i LI CAM OAN Tụi xin cam ủoan ủõy l ủ ti nghiờn cu ca tụi. Cỏc kt qu nghiờn cu trong lun vn l trung thc v cha ủc ai cụng b trong bt kỡ cụng trỡnh no khỏc. Mi s giỳp ủ v cỏc thụng tin trớch dn ủó ủc nờu rừ ngun gc. Ngi thc hin Tửụỷng Ngoùc Thuùc Uyeõn B GIO DC V O TO TRNG I HC TY NGUYấN TNG NGC THC UYấN NGHIấN CU QUY TRèNH TO HT V CC IU KIN TI U NHM TNG CNG KH NNG KHNG KHUN CA NANO CHITOSAN LUN VN THC S SINH HC BUễN MA THUT, NM 2010 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành tốt luận văn này, tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: -PGS.TS Nguyễn Anh Dũng, người hướng dẫn khoa học trực tiếp, ñã tận tình hướng dẫn phương pháp nghiên cứu và ñóng góp nhiều ý kiến quý báu, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. -Lãnh ñạo Trường Đại học Tây Nguyên, tập thể các Thầy Cô giáo Phòng Sau ñại học, Khoa Khoa học tự nhiên -Công nghệ, Khoa Nông Lâm nghiệp. - Các Thầy Cô giáo ñã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu trong quá trình học tập. - Ban Giám hiệu Trường THPT chuyên Nguyễn Du. - Các bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Trân trọng cảm ơn. Người thực hiện Tưởng Ngọc Thục Uyên iii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN …………………………………………………………………… i LỜI CẢM ƠN ……………………………………………………………………… ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG …………………………………………………………… vi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ viii DANH MỤC CÁC HÌNH x PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1 1.1.Tính cấp thiết 1 1.2. Mục tiêu ñề tài 2 1.3.Ý nghĩa khoa học 3 1.4.Ý nghĩa thực tiễn 3 1.5.Giới hạn ñề tài 3 PHẦN 2: TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 4 2.1. Tổng quan về chitosan ………………………………………………. 4 2.2. Tổng quan về nano chitosan 6 2.2.1. Các phương pháp tạo vật liệu nano chitosan 6 2.3. Ứng dụng của chitin, chitosan và các dẫn suất trong y học 14 2.3.1.Hoạt tính kháng ung thư 16 2.3.2.Giảm cholesterol trong máu (hypocholesterolemic activity) 17 2.3.3.Đặc tính chống oxi hóa 17 2.3.4.Màng phủ làm lành vết thương (would healing) 18 2.3.5.Sử dụng trong cấy ghép răng 19 2.3.6. Ứng dụng trong ly giải chậm thuốc 19 2.3.7. Hoạt tính kháng khuẩn ……………………………………… 21 iv 2.3.8. Hoạt tính chống ñông máu của dẫn xuất sulfated chitosan 27 2.3.9.Ứng dụng làm tá chất cho vaccin 28 2.4. Tổng quan về Escherichia coli và Staphylococcus aureus 31 2.4.1 Vi khuẩn Escherichia coli 31 2.4.2. Vi khuẩn Staphylococcus aureus 36 PHẦN 3: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 3.1. Nội dung nghiên cứu 40 3.1.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 40 3.1.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 40 3.2. Phương pháp nghiên cứu 40 3.2.1. Hóa chất 40 3.2.2. Địa ñiểm nghiên cứu 41 3.2.3. Thời gian thực hiện 41 3.2.4. Phương pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 41 3.2.5. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano Chitosan 43 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 50 4.1.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến kích thước hạt, ñiện tích và tính ổn ñịnh hạt nano chitosan 50 4.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS:TPP (w/w) ñến kích thước và ñiện thế hạt nano chitosan 56 4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .62 4 2.1.Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả năng kháng khuẩn 62 4.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ nano chitosan ñến khả v năng kháng khuẩn 64 4.2.3.Nghiên cứu ảnh hưởng của khối lượng phân tử chitosan ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 69 4.2.4.Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ CS: TPP ( 4:1; 5:1; 6:1) ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 73 4.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan 76 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 5.1. Kết luận 79 5.2 Kiến nghị 79 vi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU , CÁC CHỮ VIẾT TẮT Số thứ tự Chữ ciết tắt Nghĩa của các chữ viết tắt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 HPLC MIC DNA pDNA DEMC TPP PMAA CS CMC CNP TEM SEM kDa E.coli S.aureus LMWC Sắc kí lỏng cao áp Nồng ñộ ức chế tối thiểu Deoxyribo nucleic acid Plasmide deoxyribo nucleic acid Diethylmethylchitosan Tri polyphosphate Polymethacrylic axit Chitosan Cacboxymethyl cellulose Chitosan nanoparticles Kính hiển vi ñiện tử truyền quang Kính hiển vi ñiện tử quyét Kilo Dalton Escherichia coli Staphylococcus aureus Khối lượng phân tử thấp vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1. Ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến kích thước, ñiện thế và khả năng hấp phụ BSA 8 2.2. Tính chất vật lý của chitosan oligomer/CMC nanoparticles hấp phụ với pDNA 11 2.3. Các tính chất cơ bản của chitosan liên quan ñến ứng dụng trong sinh y học 15 2.4. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của chitosan và DEMC 24 2.5. Chỉ số MIC của một số dẫn suất chitosan trên một số vi khuẩn 25 2.6. Chỉ số MIC (µg/ml) và MBC (µg/ml) của kháng sinh Doxycycline và Chitosan nanoparticles 27 4.1. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử của chitosan ñến tính chất hạt nano chitosan 50 4.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ Chitosan: TPP ñến tính chất hạt nano chitosan (Chitosan 30kDa) 56 4.3. Ảnh hưởng của nồng ñộ ñến khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus 62 4.4. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 65 4.5. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan (CS:TPP = 6:1) và chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67 4.6. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng viii kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70 4.7. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 72 4.8. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74 4.9. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS:TPP ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75 4.10. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 76 4.11. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 77 ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ STT Tên ñồ thị Trang 4.1. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng lượng phân tử 20 kDa 53 4.2. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng lượng phân tử 30 kDa 54 4.3. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với trọng lượng phân tử 300 kDa 55 4.4. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 3:1 57 4.5. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 4:1 58 4.6. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 5:1 59 4.7. Phân bố kích thước hạt của dung dịch nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 6:1 60 4.8. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS:TPP là 7:1 61 4.9. Khả năng kháng khuẩn của chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli và Staphylococcus aureus 63 4.10. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 66 4.11. Khả năng kháng khuẩn của nano chitosan và chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 67 4.12. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 70 4.13. Ảnh hưởng của khối lượng phân tử ñến khả năng kháng x khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 73 4.14. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 74 4.15. Ảnh hưởng của tỉ lệ CS : TPP ñến khả năng kháng khuẩn của nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 75 4.16. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Escherichia coli 77 4.17. Ảnh hưởng của pH môi trường ñến khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan trên vi khuẩn Staphylococcus aureus 78 [...]... ng ch ph m chitosan Vi t Nam, c ch sinh trư ng c a vi khu n Escherichia coli, nghiên c u t o h t nano chitosan làm tá ch t mi n d ch cho vaccin cúm A H5N1 và xây d ng mô hình th nghi m trên Xu t phát t ó tôi ã ch n ng v t tài: Nghiên c u qui trình t o h t và các i u ki n t i ưu nh m tăng cư ng kh năng kháng khu n c a nano chitosan 1.2 M c tiêu tài 1.2.1 Xây d ng quy trình t o h t nano chitosan b... 61 xiii B GIÁO D C VÀ ÀO T O TRƯ NG I H C TÂY NGUYÊN TƯ NG NG C TH C UYÊN NGHIÊN C U QUY TRÌNH T O H T VÀ CÁC I U KI N T I ƯU NH M TĂNG CƯ NG KH NĂNG KHÁNG KHU N C A NANO CHITOSAN LU N VĂN TH C SĨ SINH H C BUÔN MA THU T, NĂM 2010 xiv 1 PH N 1 M U 1.1.Tính c p thi t Khoa h c và công ngh nano là m t lĩnh v c m i trong nh ng năm g n ây nhưng ã và ang phát tri n nhanh chóng vì s hi u qu và nh ng ng d ng... nanon chitosan trong TPP v i n ng chitosan khác nhau, kh i lư ng phân t chitosan khác nhau và t l chitosan/ TPP khác nhau K t qu cho th y kh i lư ng phân t và n ng chitosan càng l n thì kích thư c h t nano chitosan càng l n [41] Theo Quan Gan thì t l chitosan/ TPP càng l n thì kích thư c h t nano chitosan càng l n pH cũng có nh hư ng nh t chitosan, pH thích h p nh t nh n kích thư c h t nano t o h t nano. .. nano chitosan là 5.5 8 Quan Gan (2007) nghiên c u t o nano chitosan làm ch t mang protein, thu c b ng phương pháp t o h t nano trong TPP Kích thư c h t nano chitosan cũng như i n tích c a h t nano chitosan ph thu c vào n ng kh i lư ng phân t c a chitosan N ng và càng th p thí kích thư c h t càng nh và i n tích càng dương l n[42] B ng 2.1 nh hư ng c a n ng chitosan n kích thư c, i n th và kh năng h... (2008) cũng nghiên c u t o nano chitosan –TPP N ng chitosan s d ng là 0.5-2 mg/ml Kích thư c h t nano chitosan n m trong kho ng 100300 nm[16] 9 Marcia (2008), nghiên c u t o nano chitosan s d ng polymethacrylic acid (PMAA) Cơ ch c a quá trình t o h t nano chitosan tương t như v i TPP, theo sơ sau: Chitosan nanoparticl Hình 2.2 Cơ ch t o h t nano chitosan v i acid methacrylic CS: Chitosan PMAA (polymethacrylic... b nghiên c u làm tăng kh năng h p thu insulin qua niêm m c mũi b ng h t nano chitosan và PEG-h t nano chitosan, kích thư c h t nano là 150-300 nm Hi u qu h p thu insulin qua niêm m c mũi th m u PEG-h t nano chitosan cao hơn so v i PEG -chitosan là 30- 40% Kích thư c h t nano càng nh , di n tích b m t càng l n và i n tích dương trên b m t càng cao là nguyên nhân nh hư ng n kh năng h p thu insulin vào... ch t dinh dư ng i vào t bào; ngăn c n s nh p vào t bào ( c bi t là chitosan có kh i lư ng phân t th p LMWC ) - Chitoan có kh năng k t h p v i DNA và nh v y chitosan có kh năng c ch t ng h p RNA và protein - Chitosan có kh năng g n k t gây ông t , k t t a t bào vi khu n và d n n gi t ch t t bào Cơ ch tác ng c a chitosan và chitosan oligomer i v i E coli và S aureus ư c Eaton (2008) nghiên c u b ng kính... Shedaghi (2008) nghiên c u ch t o trimethyl h t nano chitosan v t li u ly gi i ch m insulin K t qu cho th y nh t trong trimethyl h t nano chitosan n diethylmethyl nano ng h c ly gi i c a insulin nh và kéo dài hơn [45] Shadeghi (2008) nghiên c u h p ph chitosan, chitosan insulin trên v t li u nano nanoparticles trimethylchitosan nanoparticles (TMC) K t qu v insulin khá n làm (DEMC) và ng h c ly gi i... lâu, ho t hóa t bào cơ th , gia tăng kh năng mi n d ch, gi i th c , b o v gan trong cơ c bi t h t nano chitosan có kích thư c nano, có nhi u ưu i m như di n tích ti p xúc và i n tích dương l n hơn chitosan, do ó có ti m năng tăng cư ng ho t tính sinh h c, trong ó có ho t tính kháng khu n Vì v y, vi c nghiên c u t o h t nano nh m tăng cư ng tính kháng khu n c a chitosan ng d ng trong b o qu n th c ph... ng s n ph m như d ng mi ng, b t m n, h t, màng, t m x p (scaffolds), bông, s i và gel [43] 2.2 T ng quan v nano chitosan 2.2.1 Các phương pháp t o v t li u nano chitosan Chitosan nanoparticles là các h t chitosan có kích thư c nanomet Chitosan nanoparticles do có kích thư c siêu nh nên d dàng i qua màng t bào, di n tích và i n tích b m t c c l n nên ư c ng d ng nhi u trong sinh y h c mang thu c, vaccine, . đề tài: Nghiên cứu qui trình tạo hạt và các ñiều kiện tối ưu nhằm tăng cường khả năng kháng khuẩn của nano chitosan 1.2. Mục tiêu ñề tài 1.2.1. Xây dựng quy trình tạo hạt nano chitosan. pháp nghiên cứu qui trình tạo hạt nano chitosan 41 3.2.5. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano Chitosan 43 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 4.1. Nghiên cứu qui trình tạo hạt. thước và ñiện thế hạt nano chitosan 56 4.2. Nghiên cứu thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của hạt nano chitosan .62 4 2.1 .Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng ñộ chitosan ñến khả năng kháng khuẩn 62