KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN BT VÀO CÂY BÔNG BẰNG VI TIÊM VÀO BẦU NOÃN THEO ĐƯỜNG ỐNG PHẤN Chủ nhiệm đề tài: KS. Trịnh Minh Hợp Cán bộ thực hiện: KS. Nguyễn Thị Nhã, KS. Nguyễn Thị Dung, KS. Thái Thị Lệ Hằng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Trên thế giới, bông là cây trồng kinh tế và lấy sợi tự nhiên quan trọng, được trồng ở hơn 70 quốc gia và đóng góp 20-30 tỷ USD/năm giá trị bông xơ (Bao-Hong Zhang và cs, 2001). Tuy nhiên, cây bông bị nhiều loại sâu gây hại, hàng năm, mức tổn thất do sâu gây ra chiếm 20-40% tổng sản lượng bông (Ahmad K.D., 1991) và tiêu tốn lượng thuốc sâu chiếm 24% tổng lượng thuốc trừ sâu sử dụng trong nông nghiệp (Colliot và Roux de Bretagne, 1993). Hiện nay, để khắc phục các thiệt hại do sâu gây ra các nước trồng bông trên thế giới đã tạo ra giống bông bông Bt kháng sâu. Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống, tuy nhiên, diện tích và sản lượng của ta rất thấp, chỉ đáp ứng 10-15% nhu cầu may mặc trong nước (Nguyễn Hữu Bình, 2002). Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích và tăng sản lượng của nước ta, nhưng quan trọng nhất vẫn là sâu hại (Nguyễn Hữu Bình, 1990; Nguyễn Thị Hai, 1996). Theo chương trình phát triển của Ngành Dệt-May, đến năm 2010, Việt Nam phải sản xuất được 300.000 tấn bông xơ. Để thực hiện được chỉ tiêu này, bên cạnh việc áp dụng các chính sách khuyến nông, biện pháp kỹ thuật canh tác mới, thì việc nghiên cứu tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết. Bông biến đổi gen được trồng thương mại trên thế giới vào năm 1996, với diện tích khoảng 0,8 triệu ha (Clive James, 1997). Từ đó đến nay, diện tích trồng bông biến đổi gen liên tục tăng nhanh, đến năm 2005, diện tích trồng bông biến đổi gen toàn cầu khoảng 10 triệu ha chiếm trên 30% trong tổng diện tích bông (Clive James, 2005). Các loại bông biến đổi gen đang được phổ biến là bông kháng sâu, chịu thuốc trừ cỏ và bông vừa kháng sâu, vừa chịu thuốc trừ cỏ. Các nước Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc đang trồng bông biến đổi gen nhiều nhất (Clive James, 2007). Trồng bông chuyển gen đem lại nhiều lợi ích như tăng năng suất, giảm chi phí bảo vệ thực vật và nguy cơ ô nhiễm môi trường Để tạo bông chuyển gen, chủ yếu sử dụng hai hệ thống chuyển gen là phương pháp chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium và trực tiếp bằng bắn gen (Hemphill J.K. và cs, 1998). Tuy nhiên, nhược điểm của cả hai phương pháp là phải thông qua hệ thống tái sinh cây bông bằng nuôi cấy mô tốn nhiều thời gian, tỷ lệ tái sinh thấp và bị giới hạn chỉ ở giống bông Coker, vốn không có các đặc tính nông sinh học tốt (Trolinder N.L. và cs, 1989; Fioozabady E. và cs, 1993; Koonce L. và cs, 1996). Chuyển gen trực tiếp vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy hoa theo đường ống phấn là phương pháp chuyển gen mới phát triển gần đây, có ưu điểm là dễ thực hiện, tỷ lệ chuyển gen khá cao, khắc phục được khó khăn về tái sinh cây bông và có 1 thể chuyển gen vào bất kỳ giống bông nào (Hemphill J.K. và cs, 1998). Mặc dù còn nhiều bàn cãi về cơ chế chuyển gen, nhưng hiện nay, phương pháp đang được sử dụng rộng rãi và rất có hiệu quả ở Trung Quốc và một số nước trên thế giới để chuyển gen vào các cây trồng như lúa nước, lúa mỳ, đậu tương và đặc biệt là cây bông (Li Fuguang và Cui Jinje, 2001). Xuất phát từ cơ sở trên, trong năm 2007 chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển gen Bt vào cây bông bằng vi tiêm trực tiếp vào bầu noãn theo đường ống phấn”. 1.2. Mục tiêu của đề tài 1- Xác định các giống bông thích hợp cho vi tiêm; 2- Xây dựng quy trình chuyển gen Bt cho cây bông bằng phương pháp vi tiêm vào bầu noãn thông qua đường ống phấn; 3- Tạo ra các dòng bông mang gen chuyển Bt phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất bông hàng hóa trong nước. 1.3. Nội dung nghiên cứu 1.3.1. Nội dung nghiên cứu tổng quát của đề tài 1- Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid để cung cấp cho vi tiêm; 2- Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa bông phục vụ cho vi tiêm; 3- Vi tiêm để tạo hạt bông mang gen chuyển Bt; 4- Sàng lọc cây mang gen chuyển sau vi tiêm; 5- Đánh giá các dòng bông mang gen ở mức phân tử. 1.3.2. Nội dung nghiên cứu cụ thể trong năm 2007 1- Tách chiết và tinh sạch ADN plasmid để cung cấp cho vi tiêm; 2- Nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa cho 3 giống C118, LRA5166 và TM1 phục vụ cho vi tiêm; 3- Vi tiêm cho 3 giống C118, LRA5166 và TM1 để tạo hạt bông mang gen chuyển Bt; 4- Sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kháng sinh kanamycin. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 2.1.1. Tình hình sản xuất cây bông biến đổi gen Bông chuyển gen được nghiên cứu thử nghiệm vào năm 1987, thành công đầu tiên thuộc về công ty Miorogene của mỹ. Công ty này đã được công nhận bằng sáng chế về gen Bt kháng sâu. Sau đó, công ty Monsanto của Mỹ mua lại bản quyền sử dụng gen Bt. Từ đó, Monsanto tổng hợp và chuyển vào cây bông năm 1988; tạo được giống bông chuyển gen Deltapine năm 1990, thí nghiệm và trồng thử nghiệm trên đồng ruộng năm 1992; bắt đầu đưa đi trồng diện rộng trong sản xuất năm 1993-1994; và chính thức được công nhận vào năm 1995. Cây bông biến đổi gen được trồng đầu tiên trên thế giới vào 2 năm 1996, chủ yếu ở Mỹ, với diện tích khoảng 0,8 triệu ha (Clive James, 1997). Từ đó đến nay, diện tích trồng bông biến đổi gen liên tục tăng nhanh. Đến năm 2005, diện tích trồng bông biến đổi gen toàn cầu khoảng 10 triệu ha chiếm trên 30% trong tổng diện tích 32 triệu ha trồng bông toàn thế giới (Clive James, 2005). Các loại bông biến đổi gen đang được phổ biến là bông kháng sâu, chịu thuốc trừ cỏ và bông vừa kháng sâu, vừa chịu thuốc trừ cỏ. Các nước Mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc đang trồng bông biến đổi gen nhiều nhất thế giới (Clive James, 2007). Mỹ là nước đầu tiên trên thế giới cho phép trồng thử nghiệm cây chuyển gen vào năm 1995. Cây bông bông Bt được cho phép trồng thương mại ở Mỹ vào năm 1996 với diện tích ban đầu 0,73 triệu ha, chiếm 14% diện tích. Đến năm 2001, diện tích trồng bông Bt của Mỹ lên tới 2,08 triệu ha chiếm 34% diện tích trồng bông toàn đất nước (Edge và cs, 2001). Ở Trung Quốc, cây bông chuyển gen bắt đầu được trồng thương mại vào năm 1997 với diện tích rất ít (<0,1 triệu ha), chiếm khoảng dưới 1% diện tích. Tuy nhiên, sau đó diện tích trồng bông Bt kháng sâu của Trung Quốc tăng lên rất nhanh và đến năm 2004 diện tích này đã là 3,7 triệu ha chiếm 66% trong tổng diện tích trồng bông 5,6 triệu ha (Clive James, 2004) và đến nay diện tích trồng bông Bt là 3,8 triệu ha (Clive James, 2007). Ấn Độ trồng bông Bt sau Trung Quốc 6 năm, nhưng đến năm 2007, diện tích trồng tăng lên 6,2 triệu ha, vượt Trung Quốc 2,4 triệu ha (Clive James, 2007). Tại Úc, cây bông biến đổi gen cũng được cho phép trồng khá sớm. Đến năm 2004, có tới 80 % diện tích trồng của Úc, tương đương 250.000 ha là bông biến đổi gen (Clive James, 2004) và năm 2007 đã tăng lên 100.000 ha (Clive James, 2007). 2.1.2. Ý nghĩa của trồng cây bông Bt Có thể nói việc tạo ra giống bông Bt là thành tựu khoa học có ý nghĩa rất lớn cho sản xuất bông của thể giới, góp phần rất lớn trong việc tăng năng suất và sản lượng bông, giảm chi phí (chủ yếu là chi phí bảo vệ thực vật), hạ giá thành sản phẩm, tăng hiệu quả kinh tế, giảm nguy cơ ô nhiễm môi trường và tăng sức khỏe con người. Chẳng hạn như việc trồng bông Bt đã làm tăng năng suất bông hạt 10- 38% so với trồng bông thường, trong đó, Ấn Độ, Achentina, Indonesia và Nam Phi có năng suất bông Bt tăng rất cao (24-38%). Việc sử dụng bông Bt cũng góp phần giảm chi phí bảo vệ thực vật, như đã giảm được số lần phun thuốc 3-14 lần, trong đó Trung Quốc (14 lần), Indonesia (8 lần), Nam Phi, Úc và Ấn Độ (7 lần) có số lần phun thuốc giảm khá nhiều. Do sự giảm về số lần phun thuốc, nên cũng đã giảm được số lượng thuốc trừ sâu sử dụng trung bình 13% tổng số lượng thuốc trừ sâu sử dụng cho bông. Ở một số nước đã có sự giảm rất lớn về lượng thuốc trừ sâu sử dụng như Trung Quốc (61%), Mỹ (31%) và Úc (27%) (Clive James, 2002). Bông Bt liên tục mang lại lợi nhuận cho người nông dân Ấn Độ, so với các giống bông thường thì bông Bt làm tăng 50% sản lượng cũng như giúp giảm một nửa số thuốc trừ sâu cần sử dụng, đem lại tác động tích cực về môi trường và sức khỏe cho người trồng bông. Tính trên góc độ quốc gia, ước tính thu nhập của nông dân trồng bông 3 Bt tăng từ 840 triệu đô la Mỹ (năm 2006) lên đến 1,7 tỷ đô la (năm 2007), và Ấn Độ từ một nước có sản lượng bông thấp nhất thế giới, từ một nước nhập khẩu bông giờ đã trở thành 1 nước xuất khẩu bông (Clive James, 2007). Tại Mỹ, trồng giống bông Bt cho năng suất bông xơ cao hơn giống bông không Bt 14,7-20,5% (Benedict và Altman, 2001) và đem lại lợi nhuận do việc tăng năng suất và giảm chi phí bảo vệ thực vật tính riêng trong năm 2001 là 2,08 tỷ USD (Carpenter và Gianessi, 2001; Gianessi và cs, 2002). Tại Trung Quốc, nhờ có sử dụng bông Bt mà đã giảm được 1/2- 2/3 lượng thuốc trừ sâu sử dụng so với trồng bông thường trong các năm 1999-2001 và tổng lợi nhuận thu được do trồng bông Bt kháng sâu trong 3 năm (1999-2001) gần 1,5 tỉ USD (Pray và cs, 2002). Năm 2007, bông Bt được 7,1 triệu người Trung Quốc trồng trên diện tích 3,8 triệu ha (tăng so với 3,5 triệu ha năm 2006), đây là chỉ số quan trọng phản ánh niềm tin của nông dân vào công nghệ mới (Clive James, 2007). 2.1.3. Các loại bông Bt kháng sâu Hiện nay, trên thế giới đang tồn tại các loại bông Bt kháng sâu: Bollgard  , bông Bt Trung Quốc ( Chinese Bt Fusion Gene Cotton), Bollgard  II và một số giống bông kháng sâu khác. Bollgard  là các giống bông Bt do công ty Monsanto của Mỹ tạo ra đầu tiên và thương mại hoá vào năm 1995-1996, nó chỉ chứa một gen CryIAc, hiện nay nó đang được trồng rộng rãi ở 9 nước trồng bông lớn trên thế giới với diện tích khoảng 10 triệu ha. Khả năng kháng các loại sâu bông của giống bông cho thấy, có khả năng kháng ở mức cao với sâu hồng, sâu xanh, kháng yếu với sâu xanh da láng (20%) và kháng khá cao với các loại sâu còn lại (70-85%). Giống bông Bt hỗn hợp là các giống bông do Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc (CAAS) tạo ra đầu tiên, nó chứa 2 gen CryIAb và CryIAc được trồng chủ yếu ở Trung Quốc. Ngoài ra thuộc nhóm bông Bt kháng sâu này của Trung Quốc còn có loại bông Bt kháng sâu chứa 2 gen là Bt và CpTi. Giống bông Bollgard  II là thế hệ bông Bt thứ 2 của Monsanto, nó chứa đồng thời 2 gen CryIAc và CryIIAb, nó là loại bông Bt có phổ diệt sâu rộng hơn và khả năng diệt sâu cao hơn thế hệ bông Bollgard  . Số liệu cho thấy, tỷ lệ diệt sâu của bông Bollgard  II (92,2-100%) cao hơn hẳn bông Bollgard  (1,2-84,4%). Ngoài ra, theo các kết quả nghiên cứu khác, thì với bông Bollgard  II, sâu hại bông sẽ ít phát sinh tính kháng hơn so với bông Bollgard  vì nó có chứa nhiều loại độc tố hơn. Bông Bollgard  II được cho phép trồng lần đầu tiên tại Úc năm 2003 với diện tích 5.000 ha, sau đó nó được cho phép trồng tại Mỹ và nhiều nước trồng bông lớn khác trên thế giới. Ngoài các giống bông nêu trên, năm 2002, công ty Dow AgroScience cũng đã đưa ra giống bông Bt có phổ diệt sâu rộng chứa 2 gen CryIA(c) và CryIF. Gần đây nhất công ty Sygenta đã đưa ra sản xuất lần đầu tiên tại Mỹ, năm 2004 giống bông VIP (VIP Cotton) có chứa gen kháng sâu Vip 4 (Vegetative Insecticidal Protein), đây là loại bông có phổ diệt sâu rất rộng và có tỷ lệ diệt sâu rất cao và sâu rất khó phát sinh tính kháng. 2.1.4. Nghiên cứu chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm Chuyển gen bằng con đường ống phấn là phương pháp chuyển gen trực tiếp vào các tế bào mầm. Nó là sự kết hợp giữa kỹ thuật di truyền hiện đại với kỹ thuật chọn giống thông thường để cải tiến cây trồng bằng việc tạo ra các biến dị và chọn lọc các đặc tính nông học quý. Đây là tiến bộ khoa học lớn mà Trung Quốc đạt được trong những năm gần đây và bằng phương pháp này một số lượng lớn các dòng/giống bông biến đổi gen đã được tạo ra và hiện nay đang được sử dụng rộng rãi trong sản xuất bông. Các nhà khoa học ở Viện Nghiên cứu Cây trồng kinh tế (ICC), Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Jiangsu (JAAS) đã hợp tác chặt chẽ với các cơ quan khác, tạo giống bông khởi đầu bằng vi tiêm ADN tổng số vào các cây bông nhận. Các kết quả đã chỉ ra rằng sự chuyển ADN tổng số giữa các giống và các loài đã thành công dựa theo đường ống phấn, trong đó phần lớn các con cháu đã biểu hiện biến dị. Sau 3-4 thế hệ chọn lọc một loạt các dòng ổn định di truyền đã được chọn lọc (Zhang, 1992). Năm 1992, nhóm của Gou ở Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học (BRI), Viện Hàn lâm Khoa học Nông nghiệp Trung Quốc (CAAS) đã thiết kế và tổng hợp nhân tạo gen Bt GFM CryIA dựa theo mã sử dụng phù hợp cho cây trồng (Gou và cs, 1995). Từ năm 1993, Ni và cs ở ICC và JAAS đã chuyển các gen mã hóa cho Bt, Bt + CpTI, Chitinase, β-glucanase, glucose oxidase, anti-fungal protein (APF) bằng con đường ống phấn vào các giống bông Trung Quốc như Zhongmiansuo 12 & 19, Zhongzhi 372, Simian 3, Sumian 8 & 12, Siyang 167 & 168, Shiyuan 321, Xinluzao 4, 7 & 8, Liaomian 15, 3517, 541, 916, C6524, Q010, Suyin A, B & C và giống bông ít gossypol W8. Kết quả đã thu được một loạt các dòng/giống bông chuyển gen kháng cao với cả sâu đục quả và các bệnh nấm (Ni và cs, 1996, Gou và cs, 1999). Các phân tích về phân tử, sinh học và di truyền cây chuyển gen đã xác nhận sự gắn vào genom và biểu hiện của gen mục tiêu. Điều này chỉ ra rằng, chuyển gen thông qua đường ống phấn là một hệ thống chuyển gen hiệu quả. 2.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Trong lĩnh vực chuyển gen vào cây trồng, Việt Nam lạc hậu so với thế giới hàng chục năm. Vào những năm đầu thập kỷ 90 của thế kỷ XX, khi những cây chuyển gen đầu tiên đang được thương mại trên thế giới, lúc đó ở Việt Nam, mới bắt đầu nghiên cứu tiếp cận kỹ thuật này. Một số công trình nghiên cứu chuyển gen chọn lọc (kháng kanamycin, hygromycin và gen Bar) và gen chỉ thị (gen GUS) vào một số cây trồng (lúa, cải bắp và thuốc lá) được tiến hành ở một số phòng thí nghiệm của các Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Sinh học Nhiệt đới và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng sông Cửu Long (Lê Huy Hàm, 2003). Những nghiên cứu này nhằm mục 5 đích hoàn thiện các quy trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng, làm cơ sở cho các bước nghiên cứu kế tiếp. Những năm gần đây, một số gen kháng sâu bệnh và chất diệt cỏ như các gen CryIAb, CryIAc, CryIC kháng sâu; gen GNA kháng rầy; gen chitinase và gen glucanase kháng nấm; gen Xa21 kháng bệnh bạc lá; và gen bar chịu thuốc diệt cỏ được chuyển vào một số cây trồng quan trọng như lúa, khoai, cà chua, cải bắp, cải dầu, thuốc lá, đu đủ Kết quả, chúng ta đã thu được những cây chuyển gen và lưu giữ chúng trong điều kiện in- vitro và nhà kính. Tuy nhiên, tất cả những cây trồng chuyển gen được tạo ra ở Việt Nam mới chỉ tồn tại ở quy mô thí nghiệm (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2002). Trong Chương trình Công nghệ Sinh học KHCN-02 giai đoạn 1996- 2000 có một đề tài đăng ký thực hiện công nghệ chuyển gen ở cây trồng, trong đó gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vi khuẩn ở lúa và nhóm gen Cry kháng sâu được chuyển vào cây lúa (Lê Thị Muội và cs 2000). Trước đó cũng đã có những nghiên cứu phân lập gen chịu lạnh ở cây lúa (Lê Trần Bình và Lê Thị Muội, 1998). Trong chương trình Nghiên cứu Khoa học và Phát triển Công nghệ Sinh học KC-04 giai đoạn 2001-2005 có đề tài “Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi”. Thông qua đề tài, các gen kháng bệnh đạo ôn lúa (gen Pi-1/Pi-2t), gen kháng sâu (gen Cry và VIP), gen giữ hoa lâu tàn (gen ACO antisense), gen kháng nấm (gen Chitinase và OXDC), gen kháng bệnh bạc lá vi khuẩn (gen Xa21), gen kháng thuốc trừ cỏ (gen Bar), gen tăng tính chịu hạn, mặn (gen P5CS), gen kháng rầy (gen GNA), gen tăng protein dự trữ (gen AmA1) và gen chín sớm (gen FPF1) được thu thập, phân lập và thiết kế gen để chuyển cho một số loại cây hoa (cúc, cẩm chướng, hồng và lan), cây lâm nghiệp (hông, tếch, bạch đàn lai và keo lai), cây lương thực và thực phẩm (lúa, ngô và đậu tương) và cây bông. Đối với cây bông, sẽ chuyển các các gen Cry kháng sâu, gen Bar kháng thuốc trừ cỏ và gen P5CS tăng tính chịu hạn vào cây bông để tạo các giống bông kháng sâu, chống chịu thuốc trừ cỏ và chịu hạn (Lê Trần Bình, 2001). Tuy nhiên, các kết quả đạt được mới dừng lại ở thử nghiệm trong phòng thí nghiệm và nhà kính. 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu nghiên cứu 3.1.1. Giống bông Ba giống bông được nghiên cứu chuyển gen là C118, LRA5166 và TM1. 3.1.2. Gen kháng sâu Hai gen kháng sâu được sử dụng để chuyển là VIP3 (được thiết kế trong vectơ PBI121) và CryIAc (pIBT(C;P)). Các gen này đều do Viện Công nghệ Sinh Học Hà Nội thiết kế và cung cấp. 6 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Tách chiết và tinh sạch plasmid * Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn - Nuôi 1-5ml dịch khuẩn (lấy 1 khuẩn lạc cho vào môi trường LB hoặc LBG) qua đêm hoặc 16 h hoặc 10-12 OD (nếu vượt quá sẽ nhiễm RNA, DNA của khuẩn). - Chuyển dịch khuẩn sang ống 2ml. Ly tâm 1 phút, thu lấy cặn. - Thêm 250µl dung dịch resuspension, vortex hoặc dùng pippet hút lên, xuống cho đến khi cặn tan hoàn toàn. - Thêm 250µl dung dịch lysis, đảo 6-8 lần cho đồng nhất (không được vortex hoặc shake để tránh nhiễm ADN của vi khuẩn), để 5 phút ở nhiệt độ phòng. - Thêm 350µl dịch neutralization, đảo 6-8 lần (không được vortex hoặc shake). - Ly tâm 5 phút cho lắng cặn màu trắng (dịch nổi-phần chứa ADN plasmid). * Tinh sạch ADN plasmid - Chuyển dịch nổi sang cột spin (chèn cột lênn ống loại 2ml-có cung cấp theo kit). - Ly tâm 1 phút để đẩy ADN plasmid gắn chặt vào màng cột tinh sạch. - Thêm 750µl dịch rửa 1X (thêm 4 vol cồn tuyệt đối vào dịch rửa có nồng độ 5X trước khi dùng) và ly tâm 1 phút. - Ly ly tâm 1 phút để loại bỏ hết dịch rửa, thay cột sang ống rửa mới. Ly ly tâm 1 phút loại bỏ hoàn toàn dịch rửa. * Thu thập mẫu tinh sạch - Chuyển cột tinh sạch sang ống eppendorft mới (loại 1,5-2,0ml). - Bổ sung 50µl dịch hòa tan ADN plasmid lên màng cột, cố định 1 phút để nó hàa tan và tách khỏi màng. Ly tâm 1 phút thu lấy dịch plasmid. - Loại bỏ cột, ADN plasmid tinh sạch có thể được dùng ngay hoặc được giữ ở 4 0 C (kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%). * Bảo quản ADN plasmid ADN plasmid sau khi được tách chiết và tinh sạch sẽ được pha loãng bằng nước khử ion thành dung dịch mẹ có nồng độ 100µg/ml và bảo quản ở tủ -20 0 C. 3.3.2. Nghiên cứu thời điểm nở hoa và kích thước bầu nhụy - Xác định thời gian nở rộ hoa trong ngày: khi cây bông bắt đầu nở hoa, tiến hành đếm số hoa nở ở 3 khoảng thời gian (1): trước 6h ; (2): 7-9h; và (3): sau 10h. - Xác định kích thước của bầu nhụy và chiều dài của trụ noãn: chọn các hoa nở bình thường ở vị trí thứ nhất và 2 trên các cành quả từ 1 đến 6, ở giai đoạn sau nở hoa 24 tiếng để đo đến các chỉ tiêu chiều dài, rộng của bầu. Cắt đôi bầu nhụy để xác định chiều dài của trụ noãn. 7 3.3.3. Chuẩn bị vi tiêm - Tự thụ phấn trước khi hoa nở: vào chiều ngày trước khi hoa nở (ngày thứ nhất), chọn các nụ ở vị trí thứ nhất và 2 trên cành quả từ thứ nhất đến thứ 7, có cánh hoa đã nhô dài ra, chấm sơn vào đầu nụ hoặc dùng dây buộc chặt đầu nụ để cho hoa tự thụ phấn. - Thời điểm vi tiêm: sáng ngày hôm sau (ngày thứ 2), các nụ chọn tự thụ sẽ nở hoa và thụ phấn (khoảng 6-9 h). Thời gian từ nở hoa, thụ phấn đến thụ tinh kép khoảng 24-28 tiếng, nên thời điển thuận lợi cho vi tiêm là sau khi nở hoa và thụ phấn 20-24 tiếng, tức từ 6 đến 9 h buổi sáng ngày thứ 3. - Chuẩn bị trước khi vi tiêm + Chuẩn bị vi kim tiêm: sử dụng vi kim tiêm loại dung tích 10µl. Trước khi vi tiêm cần lau chùi sạch sẽ bằng cồn tuyệt đối, sau đó ngâm vào nước cất khử trùng trước và sau khi sử dụng. + Chuẩn bị dung dịch ADN plasmid: trước khi vi tiêm, lấy dung dịch mẹ (nồng độ 100µg/ml) pha loãng bằng nước khử ion thành các dung dịch làm việc có nồng độ 10, 20 và 30µg/ml. Thể tích dịch mỗi lần vi tiêm là 10µl. + Lấy dung dịch vi tiêm: Dùng 3 ngón giữa, áp út và út của tay phải giữ chặt thân xi lanh, dùng ngón trỏ và cái điều khiển pít tông. Trước khi hút dung dịch, cần đảm bảo pít tông khít với đáy xi lanh. Rút pít tông chậm và đều cho đến khi thể tích dung dịch đã vào xi lanh đủ (10µl). Chú ý, không để có bọt khí trong dịch hút. 3.3.4. Tiến hành vi tiêm - Cắt bỏ cánh hoa hoặc đè bẹp chúng ra các bên. Cắt bỏ vòi nhụy đến sát với bầu hoa (chú ý tránh làm tổn thương các tế bào nhu mô của bầu nhụy khi cắt bỏ cánh hoa, các hoa chấm sơn bị bung ra phải bỏ đi). - Dùng 2 ngón áp út và út của tay trái kẹp lấy cuống hoa, dùng 3 ngón còn lại giữ bầu nhụy thẳng đứng vuông góc với mặt đất. Dùng 3 ngón cái, trỏ và giữa của tay phải giữ xi lanh. Ấn thẳng đứng mũi kim tiêm vào điểm giữa của vòi nhụy, đẩy từ từ đến 2/3 chiều dài bầu nhụy, sau đó kéo lùi lại 1/3 để tạo khoảng trống, dùng ngón cái bơm nhẹ nhàng dịch tiêm vào bầu và cuối cùng rút từ từ kim tiêm ra. - Sau khi rút kim ra, để giảm sự rụng quả, cần bôi lên vết tiêm dung dịch khử trùng và đầu cuối cuống hoa dung dịch gibberellin nồng độ 40ppm. - Đeo thẻ để đánh dấu quả vi tiêm. - Chăm sóc sau vi tiêm: chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh triệt để cho cây sinh trưởng phát triển tốt. Cần cắt ngọn của cành quả để tập trung dinh dưỡng nuôi quả và hạt bông quả vi tiêm. - Thu hoạch: các quả bông vi tiêm được thu hoạch và tách lấy hạt để phục vụ cho sàng lọc cây chuyển gen sau này. 8 3.3.5. Phương pháp sàng lọc cây chuyển gen bằng kanamycin Gieo hạt bông vi tiêm trong nhà lưới, pha kanamycin với nước cất ở nồng thích hợp (nồng độ giống bông mẫn cảm), phun ướt toàn bộ lá cây bông ở giai đoạn cây 15-20 ngày tuổi. Loại bỏ các cây dương tính, các cây âm tính còn lại được chăm sóc, tự thụ và thu riêng quả cho từng cây để cung cấp hạt cho nghiên cứu sàng lọc tiếp sau. 3.4. Chỉ tiêu theo dõi 1- Nồng độ, số lượng và chất lượng ADN plasmid tách chiết. 2- Thời điểm nở hoa, kích thước bầu nhụy và chiều dài trụ noãn. 3- Số hoa tiêm, quả đậu, quả dị dạng, số hạt. 4- Tỷ lệ cây và triệu trứng lá cây bông mẫn cảm với kanamycin. 5- Số lượng, tỷ lệ cây âm tính ở mỗi công thức. 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid cung cấp cho vi tiêm Chất lượng ADN plasmid tốt là thông số rất quan trọng trong chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm. Để tách chiết và tinh sạch được ADN plasmid có chất lượng cao, chúng tôi đã tiến hành nuôi vi khuẩn E.coli chủng DH5α mang 2 vectơ chuyển gen pBI121 và pIBT (C;P) (ảnh 1), sau đó, tách chiết và tinh sạch ADN plasmid theo kít (Arrunium mini kit) của Công ty Biorad. Kết quả thu được trong bảng 1 cho thấy, sau 6 đợt tách chiết, thu được tổng cộng 39ml dung dịch ADN plasmid, với nồng độ bình quân 953,7µg/ml. Kết kiểm tra OD cho thấy, ADN plasmid tách chiết được có chất lượng rất tốt, các thông số OD260/OD280 và OD260/OD230 đều nằm trong phạm vi cho phép (đều đạt và tương tự với nghiên cứu của Song và cs., 2006, độ sạch của ADN phải đạt OD260/OD280 > 1,8 và OD260/OD230 > 2). Kết quả điện di để kiểm tra cũng cho thấy, ADN plasmid có 3 vạch sắc nét, điều đó chứng tỏ ADN có chất lượng tốt, không lẫn tạp, đủ tiêu chuẩn cho vi tiêm. Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận thấy, nồng độ và chất lượng ADN 9 Ảnh 1. Các vector chuyển gen A B plasmid thu được giữa các đợt tách không chênh lệch đáng kể, chứng tỏ sử dụng kít của hãng Biorad để tách chiết là phù hợp. Bảng 1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid Đợt Gen Thể tích (ml) Nồng độ (µg/ml) OD260/ OD280 OD260/ OD230 1 Vip3 9 960 1,82 2,05 2 CryIAc 10 925 1,85 2,12 3 CryIAc 5 988 1,80 2,04 4 Vip3 5 968 1,82 2,08 5 Vip3 5 955 1,82 2,04 6 CryIAc 5 926 1,81 2,10 Tổng/TB 39 953,7 1,82 2,07 Sau khi tách chiết được ADN plasmid sạch, chúng tôi tiến hành pha loãng thành các nồng độ nghiên cứu (100, 200, 300 µg/ml) bằng nước khử ion vô trùng và bảo quản ở -20 0 C để phục vụ vi tiêm. 4.2. Kết quả nghiên cứu cấu trúc và đặc tính nở hoa bông phục vụ cho vi tiêm 4.2.1. Xác định thời điểm nở hoa trong ngày Các nghiên cứu cho thấy, thời gian vi tiêm tốt nhất khoảng 20-24 giờ sau khi bông nở hoa và tung phấn. Vì vậy, thời điểm hoa bông nở trong ngày là chỉ tiêu rất quan trọng cho vi tiêm, bởi vì thời điểm này được sử dụng để làm căn cứ để xác định thời điểm vi tiêm trong ngày. Bảng 2. Tỷ lệ (%) hoa nở ở các thời điểm trong ngày của 3 giống bông Giống 6-7 h 7-8 h 8-9 h 9-10 h 1- C118 23,43 76,31 0,26 0,00 2- LRA5166 4,38 92,70 2,92 0,00 3- TM1 11,50 87,22 1,29 0,00 Trung bình 13,1 85,4 1,5 0,00 Số liệu nghiên cứu thời điểm nở hoa trong ngày của 3 giống bông trong bảng 2 cho thấy, hoa của các giống bông đều nở rộ vào khoảng thời gian 7-8 giờ (85,4%), riêng giống C118 có hoa nở sớm hơn (6-8 giờ, chiếm 23,43%). Từ kết quả này, chúng tôi đi đến kết luận, thời điểm vi tiêm thích hợp nhất cho 3 giống bông này là từ 6-8 giờ vào ngày thứ 2 sau khi hoa nở. 4.2.2. Kích thước bầu nhụy Kích thước bầu nhụy, đặc biệt là chiều dài trụ noãn của hoa bông tại thời điểm vi tiêm cũng là chỉ tiêu rất quan trọng cho vi tiêm, bởi vì người ta căn cứ vào các chỉ tiêu này để xác định độ sâu kim tiêm và chọn giống bông thích hợp cho vi tiêm. Bảng 3. Kích thước (cm) bầu nhụy và chiều dài trụ noãn của 3 giống bông Cành quả Đặc tính C118 LRA5166 TM1 Rộng 0,73 0,61 0,84 10 [...]... 2.500-5.000mg/l để sàng lọc cây mang gen cho 3 giống C118, LRA5166, và TM1 Đã thu được 483 cây bông vi tiêm gen VIP3 và 2.257 cây vi tiêm gen CryIAc kháng kanamycin 5.2 Đề nghị 1- Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện quy trình chuyển gen vào cây bông thông qua đường ống phấn 2- Tiếp tục sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kanamycin cho số hạt vi tiêm còn lại 3- Sàng lọc cây bông mang gen chuyển bằng kỹ thuật PCR... đợt vi tiêm, đã vi tiêm cho 15.660 hoa, thu được 13.989 quả và 161.487 hạt bông vi tiêm Trong đó, vi tiêm gen CryIAc được 88.013 hạt và vi tiêm gen VIP3 được 73.474 hạt Trung bình, khi vi tiêm, tỷ lệ đậu quả đạt 88,9%, số hạt /quả đạt 11,6 hạt thấp hơn khoảng 50% so với quả đậu bình thường Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của ZHANG Yongquang và JIA Shiring (2004) Nghiên cứu ảnh hưởng của giống đến kết. .. chứng cây bông mẫn cảm với kanamycin và nồng độ kanamycin mẫn cảm của 3 giống bông, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc cây mang gen chuyển 4.4.2.1 Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen VIP3 14 Kết quả sàng lọc cây mang gen chuyển đối với gen VIP3 (bảng 8) cho thấy, hạt vi tiêm có tỷ lệ mọc kém (50,6%); sau khi sàng lọc thu được 483 cây kháng kanamycin (ảnh 6b-6d) từ 41.853 hạt thu được từ vi tiêm. .. chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm .5 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 6 3.1 Vật liệu nghiên cứu .6 3.1.2 Gen kháng sâu .6 3.3 Phương pháp nghiên cứu 7 3.3.5 Phương pháp sàng lọc cây chuyển gen bằng kanamycin 9 3.4 Chỉ tiêu theo dõi 9 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9 4.1 Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN plasmid cung cấp cho vi tiêm. .. kết quả vi tiêm, số liệu bảng 4 cho thấy, các giống có tỷ lệ đậu quả vi tiêm khá cao (83-92%) Trong đó, giống LRA5166 có tỷ lệ đậu quả nhỉnh hơn (90,5%), hai giống còn lại có tỷ lệ đậu quả tương đương nhau (88,4 và 88,1%) Bên cạnh đó, chúng tôi còn nhận thấy, khi vi tiêm cho các giống này, giống LRA5166 cho nhiều hạt /quả nhất (12-16 hạt /quả) , tiếp theo là giống C118 (11-13 hạt /quả) , giống TM1 vi tiêm. .. chiều dài trụ noãn theo Ni Wanchao và cs., 1996) cho giống C118 là 0,72-0,73cm, LRA5166 là 0,620,64cm và TM1 là 0,78-0,80cm 4.3 Kết quả vi tiêm tạo hạt Sau khi tách chiết được ADN plasmid và xác định các thông số cho vi tiêm (thời điểm vi tiêm và độ sâu kim tiêm) , chúng tôi đã tiến hành vi tiêm 2 gen VIP3 và CryIAc ở 3 nồng độ ADN plasmid (10, 20, 30 µg/µl) cho 3 giống bông Kết quả vi tiêm thu được... khi hoa nở Độ sâu của mũi kim cho giống C118 là 0,72-0,73cm, LRA5166 là 0,62-0,64cm, và TM1 là 0,78-0,80cm 3- Thời vụ phù hợp cho tiến hành vi tiêm là vụ Khô, 3 giống bông C118, LRA5166 và TM1 đều thích hợp để vi tiêm 4- Đã xây được quy trình chuyển gen vào cây bông bằng phương pháp vi tiêm qua đường ống phấn cho 3 giống C118, LRA5166 và TM1 (phụ lục 3) Tổng số hạt vi tiêm thu được là 161.487 hạt 5- Sử... giống TM1) Kết quả đánh giá mức độ dị dạng của quả ở các giống được trình bày trong các phụ lục 1 và 2 Ngoài ra, chúng tôi cũng đánh giá cảm quan về mức độ thao tác vi tiêm từ dễ đến khó cho các giống lần lượt là TM1 (bầu to), LRA5166 (bầu nhỏ nhưng dễ chọc kim tiêm) và cuối cùng là C118 (bầu trung bình nhưng vòi nhụy dài, khó bẻ và cuống hoa rất dòn) 13 4.4 Kết quả sàng lọc cây bông vi tiêm mang chuyển. .. và cs (2003) Thuyết minh đề tài nghiên cứu khoa học: Nghiên cứu chuyển gen kháng (Bt và CpTI) vào cây bông và phát triển cây bông ở Vi t Nam, Ninh Thuận, tháng 11/2003 11 Lê Trần Bình và cs (2003) Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Vi t Nam Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội 12 Lê Trần Bình, Lê Thị Muội và cs (2000) Báo cáo tổng kết đề tài KHCN0201B: Chọn lọc và...1 Dài bầu Dài trụ noãn Rộng 2 Dài bầu Dài trụ noãn Rộng 3 Dài bầu Dài trụ noãn Rộng 4 Dài bầu Dài trụ noãn Rộng 5 Dài bầu Dài trụ noãn Rộng 6 Dài bầu Dài trụ noãn Rộng Dài bầu 7 Dài trụ noãn Rộng Dài bầu Trung bình Dài trụ noãn Độ sâu kim 1 Độ sâu kim 2 1,01 0,91 0,75 1,06 0,94 0,75 1,06 0,94 0,78 1,12 0,96 0,81 1,13 . hành đề tài Nghiên cứu chuyển gen Bt vào cây bông bằng vi tiêm trực tiếp vào bầu noãn theo đường ống phấn . 1.2. Mục tiêu của đề tài 1- Xác định các giống bông thích hợp cho vi tiêm; 2- Xây. dựng quy trình chuyển gen Bt cho cây bông bằng phương pháp vi tiêm vào bầu noãn thông qua đường ống phấn; 3- Tạo ra các dòng bông mang gen chuyển Bt phục vụ cho nghiên cứu và sản xuất bông hàng hóa. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN BT VÀO CÂY BÔNG BẰNG VI TIÊM VÀO BẦU NOÃN THEO ĐƯỜNG ỐNG PHẤN Chủ nhiệm đề tài: KS. Trịnh Minh Hợp Cán bộ thực