ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI QUANG CÔNG ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN JAK2-V617F TRONG HỘI CHỨNG TĂNG SINH TỦY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÙI QUANG CÔNG ỨNG DỤNG KĨ THUẬT REALTIME PCR ĐỂ PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN JAK2-V617F TRONG HỘI CHỨNG TĂNG SINH TỦY KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH KĨ THUẬT XÉT NGHIỆM Y HỌC Khóa: QH.2019.Y Người hướng dẫn: TS Dương Quốc Chính ThS Trần Tuấn Anh Hà Nội – 2023 LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới TS Dương Quốc Chính - Giảng viên Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, ThS Trần Tuấn Anh - Giảng viên thỉnh giảng Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy hướng dẫn bảo tận tình, cho tơi nhiều ý kiến nhận xét q báu truyền đạt cho tinh thần học hỏi, làm việc nghiêm túc q trình tơi thực khóa luận Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Thị Hồng Nhung - Giảng viên Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội, người thầy ln tận tâm giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu, tạo điều kiện thuận lợi sẵn sàng giải đáp thắc mắc để tơi hồn thành khóa luận Để thực tốt khóa luận này, tơi trân trọng cảm ơn tài trợ Viện Huyết học Truyền máu - Trung ương cho đề tài Trong trình học tập, làm việc thực khóa luận, tơi nhận giúp đỡ thầy cô, anh chị bạn sinh viên làm việc thực tập Khoa Di truyền - Sinh học phân tử Tôi xin chân thành cảm ơn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, toàn thể thầy cô giáo Trường Đại học Y dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu trình học tập trường Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè ln bên cạnh, động viên, khích lệ tơi lúc khó khăn q trình thực khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AS-PCR : Allele specific PCR (Phản ứng khuếch đại chuỗi allen đặc hiệu) BCR : Breakpoint cluster region CALR : Calreticulin ADN : Acid deoxyribonucleic TTCNP : Bệnh tăng tiểu cầu nguyên phát ĐHC : Bệnh đa hồng cầu HCXT : Hội chứng xơ tủy JAK2 : Janus kinase (Gen JAK2) JAK2-V617F : Janus Kinase Valin 617 Phenylalamin Mastermix : Hỗn hợp thành phần (Enyme, MgCl2, dNTPs) tạo hệ cho phản ứng đệm MPNs : Myeloproliferative neoplasm (Hội chứng tăng sinh tủy) MPL : Myeloproliferative leukemia virus oncogen (Gen MPL) NC : Normal Control (Mẫu chứng âm) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) RT-PCR : Realtime - PCR POS : Positive (Mẫu chứng dương) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế giới) MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hội chứng tăng sinh tủy 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học hội chứng tăng sinh tủy 1.1.2 Tổng quan chế bệnh gen liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy 1.2 Tổng quan gen JAK2-V617F 1.2.1 Gen JAK2 1.2.2 Đột biến gen JAK2 1.3 Một số kỹ thuật phát đột biến gen hội chứng tăng sinh tủy 1.3.1 Polymerase chain reaction (PCR) AS - PCR 1.3.2 Realtime – PCR 10 1.3.2.1 Nguyên lý kỹ thuật Real - time PCR 10 1.3.2.2 Taqman probe (Đầu dò) sử dụng Realtime - PCR 11 CHƯƠNG – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 13 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 13 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu 13 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu 14 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu 14 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.3 Đánh giá nồng độ chất lượng ADN máy quang phổ Nano Drop 15 2.3.4 Xét nghiệm phát đột biến gen JAK2-V617F 15 2.4 Quản lý phân tích số liệu 16 2.5 Đạo đức nghiên cứu 16 CHƯƠNG – KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17 3.1 Mô tả đặc điểm đối tượng nghiên cứu 17 3.1.1 Đặc điểm tuổi giới 17 3.2.2 Taqpath sử dụng cho xét nghiệm Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F 19 3.2.3 Tối ưu chu trình nhiệt cho xét nghiệm Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F 20 3.2.4 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime - PCR phát đột biến JAK2-V617F 22 3.3 Ứng dụng quy trình Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F 23 3.3.1 Phân bố tỷ lệ đột biến nghiên cứu 23 3.3.2 Kết phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với JAK2-V617F 23 CHƯƠNG – BÀN LUẬN 25 4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 25 4.1 Hồn thiện quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F hội chứng tăng sinh tủy 25 4.2 Ứng dụng quy trình Realtime - PCR phát đột biến JAK2-V617F 27 KẾT LUẬN 29 KIẾN NGHỊ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 31 PHỤ LỤC – DANH DÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protein JAK2 Hình 1.2 Gen JAK2 đột biến exon 14 Hình 1.3 Biểu đồ khuếch đại phản ứng Realtime - PCR 11 Hình 1.4 Nguyên lý hoạt động Taqman probe Realtime - PCR 12 Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu 14 Hình 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới 17 Hình 3.2 Kết sử dụng Taqpath Mutiplex master mix với mẫu 41-45 19 Hình 3.3 Kết sử dụng Taqpath qPCR master mix với mẫu 41-45 20 Hình 3.4 Kết Realtime – PCR sử dụng chu trình nhiệt chuẩn với 10 mẫu chọn ngẫu nhiên 21 Hình 3.5 Kết Realtime - PCR sử dụng chu trình nhiệt tối ưu với 10 mẫu chọn ngẫu nhiên 22 Hình 3.6 JAK2-V617F_ phương pháp AS-PCR 23 Hình 3.7 JAK2-V617F_ phương pháp RT-PCR 23 Hình 3.8 Phân bố tỷ lệ đột biến nhóm nghiên cứu 23 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime - PCR phát đột biến JAK2-V617F 16 Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố tuổi đối tượng nghiên cứu 17 Bảng 3.2 Phân bố thể bệnh nhóm đối tượng nghiên cứu 18 Bảng 3.3 Nồng độ độ tinh ADN 18 Bảng 3.4 Chu trình nhiệt sau tối ưu 21 Bảng 3.5 Kết phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với 24 Bảng 4.1 Độ nhạy phương pháp PCR nghiên cứu 27 ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng tăng sinh tủy dạng rối loạn dị dòng hệ huyết học, bao gồm bệnh lý: bạch cầu kinh dòng tủy (BCKDT), đa hồng cầu (ĐHC), tăng tiểu cầu nguyên phát (TTCNP) hội chứng xơ tủy (HCXT) Ngồi thơng số huyết học đặc trưng phân típ gia tăng huyết sắc tố bệnh ĐHC, tăng sản tiểu cầu TTCNP, hay gia tăng mức tế bào megakaryocyte HCXT, đột biến gen JAK2 đặc điểm di truyền học bật phân típ bệnh Giá trị chẩn đốn phân tích đột biến JAK2 hội chứng tăng sinh tủy (HCTST) tốt, Tổ chức Y tế Thế giới xác nhận thành lập phân loại khối u ác tính huyết học Phổ biến đột biến JAK2-V617F, tìm thấy nhiều bệnh nhân: 65% đến 97% trường hợp ĐHC, 23% đến 57% trường hợp TTCNP, 35% đến 57% số trường hợp xơ tủy mạn tính (XTMT) [9] Bệnh tăng hồng cầu nguyên phát (THCNP) bệnh ĐHC nguyên phát mắc phải, tỷ lệ mắc bệnh |1-3| 100.000 người năm chẩn đoán thường xuyên người độ tuổi từ 60 đến 70 tuổi [10] TTCNP có tỷ lệ mắc hàng năm |0.5-2.5| 100.000 người Bệnh xảy lứa tuổi (kể trẻ em), bệnh chủ yếu chẩn đoán bệnh nhân khoảng từ 30-60 tuổi HCXT xảy với tỷ lệ mắc |0.5-1.5| 100.000 người năm Độ tuổi trung bình chẩn đốn thường >70 tuổi [11] Theo ước tính hiệp hội bệnh bạch cầu ung thư hạch (Leukemia & Lymphoma Society), Mỹ số người mắc HCTST gần 300.000 bệnh nhân, với gần 20.000 ca mắc năm [12] Thời gian sống sót trung bình người mắc bệnh ĐHC 13,5 năm, bệnh TTCTP 19,8 năm, HCXT 5,9 năm, với hệ số nguy 1.8 - khoảng tin cậy 95% [13] Đồng thời việc phải chịu chi phí điều trị tốn gây ảnh hưởng đến chất lượng sống bệnh nhân trở thành gánh nặng kinh tế cho gia đình xã hội Những công bố đột biến gen JAK2 (2005) [8], làm tiền đề cho nghiên cứu JAK2, phòng nghiên cứu xét nghiệm sinh học phân tử xây dựng nhiều phương pháp khác để phát đột biến JAK2-V617F mẫu bệnh phẩm người mắc HCTST Trong đột biến JAK2-V617F phát kỹ thuật Allen - specific PCR (AS - PCR) phương pháp thường quy áp dụng Viện Huyết Học - Truyền Máu Trung Ương số phòng xét nghiệm Việt Nam Khi vận dụng phương pháp AS-PCR phịng xét nghiệm chúng tơi nhận thấy điểm hạn chế phương pháp như: thời gian chạy xét nghiệm lâu, bao gồm nhiều bước, tiêu tốn nhiều trang thiết bị hóa chất, ngồi cịn có nguy lây nhiễm chéo thực bước điện di sau PCR Kỹ thuật Realtime – PCR (RT-PCR) phương pháp hữu hiệu để phát đột biến JAK2-V617F Kỹ thuật RT-PCR có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhiều so với PCR truyền thống Đặc biệt với RTPCR, phản ứng thực hệ thống kín, khơng cần thêm thao tác phân tích kết sau phản ứng, rút ngắn thời gian thực giảm thiểu nguy lây nhiễm Nhận thấy ưu việt RT-PCR so với phương pháp truyền thống tiến hành thực đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Realtime - PCR để phát đột biến JAK2-V617F hội chứng tăng sinh tủy” Với mục tiêu: Hồn thiện quy trình xét nghiệm đột biến JAK2-V617F kỹ thuật Realtime-PCR Ứng dụng quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F xác định đột biến gen bệnh nhân tăng sinh tủy mạn tính kỹ thuật Realtime-PCR CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan hội chứng tăng sinh tủy 1.1.1 Khái niệm đặc điểm dịch tễ học hội chứng tăng sinh tủy Hội chứng tăng sinh tủy (HCTST) bệnh ảnh hưởng đến cách tế bào máu sản xuất thể Các bệnh tăng sinh tủy coi rối loạn dòng tế bào Rối loạn dòng tế bào xảy ADN tế bào gốc tủy xương có nhiều thay đổi Các tế bào gốc tạo máu loại tế bào máu non có khả phát triển thành ba dịng tế bào máu chính: hồng cầu, bạch cầu hay tiểu cầu Các thay đổi tế bào gốc (tạo máu) khiến cho tế bào sinh sản liên tục, tạo tế bào bất thường, từ chúng phát triển thành hay nhiều loại tế bào máu Bệnh tăng sinh tủy thường tiến triển nặng qua thời gian số lượng tế bào máu dư thừa tích lũy tủy xương máu ngoại vi Cơ thể thường sản xuất hàng tỷ tế bào máu ngày Quá trình xảy bên tủy xương Tủy xương chứa tế bào gốc phát triển trưởng thành thành tất tế bào máu mà thể cần: Hồng cầu, bạch cầu tiểu cầu Mỗi loại tế bào có cơng việc cụ thể để thực bên thể Khi người chẩn đoán mắc HCTST, có điều khơng ổn q trình sản xuất tế bào máu họ Tủy xương bắt đầu sản xuất nhiều tế bào máu đơi q HCTST Tổ chức Y tế Thế giới xếp vào loại ung thư máu tủy xương sản xuất tế bào máu cách khơng kiểm sốt Bốn loại HCTST phổ biến chia thành rối loạn khác loại ảnh hưởng đến mức độ tế bào máu theo cách khác Bốn loại chẩn đoán thường xuyên là: 1TTCNP, 2ĐHC, 3HCXT, Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy (BCKDT) Bệnh TTCNP loại ung thư tăng sinh tủy đặc trưng gia tăng số lượng tiểu cầu, tăng sản megakaryocytic xu hướng xuất huyết huyết khối Triệu chứng dấu hiệu bao gồm yếu, đau đầu, dị cảm đầu chi, chảy máu, hồng ban với thiếu máu cục Hầu hết người phát triển TTCNP chẩn đốn tuổi 60 trở lên, chứng rối loạn trở nên phổ biến người trẻ tuổi, đặc biệt phụ nữ 40 tuổi Bệnh ĐHC rối loạn tăng sinh tủy mạn tính đặc trưng gia tăng hồng cầu bình thường hình thái (dấu hiệu), có tế bào trắng tiểu cầu 10 đến 30% bệnh nhân cuối tiến triển thành xơ tủy suy tủy; 1,0 đến 2,5% chuyển lơ xê mi cấp Tăng nguy xuất huyết huyết khối động tĩnh mạch Các biểu thông thường gồm có lách to, biến cố mạch máu lớn vi mạch (ví dụ, thiếu máu cục thoáng qua, ban đỏ đau, đau nửa đầu mắt) ngứa nước không rõ nguyên nhân (ngứa tiếp xúc với nước nóng) Đa hồng cầu nguyên phát bệnh phổ biến rối loạn tăng sinh tủy, tỷ lệ mắc Mỹ ước tính 1,9/100.000 với tỷ lệ mắc tăng theo tuổi tác Nó chủ yếu ảnh hưởng đến người trung niên người cao tuổi khơng chẩn đốn trẻ em Hội chứng xơ tủy (HCXT) chứng rối loạn ảnh hưởng đến cách tế bào máu sản xuất thể Những người 60 tuổi có nhiều khả mắc bệnh nhất, nam nữ có nguy mắc bệnh HCXT ảnh hưởng đến tủy xương, “nhà máy” bên thể sản xuất tế bào máu Bệnh nhân mắc HCXT thường có số lượng hồng cầu, bạch cầu và/hoặc tiểu cầu thấp dẫn đến thiếu máu, giảm bạch cầu trung tính giảm tiểu cầu tương ứng HCXT coi bệnh gặp Số người chẩn đoán mắc HCXT năm hai đến ba trường hợp 100.000 bệnh phổ biến nam nữ Nó chủ yếu ảnh hưởng đến người trung niên người cao tuổi chẩn đoán trẻ em Bệnh bạch cầu kinh dòng tủy xuất tế bào gốc vạn chuyển dạng ác tính tăng sinh tủy, dẫn tới sản xuất thừa mức hạt bạch cầu hạt chưa trưởng thành Ước tính Hoa Kỳ vào năm 2020 có khoảng 8.450 trường hợp mắc bệnh bạch cầu kinh dòng tủy khoảng 1.130 trường hợp tử vong Tuổi trung bình bệnh nhân mắc bệnh bạch cầu kinh dòng tủy 64 tuổi Nguy trung bình suốt đời bệnh bạch cầu kinh dòng tủy Hoa Kỳ hai giới khoảng 0,19% (1 526) 1.1.2 Tổng quan chế bệnh gen liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy Hội chứng tăng sinh tủy chứng minh có liên quan đến số đột biến gen BCR-ABL JAK2-V617F Trong đó, BCR-ABL nguyên nhân gây bệnh bạch cầu mạn dòng tủy, JAK2-V617F gây bệnh đa hồng cầu, tăng tiểu cầu tiên phát xơ tủy tiên phát Việc xác định đột biến soma gen JAK2-V617F tìm thấy khoảng 90% bệnh nhân cải thiện đáng kể phương pháp chẩn đoán cho rối loạn Cho đến nay, việc ngăn ngừa biến cố mạch máu mục tiêu điều trị quản lý bệnh nhân mắc bệnh TTCPNP Ngoài ra, số phương pháp điều trị tế bào học chủ yếu dùng cho bệnh nhân có nguy cao bị biến chứng mạch máu Các loại thuốc kích thích tế bào sử dụng bao gồm hydroxyurea, chủ yếu sử dụng bệnh nhân lớn tuổi interferon α dùng chủ yếu bệnh nhân trẻ tuổi.[1] Các nghiên cứu gần khoảng bệnh có liên quan đến hội chứng tăng sinh tủy có liên quan đến gen Janus kinase (JAK2), gen thụ thể thrombopoietin (MPL) calreticulin (CALR) Cả JAK2 MPL protein điều chỉnh trình sản xuất tế bào máu Calreticulin tham gia vào dòng canxi tế bào, điều quan trọng tín hiệu tăng trưởng Nghiên cứu gần bệnh TTCNP khoảng 50-60% bệnh nhân có đột biến (hoặc thay đổi) protein JAK2, 25-30% có đột biến gen CALR 2-5% bệnh nhân khác có đột biến protein MPL Khoảng 50-60% người mắc HCXT có đột biến (hoặc thay đổi) protein JAK2 Hơn 30% bệnh nhân có đột biến gen CALR, khoảng 5-10% bệnh nhân có đột biến thụ thể hormone tiểu cầu MPL Trong bệnh PV khoảng 95% người có đột biến gen JAK2-V617F Hơn 2% bệnh nhân có đột biến phần khác gen JAK2 gọi exon 12 Trên thực tế, nhiều bệnh nhân chuyển từ dạng sang dạng khác hội chứng tăng sinh tủy thời gian điều trị Từ năm 2005, giới biết đến vai trò gen JAK2 với điểm đột biến V617F chế bệnh sinh hội chứng tăng sinh tủy Đột biến gen JAK2-V617F gặp hầu hết bệnh đa hồng cầu thực, gây bệnh tăng sinh tủy khoảng 50% tăng tiểu cầu tiên phát xơ tủy Bình thường gen JAK2 có vai trị phát triển dịng tủy bình thường truyền tín hiệu từ receptor Cytokin yếu tố phát triển Interleukin (IL- 3), yếu tố tạo máu Erythropoietin, yếu tố kích thích tạo cụm đồng hạt mơnơ (GM- CSF, G- CS.F) Thrombopoetin (yếu tố kích thích tạo dịng mẫu tiểu cầu) Đột biến gen JAK2-V617F làm vai trò tự điều hòa JAK2 gây tăng sinh khơng kiểm sốt tế bào máu Tuy nhiên từ đột biến gây bệnh tăng sinh tủy dịng khác chưa rõ ràng Hiện nay, có nhiều báo cáo cơng bố góp phần chẩn đốn bệnh di truyền định hướng chữa bệnh lâm sàng, Từ phát cấu trúc chức sinh học thành phần cấu tạo nên ADN, nhân loại bước khám phá nhiều vấn đề khác nhau, đặt tảng cho nhiều nghiên cứu khác Các acid deoxyribonucleic tạo nên gen, giúp trì chức tế bào mức độ phân tử, quy định cấu trúc di truyền sinh học tế bào Cần phân biệt thường biến biến dị di truyền, thường biến biến dị biểu kiểu hình tác động điều kiện mơi trường, thể mức phản ứng kiểu gen điều kiện môi trường, thường biến không di truyền Biến dị di truyền biến đổi kiểu gen biểu khơng kiểu hình, ngun nhân ngẫu nhiên chế tái tổ hợp hệ gen tác nhân đột biến lên ADN hay Nhiễm sắc thể tác nhân hoá học, vật lý, sinh học Đột biến gen biến đổi cấu trúc gen, biến đổi xảy trình giảm phân tạo giao tử tế bào sinh dục đột biến trình phát triển tế bào sinh dưỡng, hay gọi đột biến soma Đột biến soma gây nên biến đổi kiểu hình thể mức độ mô quan hệ cá thể không di truyền cho hệ sau qua giao tử, thơng thường đột biến gen tạo ưu tiến hố khả phá vỡ tính ổn định gen sinh vật, thay vào đột biến thường trung tính có hại, động vật người đột biến soma thường gây nên hư hỏng mức độ tế bào, mơ quan ví dụ ung thư Qua giao tử đột biến soma ứng dụng nhiều ghép cành, chiết cành thực vật, đặc biệt ăn quả, để đạt giống tốt, chống chịu sâu bệnh điều kiện khắc nghiệt khác Nếu đột biến gen trội biểu ngồi thể gọi thể khảm 1.2 Tổng quan gen JAK2-V617F 1.2.1 Gen JAK2 Janus kinase (JAK2) protein thuộc nhóm Janus kinase (JAK1, JAK2, JAK3 TYK2) có hoạt tính tyrosine kinase tế bào chất, thành phần quan trọng, tham gia vào q trình truyền tín hiệu từ receptor yếu tố kích thích tạo máu (growth factor) đóng vai trị chủ chốt đường JAK-STAT (truyền tín hiệu hoạt hóa phiên mã) Gen JAK2 nằm cánh ngắn NST số 9, (9p24) gồm 15 exon, dài khoảng 152kb, chứa trình tự nucleotid mã hóa cho việc tổng hợp protein JAK2 Chuỗi tín hiệu JAKSTAT bao gồm thành tố: receptor yếu tố kích thích tạo máu có bề mặt tế bào, Janus kinase (JAK) protein đóng vai trị yếu tố truyền tín hiệu hoạt hóa phiên mã Protein JAK2 hoạt hóa receptor màng tế bào gắn với yếu tố kích thích tạo máu Sau dimer hoạt hóa, JAK2 gắn với phân tử STAT, phosphoryl hóa để phân tử vào nhân tế bào, gắn lên ADN hoạt hóa vùng gen đích, thu nhận tín hiệu, bắt đầu q trình phiên mã tăng sinh biệt hóa tế bào [14, 15] Protein JAK2 có trọng lượng phân tử khoảng 130 kDa, gồm 1132 acid amin Cấu trúc phân tử protein JAK2 diện vùng (JH1  JH7) có vùng có cấu trúc chức quan trọng: JH1 vùng có hoạt tính tyrosine kinase (chứa tyrosine cần thiết để kích hoạt JAK2), JH2 miền pseudokinase có cấu trúc tương tự vùng JH1 vùng có hoạt tính enzyme số chức điều chỉnh quan trọng Ở trạng thái bình thường, hoạt tính tyrosine kinase vùng JH1 bị ức chế tác dụng vùng JH2 Hình 1.1 Cấu trúc phân tử protein JAK2 1.2.2 Đột biến gen JAK2 Vào năm 2005, bốn nhóm nghiên cứu độc lập phương pháp nghiên cứu khác phát đột biến điểm G  T exon 14 gen JAK2 vị trí nucleotid 1849 Sự thay G  T gen JAK2 làm biến đổi acid amin valine codon 617 thành phenylalanine xảy vùng JH2 protein JAK2, đặt tên đột biến JAK2-V617F Hình 1.2 Gen JAK2 đột biến exon 14 [16] Đột biến JAK2-V617F làm phá vỡ khả tự điều hịa vùng JH2 gây tăng hoạt tính tyrosine kinase protein này, chí khơng có yếu tố kích thích tạo máu kết tăng sinh khơng kiểm sốt tế bào tạo máu Đột biến JAK2-V617F hoạt hóa cytokine receptor dòng tủy (bao gồm: EPO, MPL (Tpo-R) granulocyte colony stimulating factor receptor (GCSF) – yếu tố kích thích cụm dạng bạch cầu hạt) Dạng đột biến thường gặp 96% bệnh nhân đa hồng cầu nguyên phát, 55% trường hợp bệnh nhân tăng tiểu cầu tiên phát 65% trường hợp xơ tủy nguyên phát Đây xét nghiệm giúp phân biệt với bệnh lý đa hồng cầu di truyền đột biến gen mang thông tin tổng hợp EPO – R Như vậy, thấy đột biến JAK2-V617F có vai trị quan trọng chế sinh bệnh học nhóm bệnh nhân tăng sinh tủy mạn ác tính [17] Người ta quan sát thấy đột biến JAK2-V617F xảy từ tế bào gốc sinh máu tế bào nguồn sinh máu đa tiềm Đột biến phát tất tất dòng tế bào sinh máu, bao gồm lympho B lympho T Cho đến nay, người ta chưa phát thấy đột biến JAK2-V617F người khỏe mạnh hay bệnh nhân có tình trạng tăng sinh tủy phản ứng Đây đặc điểm quan trọng giúp chẩn đoán phân biệt bệnh tăng sinh tủy mạn tính với bệnh tăng sinh tủy phản ứng [6] 1.3 Một số kỹ thuật phát đột biến gen hội chứng tăng sinh tủy 1.3.1 Polymerase chain reaction (PCR) AS - PCR PCR phản ứng hóa học tổng hợp ADN dựa khuôn mẫu ban đầu nhờ hoạt động enzyme ADN polymerase Phản ứng dựa thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ, trải qua giai đoạn: (1) ADN khn biến tính từ sợi đơi thành sợi đơn nhiệt độ cao (92º đến 95º) (2) Nhiệt độ hạ thấp xuống từ 55º đến 65º để tạo điều kiện cho mồi gắn vào ADN khuôn (3) Nhiệt độ tăng lên khoảng 72º cho enzyme ADN polymerase hoạt động tổng hợp kéo dài chuỗi ADN nhờ trình tự mồi Sau bước nhiệt độ, chu trình phản ứng lặp lại liên tiếp từ 30 – 35 lần Lượng ADN tạo A x 2n (trong A số khn ADN ban đầu, n số chu kỳ nhiệt phản ứng) Allele specific PCR (AS – PCR): Là kỹ thuật cải tiến PCR thông thường, ứng dụng sàng lọc phát đột biến di truyền Kỹ thuật dựa nguyên tắc thiết kế đoạn mồi có trình tự sai khác so với trình tự đặc hiệu nucleotid đầu 3’ để ngăn cản trình kéo dài chuỗi ADN enzyme Tag polymerase phản ứng PCR Trong phương pháp này, ống phản ứng PCR thiết kế song song: ống thứ sử dụng cặp mồi primer đặc hiệu cho allele bình thường, ống thứ hai sử dụng cặp mồi để khuếch đại allele đột biến Vì vậy, phản ứng PCR thường có sản phẩm: Nếu trường hợp dị hợp tử ống PCR có băng sản phẩm điện di, trường hợp đồng hợp mang gen bệnh ống thứ hai xuất băng sản phẩm, ngược lại, đồng hợp mang gen bình thường có ống thứ xuất băng đặc hiệu[2, 3] 1.3.2 Realtime – PCR 1.3.2.1 Nguyên lý kỹ thuật Real - time PCR Realtime - PCR kỹ thuật PCR mà kết khuếch đại ADN hiển thị sau chu kỳ nhiệt phản ứng thông qua hệ thống nhận biết máy Các sản phẩm trình PCR gắn huỳnh quang dựa vào ngưỡng phát huỳnh quang, từ biết lượng ADN đích ban đầu có ống phản ứng Sử dụng chất huỳnh quang gắn vào sợi ADN kép nên kỹ thuật PCR định lượng có độ nhạy độ đặc hiệu cao nhiều so với PCR truyền thống Đặc biệt với RT-PCR, phản ứng thực hệ thống kín, khơng cần thêm thao tác phân tích kết sau phản ứng, rút ngắn thời gian thực giảm thiểu nguy lây nhiễm Kết RT-PCR thể qua biểu đồ khuếch đại phản ứng biểu thị máy sau chu kỳ nhiệt phản ứng Biểu đồ biểu biện cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận nguồn ánh sáng kích thích (trục Y) tương ứng với gia tăng chu kỳ nhiệt (trục X) phản ứng Sự khuếch đại ADN phản ứng RT-PCR trải qua giai đoạn sau: - Giai đoạn ủ: Xảy chu kỳ đầu phản ứng ADN đích nhân lên gắn huỳnh quang số lượng cịn ít, cường độ huỳnh quang thấp chưa đủ phát ánh sáng để máy ghi nhận Giai đoạn biểu thị đường nằm ngang biểu đồ khuếch đại phản ứng - Giai đoạn lũy thừa: Khi số lượng ADN đích đạt đến ngưỡng định, sản phẩm ADN có gắn huỳnh quang phát cường độ 10 huỳnh quang đủ để máy ghi nhận Trong giai đoạn này, số lượng ADN cường độ huỳnh quang tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt phản ứng Lúc đường biểu diễn khuếch đại phản ứng đồ thị bắt đầu lên - Giai đoạn bình nguyên: Là giai đoạn kết thúc trình phản ứng, lượng dNTP cạn kiệt dần enzyme Tag polymerase hoạt động khơng cịn hiệu Giai đoạn số lượng ADN đích cường độ huỳnh quang chậm dần đạt đến bình nguyên đường nằm ngang biểu đồ khuếch đại phản ứng [3, 7] Hình 1.3 Biểu đồ khuếch đại phản ứng Realtime - PCR 1.3.2.2 Taqman probe (Đầu dò) sử dụng Realtime - PCR Taq man probe đoạn oligonucleotide có trình tự đặc hiệu với ADN đích (hoặc sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ADN đích) với đầu 5’ gắn chất phát huỳnh quang (reporter) đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh quang tương ứng (quencher) Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu ống phản ứng có bắt cặp probe lên trình tự đặc hiệu sản phẩm khuếch đại dẫn đến phát huỳnh quang nhận nguồn sáng kích thích Cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào số lượng probe bắt cặp (phụ thuộc vào số lượng ADN đặc hiệu diện ống phản ứng) 11 Reporter: Có thể sử dụng nhiều loại hóa chất để làm reporter với thơng số chi tiết bước sóng nguồn sáng kích thích, bước sóng huỳnh quang phát Quencher: Chất hấp phụ huỳnh quang tương ứng phát từ reporter Có loại quencher sử dụng phổ biến:  Quencher phát huỳnh quang: Khi hấp phụ huỳnh quang phát từ reporter, lượng chuyển thành dạng ánh sáng  Quencher phát nhiệt: Năng lượng hấp phụ chuyển thành dạng nhiệt, có khả hấp phụ huỳnh quang mạnh Nguyên lý hoạt động Taqman probe RT-PCR: (Phát huỳnh quang giai đoạn kéo dài) Dưới hoạt tính 5’-3’ exonuclease enzyme Taq polymerase thủy giải probe, phân tách reporter quencher Năng lượng quencher hấp phụ (dưới dạnh ánh sáng nhiệt) tỷ lệ thuận với sản phẩm ADN khuếch đại Hình 1.4 Nguyên lý hoạt động Taqman probe Realtime - PCR Nhiệt độ nóng chảy (Tm) probe phải cao nhiệt độ nóng chảy primer từ - 10ºC Nếu primer bắt cặp với ADN đích trước Taqman probe khơng thủy giải Ánh sáng huỳnh quang reporter phát đến đâu quencher hấp phụ đến đó, lượng khơng chuyển thành dạng ánh sáng nhiệt 12 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 200 đối tượng người Việt Nam mắc HCTST chẩn đoán Viện Huyết Học - Truyền Máu Trung Ương từ tháng năm 2021 đến tháng 12 năm 2021 gồm: 133 bệnh nhân TTCNP, 48 bệnh nhân ĐHCNP, bệnh nhân XTNP, 13 bệnh nhân mắc HCTST chưa phân loại Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: - Bệnh nhân chẩn đoán tăng sinh tủy mạn ác tính theo tiêu chuẩn hướng dẫn chẩn đốn WHO 2016 [18, 19] - Các bệnh nhân chẩn đoán mắc HCTST làm xét nghiệm JAK2-V617F phương pháp AS - PCR khoảng thời gian từ tháng năm 2021 đến tháng 12 năm 2021 Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân: - Bệnh nhân thuộc nhóm tăng sinh tủy mạn có Ph (+) - Các bệnh nhân chẩn đoán tăng sinh tủy thứ phát: sau cắt lách, tăng sinh tủy phản ứng lao, tăng hồng cầu thứ phát, tăng tiểu cầu thứ phát 2.1.2 Hóa chất thiết bị nghiên cứu * Hóa chất: E.Z.N.A ®Blood DNA Mini Kit; Kit tách chiết DNA thương mại; Nuclease Free Water; dNTPs 2.5mM; TaqPath qPCR Master Mix; Rnase&Dnase Free Water * Thiết bị nghiên cứu: Máy RT-PCR Quanstudio 5; Máy Nanodrop; Tủ an toàn sinh học ESCO Class II BSC; Máy ly tâm tốc độ cao (hãng SMART LABASSIST); Máy vortex Model DLAB MX-S; Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl hãng Eppendoff; Đầu 10 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl, hãng: Thermo; Ống Eppendorf loại vô trùng 13 2.2 Thời gian địa điểm nghiên cứu Thời gian nghiên cứu: từ tháng 06 năm 2021 đến tháng 05 năm 2022 Địa điểm nghiên cứu: Khoa Di truyền - Sinh học phân tử, Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Thiết kế nghiên cứu: - Nghiên cứu cắt ngang mô tả kết hợp hồi cứu 2.3.2 Phương pháp nghiên cứu - Chọn ngẫu nhiên 200 mẫu ADN tách chiết tổng số mẫu ADN lưu bệnh nhân mắc HCTST từ 01/2021 – 12/2021 (Chọn ngẫu nhiên trải mẫu từ tháng dến tháng 12) - Các kỹ thuật xét nghiệm tiến hành nghiên cứu:  Kiểm tra nồng độ độ tinh ADN máy Nanodrop  Realtime-PCR  Kiểm tra độ nhạy quy trình RT-PCR Tối ưu quy trình phát đột biến sử dụng kỹ thuật Realtime - PCR Thu thập mẫu nghiên cứu (Mẫu lưu ADN) Kiểm tra nồng độ ADN, độ tinh mẫu nghiên cứu ỨNG DỤNG QUY TRÌNH REALTIME - PCR Kiểm tra độ nhạy quy trình Realtime - PCR Tiến hành kĩ thuật Realtime-PCR Hình 2.1 Sơ đồ tiến hành nghiên cứu 14 2.3.3 Đánh giá nồng độ chất lượng ADN máy quang phổ Nano Drop Nguyên lý: Dựa độ hấp phụ ánh sáng base nitơ bước sóng 260nm (A260) Phương pháp giúp đánh giá nồng độ độ tinh DNA Độ hấp thụ ánh sáng mẫu DNA pha lỗng đo bước sóng 260 280 nm Mẫu DNA sau kiểm tra nồng độ độ tinh lưu tủ âm 20ºC âm 80ºC Áp dụng định luật Beer-Lambert để tính tốn mật độ DNA: A = ECL Trong đó: A: Độ hấp thụ ánh sáng bước sóng định C: Nồng độ acid nucleid L: Chiều dài đường truyền ánh sáng qua mẫu hay độ dày cuvet (1 cm) E: Hệ số hấp thụ (đối với DNA E= 0,025 (mg/ml) -1cm-1) Tỷ số A260/A280 dùng để đánh giá độ tinh DNA A260/A280 ≈ 1.8 – 2.1 cho thấy DNA tinh 2.3.4 Xét nghiệm phát đột biến gen JAK2-V617F Phát đột biến JAK2-V617F kỹ thuật RT-PCR sử dụng Taqman probe Trong kỹ thuật này, RT-PCR mix thành phần PCR mix, chứa hai thành phần quan trọng để probe phát huỳnh quang có diện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu từ ADN đích, là: (1) Taqman probe, oligonucleotides có trình tự bổ sung với trình tự đặc hiệu ADN đích, trình tự dài khoảng 24 đến 30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi reporter) đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang phát từ reporter (2) Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease để có khả thủy giải cắt bỏ probe probe bắt cặp lên sợi khuôn cản đầu 3’ mồi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung 15 Bảng 2.1 Thành phần điều kiện phản ứng Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F Thành phần phản ứng Ý nghĩa Thể tích TaqPath qPCR MM Master mix 7,5 Primer JAK2_wt_F Mồi cho gen bình thường (chiều F) Primer JAK2_wt_R Mồi cho gen bình thường (chiều R) Primer JAK2-V617F_mut_F Mồi cho gen đột biến Primer JAK2V617F_R Mồi cho gen đột biến Probe JAK2_wt_P Probe phát gen bình thường 0,5 Probe JAK2-V617F_P Probe phát gen đột biến 0,5 DNA khn (100 ng) 2,5 Tổng thể tích 15 Phản ứng khuếch đại tiến hành phân tích hệ thống máy QuantStudio5 2.4 Quản lý phân tích số liệu - Các biến định tính mơ tả tần số tỷ lệ % - Các biến định lượng tính theo giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, giá trị lớn nhất, nhỏ 2.5 Đạo đức nghiên cứu - Nghiên cứu nhằm mục đích nghiên cứu, xây dựng ứng dụng quy trình RT-PCR để phát đột biến JAK2-V617F, không nhằm mục đích khác - Đề tài Viện Huyết Học - Truyền Máu Trung Ương thông qua trước triển khai - Các thông tin cá nhân, riêng tư đối tượng tham gia nghiên cứu đảm bảo giữ kín bí mật 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Mô tả đặc điểm đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Đặc điểm tuổi giới Trong nhóm nghiên cứu, số lượng bệnh nhân nữ 101 người chiếm tỷ lệ 51%, số lượng bệnh nhân nam 99 người, chiếm tỷ lệ 49% (hình 3.1) Số bệnh nhân ≤ 50 tuổi 59 người chiếm 29,5%, 51 – 70 tuổi 94 người chiếm 47% bệnh nhân ≥ 71 tuổi 47 người chiếm 23,5%, độ tuổi trung bình nhóm nghiên cứu 59,03, bệnh nhân nhỏ có độ tuổi bệnh nhân lớn 91 tuổi (bảng 3.1) Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố tuổi đối tượng nghiên cứu Khoảng tuổi Số lượng Tỷ lệ ≤ 50 tuổi 59 29,5% 51 – 70 tuổi 94 47% ≥ 71 tuổi 47 23,5% X p < 0,05 59,03 ± 15,21 ± SD Min - Max - 91 Nam Nữ 49% 99 51% 101 Hình 3.1 Phân bố đối tượng nghiên cứu theo giới 3.1.2 Đặc điểm thể bệnh nhóm bệnh nghiên cứu Trong nhóm nghiên cứu, số lượng bệnh nhân chẩn đoán mắc tăng tiểu cầu tiên phát 133 người, chiếm tỷ lệ lớn với 66,5%, bệnh nhân đa 17 hồng cầu nguyên phát chiếm tỷ lệ 24%, chiếm tỷ lệ nhỏ bệnh nhân xơ tủy nguyên phát 3% với người số lượng bệnh nhân mắc HCTST chưa phân loại 13 người chiếm tỷ lệ 6,5% (bảng 3.2) Bảng 3.2 Phân bố thể bệnh nhóm đối tượng nghiên cứu Phân bố Đa hồng cầu Tăng tiểu cầu Hội chứng nguyên phát xơ tủy Số lượng (n) 48 133 Tỷ lệ (%) 24% 66.5% Chưa phân loại Tổng số 13 200 3% 6.5% 100% 3.2 Hồn thiện quy trình Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F 3.2.1 Kết kiểm tra nồng độ độ tinh ADN Tiến hành đo nồng độ kiểm tra độ tinh máy Nano Drop, thu kết quả: Các mẫu nghiên cứu có nồng độ ADN > 100ng/ml độ tinh phù hợp để sử dụng phản ứng chạy RT-PCR (bảng 3.3) Bảng 3.3 Nồng độ độ tinh ADN Nồng độ ADN(ng/ μl) Độ tinh A260/A280 STT Tên mẫu Mẫu 206,4 1,9 Mẫu 15 794,1 1,88 Mẫu 35 209,7 1,9 Mẫu 55 121 1,87 Mẫu 75 107,8 1,92 Mẫu 105 245,9 1,89 Mẫu 135 131,7 1,87 Mẫu 155 112,9 1,89 Mẫu 175 152,3 1,88 10 Mẫu 200 138,6 1,91 18 3.2.2 Taqpath sử dụng cho xét nghiệm Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F Hướng tiếp cận phát đột biến JAK2V617F lựa chọn Taqpath cho phù hợp Có loại Taqpath chúng tơi lựa chọn là: 1Taqpath Mutiplex master mix; 2Taqpath qPCR master mix Hai loại Taqpath sử dụng cho xét nghiệm sinh học phân tử thường quy Viện Huyết học Kết thu sau thời gian chạy, phân tích thu sau: Biểu đồ khuếch đại Kênh nội kiểm Chu Chu kỳ kỳ Hình 3.2 Kết sử dụng Taqpath Mutiplex master mix với mẫu 41-45 Nhận xét: Kết sau thời gian chạy RT-PCR thu FAM (kênh nội kiểm) ta thấy tín hiệu huỳnh quang thu không ổn định Điển hình mẫu POS (chứng dương) thu tín hiệu huỳnh quang chu kì 24 mẫu NC (chứng âm) chu kì 22 19 Biểu đồ khuếch đại Chu kỳ Kênh nội kiểm Hình 3.3 Kết sử dụng Taqpath qPCR master mix với mẫu 41-45 Chúng nhận kết sau thời gian chạy Realtime-PCR thu FAM (kênh nội kiểm), theo đó: Mẫu H2O: Là mẫu không chứa ADN, chứa H2O thành phần tham gia phản ứng Kết khơng thu tín hiệu huỳnh quang từ mẫu này; Các mẫu POS, NC, 41, 42, 43, 44, 45 kết thu tín hiệu huỳnh quang ổn định, rõ nét (hình 3.4) 3.2.3 Tối ưu chu trình nhiệt cho xét nghiệm Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F Khi bước đầu tiếp cận với nghiên cứu việc phát đột biến JAK2-V617F phương pháp RT-PCR Chúng sử dụng chu trình chuẩn sử dụng chung cho phản ứng RT-PCR gồm giai đoạn: [Biến tính ban đầu 95 ˚C - giây biến tính 95 ˚C - 15 giây; Bắt cặp - kéo dài chuỗi 60 ˚C - phút lặp lại 40 chu kì] với 10 mẫu chọn ngẫu nghiên Kết thu sau thời gian chạy, phân tích sau: 20 Biểu đồ khuếch đại Chu kỳ Kênh đột biến Hình 3.4 Kết Realtime - PCR sử dụng chu trình nhiệt chuẩn với 10 mẫu chọn ngẫu nhiên Theo đó: Khơng thu tín hiệu huỳnh quang mẫu H20 Thu tín hiệu huỳnh quang mẫu POS chu kì 21, NC chu kì 37, mẫu chu kì 24, mẫu 10 chu kì 21, mẫu 24 chu kì 34, mẫu 46 chu kì 24, mẫu 57 chu kì 33, mẫu 90 chu kì 23, mẫu 105 chu kì 39, mẫu 130 chu kì 25, mẫu 179 chu kì 33, mẫu 186 chu kì 24 Tiếp theo chúng tơi nghiên cứu điều chỉnh lại chu trình nhiệt (bảng 3.4) Kết thu sau áp dụng chu trình nhiệt tối ưu sau: Bảng 3.4 Chu trình nhiệt sau tối ưu Stt Phản ứng Nhiệt độ Thời gian Chu kì Khởi đầu 50 phút Biến tính 60 30 giây Bắt cặp 95 phút kéo dài chuỗi 95 15 giây kéo dài chuỗi 61 40 giây 21 40 Biểu đồ khuếch đại Chu kỳ Kênh đột biến Hình 3.5 Kết Realtime - PCR sử dụng chu trình nhiệt tối ưu với 10 mẫu chọn ngẫu nhiên Theo đó: Mẫu H20 khơng thu tín hiệu huỳnh quang; Mẫu NC (chứng âm thu tín hiệu huỳnh quang chu kì 37; Mẫu POS (chứng dương) thu tín hiệu đột biến rõ nét, xuất sớm từ chu kỳ 21 phản ứng; Các mẫu 24, 57, 105, 179 (được xác định âm tính với đột biến) khơng thu tín hiệu đột biến; Các mẫu 1, 10, 46, 90, 130, 186 mẫu xác định dương tính với gen JAK2-V617F, kết có thu tín hiệu đột biến, kết tương thích với phương pháp AS-PCR 3.2.4 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime - PCR phát đột biến JAK2-V617F Tiếp theo tiến hành khảo sát độ nhạy phương pháp RTPCR so sánh với phương pháp AS-PCR phát đột biến JAK2-V617F HCTST Với phương pháp AS-PCR thực 13 mẫu ADN bệnh nhân thu giá trị ngưỡng phát đột biến nhỏ (LOD) 7,5% (hình 3.7) Tiến hành khảo sát tương tự phương pháp RT-PCR chúng tơi thu LOD 1% (hình 3.8) 22 Hình 3.6 JAK2-V617F_ phương pháp AS-PCR Biểu đồ khuếch đại Kênh đột biến Chu kỳ Hình 3.7 JAK2-V617F_ phương pháp RT-PCR 3.3 Ứng dụng quy trình Realtime-PCR phát đột biến JAK2-V617F 3.3.1 Phân bố tỷ lệ đột biến nghiên cứu Kết thu sau chạy 200 mẫu ADN bệnh nhân phương pháp RT-PCR cho thấy có 113 bệnh nhân mắc HCTST dương tính với JAK2-V617F chiếm 56,5% có 87 bệnh nhân âm tính với JAK2V617F chiếm 43,5% BIỂU ĐỒ PHÂN BỐ TỶ LỆ ĐỘT BIẾN JAK2-V617F (+) Âm tính 56,5% 43,5% 87 113 Hình 3.8 Phân bố tỷ lệ đột biến nhóm nghiên cứu So sánh với kết chạy AS-PCR quy trình thường quy 23 Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Kết thu có khác biệt kết mẫu số 51 mẫu số 89, quy trình RT-PCR cho kết dương tính với JAK2-V617F mẫu quy trình AS-PCR cho kết âm tính với mẫu 3.3.2 Kết phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với JAK2-V617F Sau chạy xong 200 mẫu ADN thu kết với 113 mẫu dương tính với JAK2-V617F 87 mẫu âm tính Trong số bệnh nhân ĐHC có 50% bệnh nhân dương tính với JAK2-V617F, TTCNP 57,14%, HCXT 66,67% bệnh nhân mắc HCTST chưa phân loại 53,85% (Bảng 3.5) Bảng 3.5 Kết phân bố tỷ lệ thể bệnh dương tính với JAK2-V617F Phân bố Đa hồng cầu Tăng tiểu cầu nguyên phát Tổng số 48 133 13 JAK2-V617F (+) 24 76 Tỷ lệ (%) 50% 57,14% 66.67% 53,85% 24 Hội chứng xơ tủy Chưa phân loại CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu Nghiên cứu tiến hành 200 bệnh nhân chẩn đoán mắc HCTST từ tháng năm 2021 đến tháng 12 năm 2021 Trong tỷ lệ bệnh nhân nam 51% bệnh nhân nữ 49% (hình 3.1), cho thấy tỷ lệ giới tính tương đương Các nghiên cứu công bố ghi nhận giới tính khơng ảnh hưởng đến HCTST [4, 5, 20] Trong nhóm nghiên cứu số lượng bệnh nhân mắc bệnh TTCNP 66,5%, ĐHC 24%, HCXT 3% bệnh nhân mắc HCTST chưa phân loại 6,5% (bảng 3.2) So sánh tỷ lệ phân bố thể bệnh đối tượng nghiên cứu với nghiên cứu khác giới cho thấy có khác biệt tỷ lệ cá thể mang bệnh dẫn đến tỷ lệ phân bố thể bệnh khác khác biệt khác quẩn thể bệnh nhân nghiên cứu [21, 22] 4.2 Hồn thiện quy trình xét nghiệm gen JAK2-V617F hội chứng tăng sinh tủy Kể từ công bố JAK2-V617F, việc phát đột biến trở thành quy trình thơng thường nhiều phịng thí nghiệm Kể từ năm 2005, nhiều xét nghiệm để phát định lượng JAK2-V617F mô tả, đánh giá so sánh.[23-25] Để tăng độ nhạy chẩn đoán JAK2-V617F, số kỹ thuật sử dụng phòng nghiên cứu giới số phòng xét nghiệm Việt Nam Đầu tiên phương pháp giải trình tự gen NGS (mặc dù giải trình tự tiêu chuẩn vàng để sàng lọc đột biến, phù hợp để phát JAK2-V617F đột biến xuất mức độ thấp so với trình tự kiểu hoang dã) sử dụng xét nghiệm AS-PCR (kĩ thuật có độ nhạy cao, nhiên thời gian thực xét nghiệm lâu, có nguy ngoại nhiễm có nhiều bước thực sau PCR) Sau đó, kĩ thuật RT-PCR, qua kinh nghiệm tích lữu từ việc thực xét nghiệm gen JAK2-V617 25 với tham khảo thêm nghiên cứu nước chúng tơi tiến hành nghiên cứu để hồn thiện kĩ thuật RT-PCR nhằm áp dụng vào thường quy Bước đầu tiếp cận với nghiên cứu lựa chọn sử dụng Taqpath mutiplex master mix Kết thu cho thấy tín hiệu huỳnh quang thu bị gián đoạn, khơng tạo nên đồ thị điển hình RT-PCR, gây khó khăn cho việc đọc kết dễ gây nhầm lẫn khó áp dụng vào thường quy Sau chúng tơi sử dụng taqpath qPCR master mix, kết thu tín hiệu huỳnh quang kênh màu ổn định cho đồ thị điển hình chu trình RT-PCR Như vậy, chúng tơi bước đầu thành cơng việc tối ưu hóa quy trình thơng qua việc lựa chọn Taqpath phù hợp cho phản ứng RT-PCR Khi áp dụng chu tình nhiệt chuẩn cho quy trình xét nghiệm [biến tính ban đầu 95 ˚C - giây; biến tính 95 ˚C - 15 giây; bắt cặp kéo dài chuỗi 60 ˚C - phút lặp lại 40 chu kì] Kết cho thấy tín hiệu huỳnh quang tất mẫu có chứa khn ADN khơng thu tín hiệu mẫu H20 (khơng chứa ADN), nhiên đồ thị lại thu tín hiệu huỳnh quang lên muộn chu kì >32 kênh màu đột biến mẫu âm tính Điều gây khó khăn cho việc đọc kết quả, dễ nhầm lẫn dẫn đến dương tính giả Nên chúng tơi tiến hành giảm thời gian tăng nhiệt độ gắn mồi chu trình nhiệt lên (95 ˚C – 15 giây 61 ˚C - 40 giây) x 40 chu kì Kết sau điều chỉnh thu tín hiệu huỳnh quang tất mẫu chứa ADN không thu tín hiệu huỳnh quang mẫu H20 khơng cịn thu tín hiệu huỳnh quang muộn kênh màu đột biến mẫu âm tính Kết giúp cho việc phân tích dễ dàng hơn, xác áp dụng thường quy Có thể thấy rằng, quy trình RT-PCR sau hồn thiện cho tín hiệu huỳnh quang ổn định, rõ nét, mẫu dương tính thu tín hiệu rõ nét với kết AS-PCR chạy trước Kết minh chứng cho việc tối ưu thành cơng quy trình xét nghiệm phát đột biến JAK2V617F hội chứng tăng sinh tủy Tiếp theo sau chu trình tối ưu xong chúng tơi tiến hành khảo sát độ nhạy quy trình vừa hồn thiện so sánh với nghiên cứu J Mon Diagn (bảng 4.1) Kết so sánh cho thấy độ nhạy phương pháp RT-PCR nghiên cứu tương đồng cho thấy phương pháp RT26 PCR số phương pháp có độ cao, cho kết nhanh chóng Với ngưỡng phát LOD 1% quy trình RT-PCR xây dựng hồn tồn đảm bảo độ nhạy cho quy trình xét nghiệm thường quy phục vụ cho việc chẩn đoán bệnh nhân HCTST Bảng 4.1 Độ nhạy phương pháp PCR nghiên cứu Phương pháp LOD Realtime-PCR 1% AS-PCR 7,5% Realtime-PCR 0.01 - 5% the JAK2-V617F Allele by Real-Time PCR[26] AS-PCR/ARMS 0.01 – 5% (J Mol Diagn) PCR-RFLP – 20% Tên nghiên cứu Nghiên cứu Sensitive Detection and Quantification of 4.3 Ứng dụng quy trình Realtime - PCR phát đột biến JAK2-V617F Chẩn đoán HCTST, bệnh ĐHC, bệnh TTCNP HCXT tương đối khó khăn thiếu dấu hiệu chẩn đoán Gần đây, việc tế bào tạo máu nhận đột biến gen JAK2 mô tả khiếm khuyết di truyền gây rối loạn tăng sinh tủy Đột biến dẫn đến kích hoạt cấu thành JAK2, tyrosine kinase liên quan đến tín hiệu thụ thể cytokine Đây đột biến điểm xuất 95% trường hợp ĐHC 60% trường TTCNP HCXT Hiện có nhiều phương pháp sinh học phân tử áp dụng để phát đột biến công bố giới [5].Trong trường đại học Pretoria nhóm nghiên cứu tiến hành xây dựng quy trình RT-PCR để xác định đột biến JAK2-V617F 60 bệnh nhân nghi ngờ mắc HCTST gửi từ bệnh viện Hàn Lâm Steve Biko 27 Kết nghiên cứu 100% thống phân tích giải trình tự RT-PCR, xét nghiệm phát đột biến tất 24 số 60 mẫu thử nghiệm chứa đột biến [27] Với độ nhạy phân tích tốt xét nghiệm này, RT-PCR coi phù hợp để sử dụng phịng thí nghiệm chẩn đốn tạo thành cơng cụ chẩn đốn tốt Tại Việt Nam việc chẩn đoán bất thường di truyền nhóm bệnh MPNs chủ yếu dựa kỹ thuật truyền thống phản ứng khuếch đại allen đặc hiệu AS-PCR hay kỹ thuật giải trình tự gen hệ (Next Genration Sequencing - NGS) Kỹ thuật NGS có độ xác cao, nhiên chi phí tốn đòi hỏi nhiều phương tiện kỹ thuật đại, chuyên sâu mà sở xét nghiệm thực Các kỹ thuật truyền thống AS-PCR hay Multiplex-PCR có độ nhạy khơng cao thời gian trả kết kéo dài Trên sở giới có nhiều nghiên cứu RT-PCR phát đột biến JAK2-V617F, Việt Nam bệnh viện trường đại học Cần Thơ nghiên cứu để tối ưu quy trình RT-PCR để phát đột biến JAK2-V617F 33 bệnh nhân chẩn đoán mắc hội chứng tăng sinh tủy Kết thu cho thấy phương pháp RT-PCR nhanh chóng, mạnh mẽ, đơn giản nhạy so với quy phương pháp AS-PCR [4] Nhận thấy ưu việt phương pháp RT-PCR, với tham khảo nghiên cứu ngồi nước, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tối ưu quy trình RT-PCR để phát đột biến JAK2-V617F Trong trình nghiên cứu lựa chọn Taqman phù hợp cho tín hiệu huỳnh quang thu ổn định nhất, tối ưu chu trình nhiệt thành cơng giúp cho việc đọc kết thuận lợi hạn chế tối đa sai sót bỏ qua mẫu có tỷ lệ đột biến thấp (âm tính giả) việc trả kết Trong nghiên cứu này, chúng tơi áp dụng quy trình quy trình tối ưu cho 200 bệnh nhân mắc HCTST Kết khảo sát cho thấy độ nhạy phương pháp RT-PCR tốt hẳn so với AS-PCR, đột biến JAK2-V617F xuất 50% trường hợp ĐHC, 57.14% TTCNP 66.67% HCXT Tỷ lệ đột biến JAK2-V617F TTCNP HCXT tương đương với tỷ lệ nghiên cứu giới [28], nhiên tỷ lệ đột biến khơng tương đồng bệnh ĐHC khác biệt quần thể nghiên cứu 28 KẾT LUẬN Từ kết đạt đưa số kết luận sau: - Chúng tơi tối ưu hồn thiện quy trình xét RT-PCR phát đột biến JAK2-V617F hội chứng tăng sinh tủy với ngưỡng phát đạt đến LOD 1% - Áp dụng thành cơng quy trình cho 200 bệnh nhân mắc hội chứng tăng sinh tủy cho thấy tỷ lệ đột biến gen JAK2-V617F bệnh ĐHC, TTCNP HCXT 50%, 57,14% 66,67% 29 KIẾN NGHỊ - Ứng dụng quy trình kỹ thuật tối ưu để nghiên cứu đặc điểm gen đột biến JAK2-V617F Tiếp tục tiến hành tối ưu phương pháp với mẫu ARN 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Vũ Bảo Anh Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, huyết học bước đầu nhận xét đột biến gen Janus Kinase (JAK2-V617F) số thể bệnh tăng sinh tủy mạn tính Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 2010; 19(3): 433-40 Tạ Thành Văn PCR số kỹ thuật Y sinh học phân tử Nhà xuất Y học 2010 Phạm Hùng Vân PCR Real time PCR - Các vấn đề áp dụng thường gặp Nhà xuất Y học 2009 Nguyễn Đức Phúc Ứng dụng Realtime - PCR khảo sát đột biến JAK2V617F để chẩn đoán bệnh đa hồng cầu nguyên phát Cần Thơ 2018 Nguyễn Thy Ngọc, Bùi Bích Hậu Trần Tuấn Anh Đánh giá số phương pháp xác định đột biến JAK2-V617F phục vụ việc dự đoán nguy mắc bệnh đa hồng cầu số bệnh tăng sinh tủy ác tính khác Tạp chí Công nghệ Sinh học 2018; 19(3): (433-40) Phạm Quang Vinh.Bất thường di truyền tế bào bệnh máu ác tính Nhà xuất Y học 2013 Trường đại học Y Hà Nội Bộ môn Bệnh học phân tử Tài liệu thực tập Y sinh học phân tử 2017 Tài liệu Tiếng Anh E J Baxter, L M Scott, P J Campbell, et al Acquired mutation of the tyrosine kinase JAK2 in human myeloproliferative disorders Lancet 2005; 365(9464): 1054-61 R L Levine, M Wadleigh, J Cools, et al Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis Cancer Cel 2005; 7(4): 387-97 10 K Gabler, I Behrmann and C Haan JAK2 mutants (e.g., JAK2V617F) and their importance as drug targets in myeloproliferative neoplasms JAKSTAT 2013; 2(3): e25025 11 F Passamonti, F Cervantes, A M Vannucchi, et al A dynamic prognostic model to predict survival in primary myelofibrosis: a study by the IWG-MRT (International Working Group for Myeloproliferative Neoplasms Research and Treatment) Blood 2010; 115(9): 1703-8 12 R M Shallis, R Wang, A Davidoff, et al Epidemiology of the classical myeloproliferative neoplasms: The four corners of an expansive and complex map Blood Rev 2020; 42(100706) 13 A Tefferi, P Guglielmelli, D R Larson, et al Long-term survival and blast transformation in molecularly annotated essential thrombocythemia, 31 polycythemia vera, and myelofibrosis Blood 2014; 124(16): 2507-13 14 J M O'Sullivan and C N Harrison JAK-STAT signaling in the therapeutic landscape of myeloproliferative neoplasms Mol Cell Endocrinol 2017; 451(71-9) 15 B Woods, W Chen, S Chiu, et al Activation of JAK/STAT Signaling in Megakaryocytes Sustains Myeloproliferation In Vivo Clin Cancer Res 2019; 25(19): 5901-12 16 W Ma, H Kantarjian, X Zhang, et al JAK2 exon 14 deletion in patients with chronic myeloproliferative neoplasms PLoS One 2010; 5(8) 17 C Nielsen, S E Bojesen, B G Nordestgaard, et al JAK2-V617F somatic mutation in the general population: myeloproliferative neoplasm development and progression rate Haematologica 2014; 99(9): 1448-55 18 D A Arber, A Orazi, R Hasserjian, et al The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia Blood 2016; 127(20): 2391-405 19 T Barbui, J Thiele, H Gisslinger, et al The 2016 WHO classification and diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms: document summary and in-depth discussion Blood Cancer J 2018; 8(2): 15 20 L C Macedo, F de Cesare Quintero, E Silva S Pagliari, et al Association of TNF polymorphisms with JAK2 (V617F) myeloproliferative neoplasms in Brazilian patients Blood Cells Mol Di 2016; 57(54-7) 21 J Malysz and D Crisan Correlation of JAK2-V617F mutant allele quantitation with clinical presentation and type of chronic myeloproliferative neoplasm Ann Clin Lab Sci 2009; 39(4): 345-50 22 T S Larsen, N Pallisgaard, M B Moller, et al The JAK2 V617F allele burden in essential thrombocythemia, polycythemia vera and primary myelofibrosis impact on disease phenotype Eur J Haematol 2007; 79(6): 508-15 23 D P Steensma JAK2-V617F in myeloid disorders: molecular diagnostic techniques and their clinical utility: a paper from the 2005 William Beaumont Hospital Symposium on Molecular Pathology J Mol Diagn 2006; 8(4): 397-411 24 M Cankovic, L Whiteley, R C Hawley, et al Clinical performance of JAK2-V617F mutation detection assays in a molecular diagnostics laboratory: evaluation of screening and quantitation methods Am J Clin Pathol 2009; 132(5): 713-21 25 K Ohyashiki, K Hori, T Makino, et al Automated JAK2-V617F quantification using a magnetic filtration system and sequence-specific primer-single molecule fluorescence detection Cancer Genet Cytogenet 2007; 179(1): 19-24 26 C J Huijsmans, J Poodt, P H Savelkoul, et al Sensitive detection and quantification of the JAK2-V617F allele by real-time PCR blocking wild-type 32 amplification by using a peptide nucleic acid oligonucleotide J Mol Diagn 2011; 13(5): 558-64 27 T Senamela, M Kock, P Becker, et al Detection of the Janus kinase V617F mutation using a locked nucleic-acid, real-time polymerase chain reaction assay Afr J Lab Med 2018; 7(1): 658 28 W Vainchenker and R Kralovics Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms Blood 2017; 129(6): 667-79 33 PHỤ LỤC DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU Stt Mã bênh nhân Họ Tên 5200014833 Trần Văn H 5200014835 Dương Xuân Q 5210000014 5210000042 5210000099 5210000121 Trần Thị Q Bùi Thị T Hà Thị C Đinh Đăng Đ 5210000123 Nguyễn Thị B 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 5210000220 5210000286 5210000343 5210000402 5210000450 5210000508 5210000697 5210000817 5210000837 5210000864 5210000869 5210000934 5210000944 5210000945 5210000983 5210000988 5210001000 5210001005 5210001197 5210001233 5210001250 5210001265 5210001285 Nguyễn Thị Đ Lê Thị L Tạ Thị N Trần Thị Mai P Chu Thị T Lý Thị D Lưu Thị P Đỗ Thị H Giáp Thị Vân K Nguyễn Hữu K Nguyễn Đăng H Nguyễn Văn T Nguyễn Văn M Lê Hữu C Mai Thị M Nguyễn Thị H Đồn Văn P Hà Việt D Vũ Đình V Hồng Sơn H Nguyễn Thanh T Trần Đình T Nguyễn Thị N 34 Chẩn đoán Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC ĐHC ĐHC TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP Giới Năm sinh M 1965 M 1965 F F F M 1970 1980 1959 1937 F 1970 F F F F F F F F F M M M F M F F M M M M M M F 1968 1947 1959 1949 1979 1940 1973 1980 1974 1935 1954 1964 1972 1955 1949 1971 1958 1988 1958 1994 1983 1950 1954 Họ Tên Chẩn đoán Giới 31 32 33 Mã bênh nhân 5210001328 5210001364 5210001365 Mai Thị M Lê Duy T Cung Minh D F M M 34 5210001411 Nguyễn Thị P F 1973 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 5210001554 5210001781 5210001790 5210001798 5210001802 5210001868 5210001918 5210002044 5210002090 5210002109 5210002137 5210002150 5210002247 5210002265 5210002511 5210002583 5210002617 5210002624 5210002731 5210002784 5210002846 5210002861 5210002889 5210002895 5210003021 5210003040 5210003073 5210003082 5210003084 5210003496 5210003528 5210003543 5210003545 Nguyễn Văn L Hồ Văn Q Bùi Thị V Dương Nguyễn T Phạm Hồng H Nguyễn Thị Chưng Đồn Văn B Dương Đình Tuấn Nguyễn Thị M Nguyễn Đức T Đỗ Thị L Hoàng Thị K Đỗ Thị V Đinh Thị X Hoàng Thị H Nguyễn Thanh T Nguyễn Tuấn A Quàng Văn C Dương Minh H Trần Thị N Nguyễn Thu H Đoàn Ngọc L Đặng Văn Bốn Phạm Văn C Hoàng Thị O Đỗ Thành N PhạmThị T Đoàn Thị C Cù Thị G Tạ Quang Bình Trịnh Đức C Phạm Thị T Hoàng Văn Bộ TTCNP ĐHC TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP ĐHC TTCNP ĐHC ĐHC TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC ĐHC TTCNP TTCNP Năm sinh 1979 1957 1958 M M F M M F M M F M F F F F F F M M M F F M M M F M F F F M M F M 1960 1948 1932 1966 1971 1948 1968 1950 1984 1944 1955 1958 1961 1976 1948 1958 1958 1977 1960 1958 1975 1937 1964 1948 1957 1983 1950 1971 1976 1954 1992 1941 1971 Stt 35 Stt 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 Mã bênh nhân 5210003556 5210003771 5210003786 5210003821 5210003827 5210003853 5210003857 5210003868 5210003869 5210004119 5210004129 5210004135 5210004202 5210004321 5210004322 5210004422 5210004487 5210004493 5210004593 5210004824 5210004837 5210004841 5210004922 5210005064 5210005073 5210005083 5210005126 5210005163 5210005215 5210005277 5210005292 5210005298 5210005808 5210006561 5210006589 5210006822 5210006837 5210006926 5210007190 Họ Tên Chẩn đoán Giới Phạm Anh Tuấn Đoàn Văn T Nguyễn Thị H Hoàng Thị T Trần Thị Thu H Trần Thị H Nguyễn Thị P Vũ Văn N Vũ Thị Đ Vũ Thị N Nguyễn Thị T Phan Văn T Phạm Quang H Đỗ Tiến B Nguyễn Văn N Nguyễn Thị T Vũ Thị T Cao Văn K Đặng Hồng Đ Dương Thị L Nguyễn Đức M Hoàng Thị H Vũ Thị L Nguyễn Thị C Hồng Anh T Trần Thị T Lương Văn T Ngơ Thị V Nguyễn Thị D Nguyễn Văn C Phan Đăng Đức Nguyễn Xuân T Phạm Công Đ Trương Ngọc T Trần Thị V Đỗ Thị N Nguyễn Văn H Vũ Hải S Nguyễn Đắc Đ ĐHC TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC ĐHC ĐHC TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP HCXT TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP HCXT TTCNP ĐHC TTCNP M M F F F F F M F F F M M M M F F M M F M F F F M F M F F M M M M M F F M M M 36 Năm sinh 1973 1983 1952 1953 1976 1973 1942 1957 1951 1941 1959 1956 1994 1959 2002 1953 1955 1937 1961 1983 1986 1976 1955 1953 1977 1970 1961 1949 1957 1957 1973 1972 1938 1973 1963 1939 1982 1980 1998 Mã bênh nhân 107 5210007426 108 5210007895 109 5210009784 Họ Tên Chẩn đoán Giới Nguyễn Thị L Nguyễn Thị X Nguyễn Đức Q F F M 110 5210010124 Hoàng Thị H F 1955 111 5210010712 112 5210010779 Trần Thị H Hoàng Văn Q F M 1969 1974 113 5210011750 Nguyễn Bích P F 1998 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 5210013674 5210013977 5210014833 5210016308 5210016776 5210018113 5210018919 5210019264 5210019517 5210020025 5210020894 Nguyễn Ngọc H Vương Thị T Nguyễn Văn C Phạm Kỳ S Phạm Thế Q Trịnh Thị B Lê Văn N Đào Trọng B Nguyễn Thị K Nguyễn Thị L Nguyễn Hữu T M F M M M F M M F F M 1977 1965 1950 1951 1965 1970 1987 1952 1969 1950 1964 125 5210020941 Nguyễn Văn K M 1958 126 127 128 129 130 131 Nguyễn Thị R Hoàng Văn D Lù Thị S Nguyễn Đông H Phạm Thị H Lê Minh Thư TTCNP TTCNP ĐHC Bệnh tst chưa phân loại TTCNP TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại ĐHC HCXT TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP ĐHC ĐHC Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại TTCNP TTCNP TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại Năm sinh 1972 1961 1980 F M F M F F 1958 1961 1993 1983 1955 1952 F 1963 M M M 1980 1954 1946 M 1944 Stt 5210021210 5210023841 5210024812 5210024842 5210026428 5210027204 132 5210027499 Nguyễn Thị S 133 5210029854 134 5210030167 135 5210030678 Nguyễn Xuân N Nguyễn Văn Q Phạm Văn T 136 5210035377 Hoàng Văn T 37 Stt 137 138 139 140 141 142 143 144 Mã bênh nhân 5210044405 5210045353 5210046124 5210051867 5210055230 5210055928 5210059084 5210061534 145 5210061676 146 147 148 149 150 151 5210062082 5210062258 5210063332 5210063833 5210063984 5210065144 152 5210065150 153 154 155 156 157 158 5210065179 5210065264 5210065295 5210089031 5210065835 5210065888 159 5210065998 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 5210066014 5210067647 5210068416 5210068424 5210069188 5210070699 5210071363 5210071374 5210072265 5210072211 Họ Tên Chẩn đốn Giới Nguyễn Thị T Nguyễn Đình D Nguyễn Thị P Vũ Thị T Lại Ngọc C Bùi Tiến M Nguyễn Văn H Nguyễn Thị C TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại ĐHC ĐHC TTCNP TTCNP HCXT TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP F M F F M M M F Năm sinh 1963 1962 1952 1934 1942 1963 1987 1948 F 1966 F F F F M M 1985 1975 1979 1959 1963 1967 M 1962 F F M F F F 1968 1967 2018 1956 1956 1958 M 1954 M M M F F M F F M M 1965 1975 1949 1952 1957 1946 1984 1969 1940 1935 Trịnh Thị P Đặng Thị Quỳnh G Lê Thị Thu H Vũ Thị M Nguyễn Thị T Trần Văn L Trần Minh S Đào Công Đ Nguyễn Thị P Lê Thị M Nguyễn Xuân P Nguyễn Thị L Lê Thị S Phùng Thị T Bùi Đình P Nguyễn Văn N Nguyễn Khắc V Hà Khả L Nguyễn Thị T Phùng Thị Q Nguyễn Văn S Trần Thị H Vũ Thị T Ngô Duy N Nguyễn Văn C 38 Stt 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 Mã bênh nhân 5210072268 5210072307 5210073869 5210074354 5210074713 5210074966 5210075018 5210075109 5210075274 5210076011 5210076068 5210076182 5210076944 5210078024 5210078920 5210079028 5210079029 5210079177 5210080235 5210081247 5210082332 5210082581 5210083124 193 5210085810 194 195 196 197 198 199 200 5210087633 5210087784 5210088545 5210088770 5210088883 5210088955 5210088962 Họ Tên Chẩn đoán Giới Nguyễn Văn N Nguyễn Viết Bình Trần Văn D Dương Minh T Nguyễn Quang D Nguyễn Thị N Vũ Thị L Nguyễn Thị Doan Nguyễn Thị H Trần Văn Q Lê Doãn H Trần Thị V Nguyễn Thị M Phạm Văn D Trần Thị T Nguyễn Thị M Trần Thị P Chu Thị A Nguyễn Thị T Vũ Thị H Nguyễn Xuân B Nguyễn Thị M Dương Công T TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC ĐHC TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP TTCNP ĐHC TTCNP Bệnh tăng sinh tủy, chưa phân loại TTCNP ĐHC HCXT ĐHC TTCNP ĐHC HCXT M M M M M F F F F F M F F M F F F F F F M F M Năm sinh 1984 1955 1966 1985 1961 1951 1968 1977 1948 1981 1986 1953 1952 1985 1965 1946 1980 1950 1981 1976 1958 1954 1944 M 1970 F M M M M M M 1970 1999 1968 1976 1962 1991 1954 Trần Đức L Nguyễn Thị K Nguyễn Kiên C Nguyễn Văn H Nguyễn Xuân C Trần Văn M Nguyễn Văn B Trần Văn T 39