 ÷ 40% Theo tài liệu phân tích của các chuyên gia Bộ Thuỷ sản cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở Hải Phòng là 22 ÷ 40%, trong khi đó, rong Nâu ở vùng biển Phú Yên và Khánh Hoà cao hơn hẳn. Hàm lượng Alginic có trong các loài rong ở Miền Trung Việt Nam là khá cao, dao động từ 12,3 ÷ 39,4% so với trọng lượng khô tuyệt đối, tuỳ thuộc vào loài và vùng đòa lý. Trong đó, loài rong S. mcclurei và Turbinaria ornata có hàm lượng Alginic cao nhất khoảng 35,9 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối. Nếu so sánh tất các vùng biển thì rong ở vùng biển Khánh Hoà có hàm lượng Alginic cao hơn cả (từ 26,2 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối). − Axit Fucxinic: có tính chất giống với axit Alginic. Axit Fucxinic tác dụng với axit Sunfuric tạo thành hợp chất có màu tuỳ thuộc vào nồng độ axit Sunfuric. − Fuccoidin: là loại muối giữa axit Fuccoidin với các kim loại hoá trò khác nhau như Ca, Cu, Zn. Fuccoidin có tính chất gần giống với axit Alginic, nhưng hàm lượng thấp hơn Alginic. − Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong Nâu, thường gặp ở dạng bột không màu, không mùi và có hai loại hoà tan và không hoà tan trong nước. [...]... dung nghiên cứu Những nội dung nghiên chính trong đề tài được trình bày trên sơ đồ sau: Phân lập, tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp alginate lyase trong tự nhiên Nuôi cấy chủng vi sinh vật ở 37oC, trong 2 ngày Sinh khối và tách chiết alginate lyase từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn Bước đầu phân cắt các alginate khác nhau bằng alginate lyase Xác đònh hoạt độ alginate lyase Đònh danh vi sinh vật sinh. .. method) 18 1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase R Scott Doubet và Ralph S Quatrano (1982), thuộc trường Đại học Oregen State Nghiên cứu phân lập các vi khuẩn biển có khả năng sinh Lyase đặc hiệu cắt mạch Alginate Cho thấy các Alginate lyase được chiết rút từ môi trường của một số vi sinh vật đã được phân lập Các lyase này được sinh ra nhờ môi trường có alginate tự nhiên và có hoạt tính với cả block... vật sinh Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng phân cắt alginate của alginate lyase Nghiên cứu tách chiết alginate lyase từ dòch sinh khối bằng dung môi thích hợp Thu thập số liệu và đưa ra kết luận Sơ đồ 2.1: Những nội dung nghiên cứu chính 29 2.2 Các phương pháp nghiên cứu[ 3][6][7][8] 2.2.1 Phân lập vi sinh vật bằng kỹ thuật pha loãng 2.2.2 Kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng... vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu vật hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu giống ở dạng thuần khiết Các vi sinh sinh vật thuần khiết chỉ bao gồm các tế bào được sinh ra từ tế bào ban đầu Hầu hết các ứng dụng công nghệ sinh học đều liên quan đến vi c sử dụng giống thuần Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết đều dựa trên kỹ thuật pha loãng, thường gồm các bước sau: chuẩn... nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao Khuẩn lạc vi sinh vật sau khi phân lập Nuôi cấy và sinh khối vi sinh vật Thu hồi dòch enzyme Phân cắt dung dòch alginate 1% Lựa chọn chủng vi sinh thích hợp - Nhiệt độ: 370C - pH = 7,0 – 7,5 - tỷ lệ E/S = 4/10 31 Sơ đồ 2.3.2: Bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp algL cao Môi trường và điều kiện nuôi cấy... lạc vi sinh vật khác − Đối với các khuẩn lạc vi sinh vật khác nhau, tiến hành nuôi cấy và sinh khối trong các hộp lồng và bình tam giác khác nhau Làm lạnh dòch sinh khối thu được xuống 30C, rồi ly tâm với tốc độ 10.000v/p ở nhiệt độ 100C trong 30’ Thuỷ phân dung dòch natri alginate bằng các dòch enzyme thu được sau ly tâm ở điều kiện nhất đònh để lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng enzyme. .. 10-5 Để dung dòch vi sinh vật ngấm vào môi trường trong vài phút Lật ngược hộp lồng petri đã cấy vi sinh vật, nuôi trong tủ ấm ở 370C, trong thời gian 2 ngày Sau 2 ngày nuôi cấy kiểm tra các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch, nếu các khuẩn lạc mọc riêng lẻ có hình dạng, màu sắc giống nhau thì có thể kết luận chủng vi sinh vật là thuần khiết, hoặc có thể kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật bằng... vi sinh vật Phương pháp này có ưu điểm là không có chất kích thích, sản lượng enzyme cao và chỉ cần một lượng nhỏ chất dinh dưỡng Phương pháp này có nhiều thuận lợi trong vi c kiểm tra và tạo điều kiện tốt cho các pha riêng biệt đó là pha sinh trưởng và pha chế tạo enzyme, vì vậy hiệu quả cao 1.5.4.2 Thu hồi chế phẩm enzyme Các chế phẩm enzyme được ứng dụng trong thực tế với nhiều dạng khác nhau Trong. .. axit manuronic và axit guluronic của chuỗi polymer alginate Lyase đặc hiệu đối với axit guluronic được tách chiết từ môi trường, trong khi đó lyase đặc hiệu với axit manuronic được tách chiết từ tế bào vi khuẩn.[20] Năm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko Yamaguchi và Takashi Nakamura thuộc trường Đại học Fukuoka, Nhật Bản Nghiên cứu hai chủng vi sinh vật sinh enzyme alginate lyase Cho thấy... thái của vi sinh vật cũng như hình dáng, kích thước, khả năng di động, sự hình thành bào tử, sinh sản… Các tiêu bản tạm thời được sử dụng để quan sát hình thái vi sinh vật Đối với tiêu bản tạm thời có nhuộm màu, thuốc nhuộm vi sinh vật phải không độc hoặc ít độc đối với vi sinh vật cần quan sát và phải pha loãng đến nồng độ nhất đònh để đảm bảo vi sinh vật vẫn còn sống và di động Tế bào sống và tế bào . chiết Enzyme Alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thuỷ phân alginate là rất cần thiết, góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào nông nghiệp và đời sống. một trong những nghiên cứu đầu tiên về phân cắt alginate bằng phương pháp sinh học. Enzyme alginate lyase có thể ứng dụng được vào nông nghiệp để sản xuất ra chế phẩm tăng trưởng thực vật. State. Nghiên cứu phân lập các vi khuẩn biển có khả năng sinh Lyase đặc hiệu cắt mạch Alginate. Cho thấy các Alginate lyase được chiết rút từ môi trường của một số vi sinh vật đã được phân lập.