BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHAN HOÀNG LONG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ VI NHŨ TƯƠNG TỰ NHŨ (SMEDDS) CHỨA CAO CHIẾT LINH CHI GIÀU TRITERPENOID (GANODERMA LUCIDUM) LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHAN HỒNG LONG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ HỆ VI NHŨ TƯƠNG TỰ NHŨ (SMEDDS) CHỨA CAO CHIẾT LINH CHI GIÀU TRITERPENOID (GANODERMA LUCIDUM) NGÀNH/CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC/CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS TRẦN VIỆT HÙNG TS TRƯƠNG CƠNG TRỊ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu tơi Những phần sử dụng tài liệu tham khảo luận văn nêu rõ phần tài liệu tham khảo Các kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực, khách quan Tác giả luận văn Phan Hồng Long LỜI CẢM ƠN Trong q trình thực luận văn, em nhận giúp đỡ của: Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện cho em học tập hỗ trợ sở vật chất phục vụ đề tài Thầy PGS TS Trần Việt Hùng - Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh Thầy TS Trương Cơng Trị – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh dành thời gian, hết lịng giúp đỡ, tận tình hướng dẫn hỗ trợ em suốt trình học tập thực luận văn Các Thầy cô cán phịng thí nghiệm Hóa lý – Khoa Dược – Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi để em sử dụng trang thiết bị dụng cụ thí nghiệm Chị Trần Cao Thụy Hạ Lan, anh Phan Nguyễn Trường Thắng, chị Nguyễn Thị Khánh Linh anh chị thuộc phòng Nghiên cứu Phát triển – Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ bảo em suốt trình thực tập, giúp em có thêm nhiều kinh nghiệm thực tế việc nghiên cứu tạo điều kiện để em hồn thành tốt luận văn Cô PGS TS Phạm Nguyễn Kim Tuyến Cô PGS TS Nguyễn Đức Hạnh phản biện góp ý giúp đề tài em hoàn thiện nhiều Anh Khoa em Đạt, Loo, Khang, Hoàng thuộc nhóm nghiên cứu TS Trương Cơng Trị hướng dẫn em/anh học tập, nghiên cứu thực đề tài Gia đình em ủng hộ động viên em thời gian thực đề tài Em xin gởi đến Nhà trường, Viện Kiểm nghiệm người kể lời chúc sức khỏe, thành công lời cảm ơn chân thành! TÓM TẮT Mở đầu: Triterpenoid chiết xuất từ nấm Linh chi mang lại nhiều lợi ích cho sức khoẻ hạ lipid máu, chống oxy hóa, chống khối u cải thiện tình trạng suy giảm trí nhớ Để khắc phục hạn chế hấp thu triterpenoid, đề tài hướng tới việc nghiên cứu bào chế hệ phân phối thuốc vi tự nhũ (SMEDDS) chứa cao chiết linh chi giàu triterpenoid (CLT-SMEDDS) Phương pháp: Để chọn thành phần tạo SMEDDS thiết lập giản đồ ba pha, pha dầu, chất diện hoạt, đồng diện hoạt/đồng dung môi sàng lọc dựa khả hòa tan/phân tán cao Linh chi, khả nhũ hóa tính an tồn tá dược sử dụng Các công thức vùng tạo vi nhũ tương giản đồ ba pha khảo sát công thức tối ưu lựa chọn dựa tính chất hóa lý độ bền nhiệt động học khả phân tán môi trường nước Quy trình điều chế cỡ mẫu 100 g/mẫu xây dựng CLT-SMEDDS đánh giá tính chất hóa lý, bao gồm kích thước tiểu phân phân bố kích cỡ, zeta, tỷ trọng, độ nhớt, pH, định tính định lượng hoạt chất cao Linh chi Kết quả: Nghiên cứu thiết lập cơng thức quy trình bào chế CLTSMEDDS với thành phần PGM - Kolliphor RH40/Tween 80 - PEG 400 - CPLT (16,7:33,3:16,7:33,3; w/w/w/w), khả thi nâng cỡ lơ sản xuất lớn CLT-SMEDDS có hàm lượng triterpenoid tồn phần cao, bền nhiệt động học dễ dàng phân tán tạo vi nhũ tương có kích thước trung bình 300 nm môi trường pH tương tự pH sinh lý đường uống đưa vào thể (pH 1,2; 4,5 6,8) Các tính chất hóa lý CLT-SMEDDS pH, độ nhớt, tỷ trọng phù hợp cho phát triển dạng bào chế viên nang mềm thành phẩm Kết luận: Nghiên cứu tạo CLT-SMEDDS làm tiền đề tiếp tục phát triển sản phẩm nano linh chi giàu triterpenoid, giúp nâng cao hiệu trị liệu từ cao chiết linh chi giàu triterpenoid Từ khóa: Acid ganoderic A, G lucidum, vi nhũ tương, SMEDDS, triterpenoid SUMMARY Introduction: Triterpenoids extracted from Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) P Karst (G lucidum) provide various health benefits, such as hypolipidemic effect, antioxidant activity, anti-tumor property, and improving memory impairment To overcome the poor absorption of triterpenoids, this study aimed to develop a selfmicroemulsifying drug delivery system (SMEDDS) containing triterpenoid-rich G lucidum extract (CLT-SMEDDS) Methods: In order to select SMEDDS-forming components and construct pseudoternary phase diagrams, oil phase, surfactant, and co-surfactant/co-solvent were screened based on the loading capacity of G lucidum extract, emulsifying ability, and the safety of excipients Within the microemulsion region of pseudo-ternary phase diagrams, the optimal formulation was selected based on physicochemical properties such as thermodynamic stability and dispersibility in aqueous media The preparation process of 100 g scale sample was developed, and CLT-SMEDDS was evaluated for physicochemical properties, including particle size and size distribution, zeta potential, density, viscosity, pH, identification and assay of active ingredients Results: The study has developed the formulation and preparation process of CLTSMEDDS with PGM - Kolliphor RH40/Tween 80 - PEG 400 - CPLT (16.7:33.3:16.7:33.3; w/w/w/w) components, possible for production scale-up The selected CLT-SMEDDS formulation has a high total triterpenoid content, thermodynamic stability, and fast dispersion to form microemulsions under 300 nm in average size at physiological pH conditions (pH 1,2; 4,5 and 6,8) Other physicochemical properties of CLT-SMEDDS including pH, viscosity, and density has shown the suitability for the development of soft gelatin capsule Conclusion: The study is the foundation for further development of triterpenoid-rich G lucidum nanopharmaceuticals to improve the therapeutic efficacy of triterpenoidrich G lucidum extract Keywords: G lucidum, Ganoderic acid A, microemulsion, SMEDDS, triterpenoid MỤC LỤC Danh mục chữ viết tắt i Danh mục bảng ii Danh mục sơ đồ, hình iv MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm Linh chi 1.2 Tổng quan sản phẩm viên nang mềm nano Linh chi Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .16 2.1 Đối tượng nghiên cứu .16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 Chương KẾT QUẢ .31 3.1 Độ tan cao Linh chi giàu triterpenoid tá dược .31 3.2 Nghiên cứu điều chế cao PEG Linh chi giàu triterpenoid 32 3.3 Nghiên cứu thiết lập cơng thức bào chế quy trình điều chế CLT-SMEDDS 34 3.4 Phân tích tính chất hóa lý CLT-SMEDDS 44 3.5 Dự thảo tiêu chuẩn sở cho dịch thuốc đóng nang 50 Chương BÀN LUẬN 51 4.1 Cao Linh chi giàu triterpenoid 51 4.2 Cao PEG Linh chi giàu triterpenoid 51 4.3 Lựa chọn thành phần chất diện hoạt để xây dựng công thức SMEDDS .52 4.4 Quy trình điều chế CLT-SMEDDS 53 4.5 Khả phát triển thành sản phẩm viên nang mềm nano Linh chi giàu triterpenoid 54 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .55 Kết luận .55 Đề nghị 56 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CĨ LIÊN QUAN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC i Danh mục chữ viết tắt Ký hiệu Tên gốc tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt CLT Cao Linh chi giàu triterpenoid CLTSMEDDS Hệ phân phối thuốc vi tự nhũ chứa cao Linh chi giàu triterpenoid cP Centipoise CPLT Centipoise Cao PEG Linh chi giàu triterpenoid DNA Deoxyribonucleic acid EtOH Ethanol G lucidum Ganoderma lucidum (W Curt.: Fr.) P Karst Nấm Linh chi GRAS Generally recognized as safe Thường công nhận an tồn HPLC High performance liquid chromatography Sắc kí lỏng hiệu cao PEG Polyethylene glycol PGM Propylene glycol monocaprylate rpm Round per minute Vòng/phút SD Standard deviation Độ lệch chuẩn SEDDS Self-emulsifying drug delivery systems Hệ phân phối thuốc tự nhũ SMEDDS Self-microemulsifying drug delivery system Hệ phân phối thuốc vi tự nhũ SNEDDS Self-nanoemulsifying drug delivery system Hệ phân phối thuốc nano tự nhũ Acid deoxyribonucleic ii Danh mục bảng Bảng 1.1 Một số nghiên cứu hệ phân phối thuốc nano từ dược liệu 13 Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Dung môi sử dụng nghiên cứu 17 Bảng 2.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 18 Bảng 2.4 Thành phần CLT-SMEDDS pha chế cỡ mẫu 100 g/mẫu .23 Bảng 2.5 Chương trình dung mơi theo gradient 28 Bảng 2.6 Thời gian lưu hệ số đáp ứng tương đối triterpenoid cao Linh chi .29 Bảng 3.1 Độ tan cao Linh chi giàu triterpenoid tá dược 31 Bảng 3.2 Kết khảo sát tỷ lệ PEG 400 33 Bảng 3.3 Kết phân tích số tính chất cao PEG Linh chi giàu triterpenoid 33 Bảng 3.4 Tỷ lệ thành phần kết thử nghiệm cảm quan, độ bền lực ly tâm công thức .37 Bảng 3.5 Tỷ lệ thành phần kết thử nghiệm khả phân tán công thức 38 Bảng 3.6 Kết dãy phân bố kích thước tiểu phân công thức P9, P10, P11, P17 P18 .39 Bảng 3.7 Thành phần công thức P18, P20 P21 40 Bảng 3.8 Kết đánh giá tính chất hóa lý cơng thức P18, P20 P21 41 Bảng 3.9 Kết điều chế CLT-SMEDDS cỡ mẫu 100 g/mẫu 42 Bảng 3.10 Kết phân tích hệ phân tán P18 môi trường nước cất, pH 1,2, pH 4,5 pH 6,8 45 iii Bảng 3.11 Kết đo zeta công thức P18 47 Bảng 3.12 Dự thảo tiêu chuẩn sở cho dịch đóng thuốc đóng nang CLT-SMEDDS 50 iv Danh mục sơ đồ, hình Hình 3.1 Giản đồ pha PGM, PEG 400 Tween 80 (Vùng tạo vi nhũ tương màu xanh cây) .34 Hình 3.2 Giản đồ pha PGM, PEG 400 Kolliphor RH40 (Vùng tạo vi nhũ tương màu xanh cây) .35 Hình 3.3 Giản đồ pha PGM, PEG 400 Smix (Vùng tạo vi nhũ tương màu xanh cây) .35 Hình 3.4 Sơ đồ quy trình điều chế SMEDDS chứa cao Linh chi giàu triterpenoid cỡ mẫu 100g/mẫu 43 Hình 3.5 Hình chụp cơng thức P18 kính hiển vi độ phóng đại 100 lần .44 Hình 3.6 Biểu đồ phân bố kích thước tiểu phân phân tán công thức P18 môi trường nước cất (A), pH 1,2 (B), pH 4,5 (C) pH 6,8 (D) .46 Hình 3.7 Phân bố zeta công thức P18 47 Hình 3.8 Kết định tính cơng thức P18 sắc ký lớp mỏng đèn UV 254nm (trái) đèn UV 365nm (phải) 48 Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC acid ganoderic A chuẩn (A) P18 (B) .49 MỞ ĐẦU Dược liệu nguồn nguyên liệu quan trọng nghiên cứu phát triển thuốc Hơn nửa số hoạt chất chấp nhận Cục quản lý Thuốc Thực phẩm Mỹ (FDA) từ năm 1981 đến 2019 sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên1 Hiện nay, nghiên cứu phát triển sản phẩm từ dược liệu hướng phát triển chiến lược ngành Dược Việt Nam Nấm Linh chi nhận quan tâm lớn việc nghiên cứu phát triển thuốc có nhiều chứng khoa học lợi ích sức khỏe thử nghiệm tiền lâm sàng lâm sàng Ngoài tác dụng dược lý giúp nâng cao sức đề kháng bồi bổ sức khỏe, nấm Linh chi nghiên cứu thử nghiệm điều trị khối u, hội chứng chiến tranh Vùng Vịnh (Gulf War illness), bệnh chàm, hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan, viêm loét dày tá tràng, đái tháo đường…2 Với công dụng, tác dụng tốt nấm Linh chi, ngày nhiều người mong muốn tiếp cận sử dụng nấm Linh chi biện pháp để phòng bệnh, hỗ trợ điều trị bệnh, tăng cường sức khoẻ, lại an toàn so với liệu pháp điều trị thuốc tây y Do đó, nhu cầu sử dụng nấm Linh chi sản phẩm an toàn chất lượng từ nấm Linh chi nhu cầu cần thiết Trong năm 2015, tổng giá trị sản lượng toàn cầu hàng năm ngành công nghiệp nấm Linh chi ước tính vào khoảng tỷ USD3 Riêng thị trường Việt Nam, theo nghiên cứu điều tra doanh thu tiêu thụ sản phẩm nấm Linh chi, doanh thu năm 2005 1284 tỷ đồng, năm 2006 1436 tỷ đồng, năm 2008 1747 tỷ đồng, đến năm 2009, doanh thu lên đến 1878 tỷ đồng Viện Kiểm Nghiệm Thuốc TP Hồ Chí Minh nghiên cứu sử dụng hệ thống chiết CO2 siêu tới hạn nhằm điều chế cao Linh chi giàu triterpenoid (≥ 2% triterpenoid toàn phần, HPLC) Tuy nhiên, cao điều chế chất đặc qnh, khó phân tán, khơng thuận lợi phát triển tiếp dạng bào chế Thêm vào đó, hầu hết sản phẩm từ dược liệu cao chiết Linh chi giàu triterpenoid thường có độ tan kém, có đặc tính kỵ nước phân bố kém, dẫn đến giảm sinh khả dụng khả điều trị, cần sử dụng nhiều liều tăng liều lần sử dụng4,5 Chính vậy, đề tài hướng tới việc cải thiện thể chất cao Linh chi giàu triterpenoid tải vào hệ vi nhũ tương tự nhũ (SMEDDS), nhằm cải thiện hấp thu chiết xuất từ nấm Linh chi, nâng cao hiệu điều trị sản phẩm tính an tồn Trên sở đó, đề tài giúp nâng cao giá trị nguồn dược liệu nấm Linh chi Việt Nam Sự thành công sản phẩm cịn góp phần xây dựng phát triển thương hiệu nấm Linh chi Đất Việt nước vươn tầm giới Mục tiêu tổng quát: Bào chế SMEDDS chứa cao chiết Linh chi giàu triterpenoid, phù hợp để phát triển dạng bào chế viên nang mềm Mục tiêu nghiên cứu đề tài cụ thể: Nghiên cứu điều chế cao Linh chi giàu triterpenoid phối hợp với PEG 400, phù hợp để phát triển dạng bào chế viên nang mềm Nghiên cứu tiền bào chế, thiết lập công thức xây dựng quy trình bào chế SMEDDS chứa cao chiết Linh chi giàu triterpenoid Phân tích tính chất hoá lý, đánh giá độ ổn định định lượng SMEDDS chứa cao chiết Linh chi giàu triterpenoid Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan nấm Linh chi 1.1.1 Phân loại nấm Linh chi Nấm Linh chi cịn có tên khác Tiên thảo, Nấm trường thọ, Vạn niên nhung… Trung Quốc thường gọi Linh chi tên Lingzhi; Nhật gọi Reishi, Munnertake Sachitake, Hàn gọi Youngzhi Phân loại khoa học: - Giới: Fungi - Ngành: Basidiomycota - Lớp: Agaricomycetes - Bộ: Polyporales - Họ: Ganodermataceae Họ nấm Linh chi gồm chi: Ganoderma Karst, Amauroderma Murr, Humphreya Stey Haddowia Stey, Tomophagus Tuy nhiên, phần lớn nấm Linh chi nằm chi Ganoderma Karst Amauroderma Murr, chủ yếu chi Ganoderma Karst với khoảng 219 loài6 Từ thời xưa nhắc tới loại Linh chi hay gặp (lục bảo Linh chi), phân biệt theo màu sắc xanh, đỏ, trắng, vàng, đen tím tương ứng với tên gọi Thanh chi, Hồng chi, Bạch chi, Hoàng chi, Hắc chi Tử chi Trong loại Linh chi màu đỏ (Hồng chi/ Xích chi) có tác dụng phịng điều trị bệnh tốt Do đó, Linh chi đỏ sử dụng rộng rãi giới 1.1.2 Thành phần hóa học Nấm Linh chi chứa khoảng 90% trọng lượng nước, 10% lại bao gồm 10-40% protein, 2-8% chất béo, 3-28% carbohydrat, 3-32% chất xơ, 8- 10% tro số khống chất như: kali, canci, phosphat, magne, selen, sắt, kẽm, đồng7 Hầu hết loại nấm chứa số vitamin, cụ thể niacin, thiamin, riboflavin, biotein vitamin C8 Thêm vào đó, nấm Linh chi cịn chứa loạt chất có hoạt tính sinh học, chẳng hạn terpenoid, steroid, phenol, nucleotid dẫn xuất chúng, glycoprotein polysaccharid9–11 Protein nấm Linh chi có chứa đầy đủ acid amin thiết yếu, giàu lysin leucin Tổng hàm lượng chất béo thấp tỷ lệ cao đa acid béo khơng bão hịa tương đối so với tổng số acid béo nấm Linh chi coi đóng góp đáng kể cho giá trị sức khỏe8,12,13 Các polysaccharid, peptidoglycan triterpen ba nhóm hoạt chất sinh học nấm Linh chi14 Tuy nhiên, số lượng tỷ lệ thành phần khác thay đổi sản phẩm thị trường Sự khác biệt loài, chủng nấm phương pháp sản xuất khác 1.1.2.1 Nhóm triterpenoid Nấm Linh chi giàu triterpenoid, thành phần làm cho nấm có vị đắng Triterpenoid mang lại nhiều lợi ích cho sức khoẻ tác dụng hạ lipid máu chống oxy hóa Hàm lượng triterpenoid dùng để đánh giá chất lượng nấm Linh chi15–17 Các triterpen phân lập từ G lucidum acid ganoderic A B, xác định Kubota năm 198218 Kể từ đó, 316 triterpen phát phân lập từ thể quả, bào tử sợi nấm Linh chi Ganoderma spp.19 Phần lớn acid ganoderic acid lucidenic, triterpen khác ganoderal, ganoderiol acid ganodermic xác định20–22 1.1.2.2 Nhóm polysaccharid peptidoglycan Các polysaccharid khác chiết xuất từ cuống, bào tử sợi nấm nấm Linh chi Các polysaccharid sản xuất từ sợi nấm nuôi cấy sinh khối khác đường peptid thành phần trọng lượng phân tử (ví dụ, ganoderan A, B C) Các polysaccharid nấm Linh chi chủ yếu gồm βglucan, heteropolysaccharid glycoprotein Các peptidoglycan mang hoạt tính sinh học khác phân lập từ nấm Linh chi, bao gồm GLPG (proteoglycan từ G lucidum) với hoạt tính kháng virus23, GLIS (chất điều hoà miễn dịch từ G lucidum)24, PGY, GL-PS peptid, … 1.1.3 Công dụng Theo Y học cổ truyền, nấm Linh chi có vị nhạt, tính ấm, có tác dụng tư bổ cường tráng Y học cổ truyền Trung Quốc, nấm Linh chi xếp đứng đầu nhóm “Thượng Dược” với chức điều hịa hoạt động chuyển hóa thể, kéo dài tuổi thọ, tăng khả đề kháng thể tác động bất lợi môi trường xung quanh Linh chi ứng dụng rộng rãi y học hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan, ung thư, viêm loét dày tá tràng, đái tháo đường Các tác dụng chống oxy hóa, điều hòa miễn dịch, bảo vệ khử độc gan, giảm đường huyết nghiên cứu công bố 11,25–29 1.1.3.1 Bảo vệ gan Cao chiết methanol G lucidum cho thấy tác dụng bảo vệ gan đưa vào đường uống chuột (500 mg/kg/ngày) 30 ngày trước gây tổn thương gan benzopyren27 Chiết xuất ngăn chặn gia tăng alkaline phosphatase, alanine aminotransferase, aspartate transaminase tăng cường mức độ GSH, SOD, GPx, CAT GST Bảo vệ gan bị tổn thương gây CCl4 quan sát thấy chuột điều trị acid ganoderic (từ G lucidum) mức 10 mg 30 mg/kg/ngày tiêm tĩnh mạch ngày30 Ngoài ra, polysaccharid chiết xuất từ G lucidum cho chuột uống 28 ngày chứng minh cải thiện rõ tình trạng xơ gan28 1.1.3.2 Ức chế tế bào ung thư Nấm Linh chi thường sử dụng với tác dụng tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung thư kết hợp với liệu pháp khác Trong nấm Linh chi, polysaccharid triterpen hai nhóm hoạt chất giúp ức chế tiêu diệt tế bào ung thư Các nghiên cứu chứng minh thực nghiệm in vitro in vivo 31,32 Trên in vitro, nấm Linh chi chứng minh gây ức chế phát triển nhiều dòng tế bào ung thư33,34 1.1.3.3 Hạ đường huyết Jia cộng nghiên cứu chuột bị gây tiểu đường streptozotocin, sử dụng dịch chiết giàu polysaccharid Sau điều trị, nồng độ insulin huyết tăng (so với chứng) nồng độ glucose giảm cách phụ thuộc vào liều Nghiên cứu cho thấy, việc điều chế đường huyết, điều trị G lucidum giúp tăng tác nhân chống oxy hóa35 Gao cs chứng minh tác dụng hạ đường huyết nấm Linh chi tiến hành thử nghiệm so sánh 71 bệnh nhân đái tháo đường type Các bệnh nhân chia làm nhóm, nhóm điều trị Ganopoly (phân đoạn giàu polysaccharide từ G lucidum) 1800 mg, lần/ngày 12 tuần, nhóm cịn lại sử dụng placebo, với liều tương tự Kết nhóm điều trị ganopoly cho HbA1C glucose huyết tương giảm đáng kể sau 12 tuần36 Nhìn chung, liệu từ nghiên cứu khác cho thấy nấm Linh chi giúp điều chỉnh đường huyết mơ hình động vật thí nghiệm 1.1.3.4 Điều hoà miễn dịch Nhiều nghiên cứu cho thấy tác dụng nấm Linh chi liên quan đến hỗ trợ điều hồ miễn dịch thơng qua cảm ứng cytokine tăng cường lại quan miễn dịch phản ứng lại kích thích25,37 Các thành phần khác từ G lucidum làm tăng cường phát triển trưởng thành lymphocyte T B, tế bào đơn nhân lách, tế bào NK tế bào đuôi gai nuôi cấy in vitro nghiên cứu in vivo động vật38–40 Ở chuột BALB/c bình thường, chiết xuất giàu polysaccharid từ G lucidum kích thích tăng sinh splenocytes tăng cường hoạt động đại thực bào, tế bào NK, dẫn đến gia tăng IL-6 IFN-γ41 1.1.3.5 Chống oxy hố Chất chống oxy hóa giúp bảo vệ thành phần tế bào khơng bị oxy hố, làm giảm nguy đột biến gây ung thư, bảo vệ tế bào miễn dịch, cho phép trì giám sát đáp ứng miễn dịch G lucidum có chứa nhiều thành phần, có polysaccharid triterpenoid thể khả chống oxy hóa tốt thử nghiệm in vitro Dịch chiết nước nóng G lucidum bảo vệ đáng kể tế bào Raji sử dụng tác nhân oxy hố hydroperoxid (H2O2) cơng DNA42 Dịch chiết bảo vệ DNA tế bào lympho người mức nồng độ thấp ( 0,01% w/v)29 1.1.3.6 Chống loét dày Ngoài ra, tác dụng nấm Linh chi tổn thương dày nghiên cứu Nhóm nghiên cứu Gao Tang cộng gây loét dày chuột acid acetic điều trị GL-PS, polysaccharid chiết xuất từ G lucidum, với liều 0,5 1,0 g/kg 14 ngày Kết quả, GL-PS làm gia tăng đáng kể việc chữa lành vết loét (40% 56%, tương ứng với liều điều trị) Điều trị với liều 1,0 g/kg cho thấy phục hồi đáng kể chất nhầy nồng độ prostaglandin so với nhóm chứng43 1.1.4 Cao chiết Linh chi giàu triterpenoid Các nhóm có hoạt tính sinh học nấm Linh chi bao gồm: polysaccharid, peptidoglycan triterpen13 Nhóm triterpenoid nhóm mang lại lợi ích cho sức khỏe tác dụng hạ lipid máu chất chống oxy hóa Theo số nghiên cứu cho thấy hàm lượng triterpenoid dùng để đánh giá chất lượng nấm Linh chi15–17 Chính vậy, đề tài sử dụng nguyên liệu cao chiết Linh chi giàu triterpenoid nhằm mang lại hiệu điều trị đảm bảo chất lượng tốt cho sản phẩm 1.2 Tổng quan sản phẩm viên nang mềm nano Linh chi 1.2.1 Tổng quan hệ phân tán nano thích hợp cho viên nang mềm 1.2.1.1 Hệ phân phối thuốc tự nhũ hóa Định nghĩa Hệ phân phối thuốc tự nhũ hóa (SEDDS) hỗn hợp bền mặt nhiệt động có thành phần bao gồm dầu, chất diện hoạt chất đồng diện hoạt44 Hệ thống phân phối thuốc có khả tự nhũ hình thành nhũ tương dầu nước điều kiện khuấy trộn nhẹ nhàng môi trường nước, điều kiện tương tự dịch đường tiêu hóa45 "SEDDS" thuật ngữ tổng quát hệ thống mang thuốc có khả tạo thành nhũ tương, thường gọi cụ thể hệ phân phối thuốc vi tự nhũ (SMEDDS) hệ phân phối thuốc nano tự nhũ (SNEDDS) Phân biệt hai loại hệ phân phối dựa kích thước giọt dầu nhũ tương: SMEDDS tạo thành vi nhũ tương nước với kích thước giọt dầu lớn 100 nm, SNEDDS tạo thành nhũ tương nano nước với kích thước giọt dầu bé 100 nm46,47 Ngồi ra, số tác giả cịn phân biệt SMEDDS SNEDDS dựa phương pháp điều chế tính ổn định nhiệt động học nhũ tương48 Ưu điểm Cải thiện độ hịa tan tăng tính thấm : Đối với dược chất khó tan nước, mức độ hấp thu phụ thuộc nhiều vào độ hòa tan dẫn đến sinh khả dụng dược chất bị hạn chế Để khắc phục hạn chế trên, hệ tự nhũ hóa có ích việc phân phối thuốc thơng qua việc hình thành tiểu phân giọt dầu siêu nhỏ nang hố hoạt chất khó tan phân tán toàn dịch tiêu hóa, làm tăng đáng kể diện tích tiếp xúc với màng sinh học Dược chất nằm giọt dầu kích thước siêu nhỏ hấp thu cách hiệu qua màng ruột thông qua đường xuyên bào (đi qua tế bào M ruột) qua khoảng gian bào để vào hệ thống bạch huyết vào hệ tuần hồn chung, tránh q trình chuyển hóa lần đầu qua gan4 Ngoài ra, chất diện hoạt thường sử dụng công thức hệ tự nhũ Tween® 80, Span®, Cremophor® (EL RH 40) Pluronic® cho thấy có khả ức chế kênh bơm ngược, từ góp phần làm tăng sinh khả dụng đường uống49 Độ ổn định: Độ ổn định mặt hóa học vật lý hoạt chất cải thiện SMEDDS không chứa nước chứa lượng nước khơng đáng kể Ngồi ra, hoạt chất nang hóa giọt dầu góp phần bảo vệ hoạt chất khỏi tác động enzym thể yếu tố hóa học khác dịch tiêu hóa50 Dễ dàng sản xuất nâng cỡ lô : Hệ tự nhũ thuận tiện cho sản xuất cỡ lô lớn, thiết bị hệ thống sản xuất tương đối đơn giản dễ tìm thiết bị trộn có cánh khuấy, máy đóng nang…hiện hầu hết công ty sản xuất dược phẩm trang bị Ngồi ra, hệ tự nhũ sản xuất dạng viên nang cứng viên nén trường hợp hệ tự nhũ hóa rắn Các dạng bào chế thuận tiện cho việc phân phối, lưu trữ bảo quản so với loại nhũ tương truyền thống50 Hạn chế Nguy oxi hóa tính đa hình tá dược lipid: Các acid béo khơng bão hịa dẫn chất tá dược lipid dễ bị oxy hóa Do đó, việc thêm tác nhân chống oxy hóa tan lipid vào hệ tự nhũ cần thiết Hiện tượng đa hình tá dược lipid nhạy cảm với nhiệt độ yếu tố quan trọng cần kiểm soát suốt trình sản xuất bảo quản50 Dược lý : Sự diện chất diện hoạt công thức hệ tự nhũ với hàm lượng lớn (khoảng 30-60%) gây kích ứng hệ tiêu hóa51 Thành phần SMEDDS Thành phần hệ tự nhũ thường bao gồm thành phần bản: pha dầu, chất diện hoạt chất đồng diện hoạt 10 Dầu: Dầu xem thành phần mang tính định cơng thức hệ tự nhũ có vai trị khơng việc hịa tan nang hóa hoạt chất, mà tạo điều kiện cho hoạt chất thấm qua hệ thống mạch bạch huyết ruột dễ dàng, từ làm tăng tính hấp thu hoạt chất hệ tiêu hóa SMEDDS sử dụng loại dầu triglycerid chuỗi dài hay chuỗi trung bình, tự nhiên hay tổng hợp với mức độ bão hòa khác hệ tự nhũ4 Chất diện hoạt: Các chất diện hoạt không ion thường dùng công thức hệ tự nhũ nhờ tính an tồn cao khả tương thích tốt mặt sinh học Một số chất diện hoạt sử dụng phổ biến Cremophor® EL, Cremophorâ RH 40, Tweenđ 80 v LabrasolTM La chn cht diện hoạt cho hệ tự nhũ thường dựa khả nhũ hóa chất diện hoạt tính tương thích chất diện hoạt loại dầu chọn khả hòa tan dược chất4 Chất đồng diện hoạt: Sự diện chất đồng hoạt công thức bào chế giúp cho hệ tự nhũ hoá tạo thành vi nhũ tương hay nhũ tương nano bền vững, làm giảm sức căng bề mặt hòa tan hoạt chất tốt Các alcol mạch ngắn thường sử dụng với vai trò chất đồng diện hoạt hay đồng dung mơi, ví dụ ethanol, butanol propylen glycol, polyethylen glycol, glycerol Transcutol4 1.2.1.2 Hệ phân tán thân nước Nhằm mục đích cải thiện khả tải phân phối thuốc, đặc biệt sản phẩm chiết xuất từ thực vật có hỗn hợp phức tạp hoạt chất khác nhau, nghiên cứu tạo số hệ thống tương tự dạng hệ phân tán tự nhũ, ví dụ hệ phân tán thân nước hay hệ phân tán polyol Các hệ phân tán có chứa thành phần tương tự hệ phân phối thuốc tự nhũ hóa, bao gồm pha dầu, chất diện hoạt, đồng diện hoạt tá dược thân nước ví dụ polyethylene glycol (PEG), propylene glycol, glycerol,… Hệ phân tán thân nước thích hợp để tải chiết xuất dược liệu có thành phần phức tạp chứa nhiều hoạt chất khác nhau, có hoạt chất thân nước, có hoạt chất thân dầu 11 Do hàm lượng nước thấp, hệ phân tán phù hợp phát triển dạng bào chế viên nang mềm 1.2.2 Tổng quan sản phẩm từ nấm Linh chi thị trường Trong năm 2015, tổng giá trị sản lượng tồn cầu hàng năm ngành cơng nghiệp nấm Linh chi ước tính vào khoảng tỷ USD, đó, thị trường Trung Quốc chiếm 30% tổng giá trị sản lượng toàn cầu 75% sản lượng3 Riêng thị trường Trung Quốc, có khoảng 180 sản phẩm thuốc, 1200 thực phẩm chức 3300 mỹ phẩm chứa thành phần từ nấm Linh chi sản xuất đưa thị trường52 Các sản phẩm dạng dược liệu tươi kết hợp với tá dược khác dạng phiến dược liệu khô, bột khô, trà, rượu, viên nang, bột bào tử, dầu bào tử, bột nhão chiết xuất, bột mycelia, viên nén, kem… thơng qua q trình cắt, làm khơ, nghiền, trộn đồng nhất53 Trong đó, viên nang dạng bào chế phổ biến dễ dàng điều chế nhất: khoảng 46% thuốc 70% thực phẩm chức sản xuất từ chiết xuất nấm Linh chi dạng viên nang Các dạng bào chế thường gặp khác viên nén cốm52 Trên thị trường Việt Nam, có nhiều sản phẩm viên nang mềm chứa chiết xuất nấm Linh chi dạng thực phẩm chức Các sản phẩm thị trường Việt Nam đa phần dạng hỗn dịch cao khô phân tán dung dịch dầu đóng vào viên nang mềm, bột cao khơ đóng vào viên nang cứng dập thành viên nén Các công bố nghiên cứu bào chế sản phẩm viên nang mềm nano cao chiết nấm Linh chi chưa thật phổ biến 1.2.3 Các cơng trình nghiên cứu liên quan nấm Linh chi giới Hiện nay, tạp chí khoa học quốc tế có nhiều nghiên cứu tác động dược lý nấm Linh chi: Jiang, Y cộng (2014) phát triển hỗn hợp tiêm chứa polysaccharid chiết xuất từ nấm Linh chi đỏ, thử tác dụng dược lý chuột với khả chống mệt mỏi mà không gây hiệu ứng thay đổi cân nặng Thêm vào đó, hỗn hợp tiêm có tính an tồn khơng gây phản ứng dị ứng chuột lang Hỗn hợp tiêm chuẩn 12 bị cách tinh chế dịch chiết nước polysaccharid từ nấm Linh chi qua nhiều giai đoạn kết hợp phương pháp khác nhau54 Bidegain, M A cộng (2020) phát triển dạng bào chế hỗn dịch kết hợp dịch chiết nước dịch chiết cồn từ nấm Linh chi với tá dược gây treo Carbomer® 940 (hàm lượng 0,5-1,0%) Hỗn dịch giúp giữ toàn vẹn tác động hiệp lực hợp chất có hoạt tính sinh học có nấm, nhờ vào việc kết hợp loại dịch chiết nước cồn từ nấm Linh chi55 Khursheed, R cộng (2020) phát triển hệ tự nhũ nano chứa chiết xuất curcumin Sau đó, tác giả sử dụng giá mang rắn cao khô chiết xuất từ nấm Linh chi tá dược khác để hóa rắn hệ tự nhũ nano chứa curcumin Sự khác biệt không đáng kể mặt hiệu suất tải, kích thước tiểu phân, độ hịa tan SNEDDS lỏng SNEDDS hóa rắn cho thấy tiềm cao khô chiết xuất nấm Linh chi việc tạo hệ tự nhũ nano ổn định56 Tại Việt Nam, năm 2019, nhóm tác giả Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh bào chế thành công viên nang mềm chứa cao khô nấm Linh chi phân tán tá dược thân dầu có nguồn gốc thiên nhiên Sản phẩm kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm bảo vệ sức khoẻ Nhìn chung, có nghiên cứu sâu vào phát triển hệ phân tán nano từ chiết xuất nấm Linh chi Việt Nam Hầu hết nghiên cứu liên quan dừng lại việc tạo dạng dịch, cao chiết xuất, sau đóng vào viên nang cứng phân tán tá dược thân dầu để đóng vào viên nang mềm Tuy nhiên, giới có nhiều nghiên cứu phát triển thành cơng hệ phân tán nano cho thành phần dược liệu khác Trong nghiên cứu gần đây, việc phát triển dạng bào chế nano cho chiết xuất từ dược liệu (tiểu phân nano polymer 57,58, vi nang nano 59, liposome60,61, hệ tiểu phân lipid rắn SLN62 nhũ tương nano63,64) đem lại nhiều lợi ích, bao gồm làm tăng độ tan, tăng sinh khả dụng, bảo vệ mô tế bào lành, tăng tác dụng dược lý, tăng ổn định, tăng phân bố mô thể, phóng thích hoạt chất kiểm sốt, bảo vệ khỏi phân hủy vật lý hóa 13 học61 Vì thế, phát triển hệ phân phối thuốc nano cho dược liệu giúp tăng tác dụng thuốc có nguồn gốc dược liệu65–67 Trong đó, hệ phân phối thuốc tự nhũ hóa (SEDDS) hệ phân phối thuốc tiềm giúp tăng sinh khả dụng thành phần dược liệu hấp thu kém, phù hợp để phát triển dạng bào chế viên nang mền Ví dụ mangiferin68, tanshinones69, patchoulic70, lutin71 curcumin72,73 nghiên cứu phát triển dạng SMEDDS Bảng 1.1 Một số nghiên cứu hệ phân phối thuốc nano từ dược liệu4 Sản phẩm Nguồn gốc Hoạt tính Nghiên cứu dược liệu sinh học sinh khả dụng Chống viêm / Diện tích ung thư / loét đường cong dày - tá (AUC) lớn Mekjaruskul tràng/ vi gấp lần so với et al (2013) khuẩn / dị hệ phức hợp ứng / béo phì cyclodextrin Methoxyflavone- Kaempferia SMEDDS parviflora Trái rau Apigenin- (hành, cam, SMEDDS trà, hoa cúc, lúa mì, giá đỗ) Tham khảo Chống oxy hóa / khối u / viêm nhiễm / Không đề cập virus / rối Zhao et al (2012) loạn lo âu Chống khối u Curcumin- Curcuma SMEDDS longa / viêm nhiễm / virus / oxy hóa / HIV Khơng đề cập Cui et al (2009) 14 Sản phẩm Nguồn gốc Hoạt tính Nghiên cứu dược liệu sinh học sinh khả dụng Tham khảo Diện tích Diospyros Chống oxy đường cong Persimmon leaf kaki L hóa / viêm / (AUC) cao Li et al extract-SNEDDS Dispryosl, ung thư / dị gấp 1,6 lần so (2011) Ebenaceae ứng với viên nén thông thường Zedoary turmeric Curcuma oil-SNEDDS zedoaria (ZTO) Bảo vệ gan, Diện tích ức chế khối u, đường cong chống oxy (AUC) cao hóa / gấp 1,7 lần so vi khuẩn nguyên liệu Chống viêm / Baicalein- Scutellaria ung thư / oxy SMEDDS baicalensis hóa / virus / dị ứng Điều trị tăng huyết áp, xơ Daidzein- Leguminous SMEDDS vữa động mạch ung thư Artemether- Artemisinin SMEDDS Chống sốt rét Zhao et al (2010) Diện tích đường cong (AUC) cao gấp lần so với Liu et al (2012) dạng hỗn dịch Diện tích đường cong (AUC) cao Shen et al gấp 2,5 lần so (2010) với dạng hỗn dịch Không đề cập Mandawgade et al (2008) 15 Trên sở nghiên cứu khoa học, phát triển sản phẩm hệ phân tán nano từ chiết xuất nấm Linh chi có tính khả thi cao, giúp cải thiện độ tan, sinh khả dụng, độ ổn định, giúp nâng cao hiệu tính an tồn dược liệu quý nấm Linh chi Nghiên cứu hệ phân tán nano chiết xuất dược liệu góp phần nâng cao giá trị nguồn tài nguyên dược liệu Việt Nam, đặc biệt nấm Linh chi, dược liệu quý nước ta 16 Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Nguyên vật liệu Các nguyên vật liệu liệt kê Bảng 2.1 Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng nghiên cứu STT Nguyên liệu Nhà sản xuất Cao Linh chi giàu triterpenoid Viện Kiểm Nghiệm Thuốc (CLT) TP Hồ Chí Minh Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Xuất xứ Việt Nam Acid ganoderic A Tween 80 Merck Đức Labrasol Gattefossé Pháp Labrafil M 1944 CS Gattefossé Pháp Labrafac PG Gattefossé Pháp Lauroglycol 90 Gattefossé Pháp Peceol Gattefossé Pháp Gattefossé Pháp Propylene glycol monocaprylate (PGM) TP Hồ Chí Minh Việt Nam 10 Polyethyleneglycol 400 Croda Việt Nam 11 Glycerol Croda Việt Nam 12 Propylenglycol Croda Việt Nam Tường An Việt Nam BASF Đức 14 15 Dầu thực vật (nành, dừa, olive, mè, gấc) Kolliphor RH40 Các dung mơi sử dụng trình bày Bảng 2.2 17 Bảng 2.2 Dung môi sử dụng nghiên cứu Dung môi Nhà sản xuất Xuất xứ Tiêu chuẩn Acetonitril Merck Đức HPLC Acid acetic Merck Đức HPLC Acid phosphoric Merck Đức HPLC Ethanol Merck Đức HPLC Methanol Merck Đức HPLC 2.1.2 Thiết bị Các thiết bị sử dụng trình bày Bảng 2.3 18 Bảng 2.3 Thiết bị sử dụng nghiên cứu Thiết bị Nhà sản xuất Máy khuấy từ CB162 Stuart Đức Cân kĩ thuật TE412 Sartorius Đức Cân phân tích ALS 220-4N Kern Đức Cân sấy ẩm hồng ngoại MX-50 A&D Nhật Bản Máy ly tâm DSC-101SD Digisystem Đài Loan Bể siêu âm Sonorex Đức Tủ sấy ULM Memmert Đức Hệ thống cô quay chân khơng Buchi Buchi Rotavapor® R-300 Xuất xứ Thụy Sĩ Hệ thống chiết xuất CO2 siêu tới Applied hạn Spe-ed SFE Separations Máy vortex WiseMix Daihan Kính hiển vi CH20BIMF200 Olympus Máy đo pH CyberScan Eutech Shimadzu Prominece-i LC 2030C Shimadzu Nhật Máy đo độ nhớt DV1 Brookfield Hoa Kỳ Máy đo kích thước hạt zeta Zetasizer Nano-ZS ZEN 3600 Malvern Hoa Kỳ Hàn Quốc Nhật Singapore Anh 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Nghiên cứu tính tan cao Linh chi giàu triterpenoid dung môi tá dược Cân xác khoảng 5,0 g tá dược dung môi khảo sát vào lọ thủy tinh Hòa tan lượng xác định cao Linh chi giàu triterpenoid (CLT) vào tá dược 19 máy khuấy từ với tốc độ 500 vòng/phút nhiệt độ phòng đến đạt ngưỡng nồng độ bão hòa Thời gian khảo sát kéo dài 24 Tính lượng CLT hịa tan tá dược dung mơi cách tính tổng lượng CLT thêm vào trước đạt điểm bão hòa Thực lần, tính tốn giá trị trung bình Ngồi ra, q trình khảo sát tính tan, khảo sát thêm khả phân tán CLT vào tá dược 2.2.2 Điều chế cao PEG Linh chi giàu triterpenoid 2.2.2.1 Xác định tỷ lệ PEG 400 phù hợp Chuẩn bị chén sứ chứa lượng dịch chiết tương đương với 0,3 g cắn Cho vào chén sứ lượng PEG 400 so với lượng cắn theo tỷ lệ 75%, 100%, 125% 150% Làm khô chén sứ nhiệt độ 40 oC tủ sấy chân không đến khối lượng không đổi để bay hết dung môi Quan sát ghi nhận thể chất cao để lựa chọn tỷ lệ PEG 400 phù hợp 2.2.2.2 Điều chế đánh giá cao PEG Linh chi giàu triterpenoid (CPLT) Thiết bị: Hệ thống cô quay chân không Buchi Rotavaporđ R-300 Thụng s thit b: ã Nhit sinh hàn: oC • Nhiệt độ bể: 40 oC • Tốc độ quay: 50 vòng/phút • Áp suất: 90 mbar (30 phút)  50 mbar (60 phút) • Thời gian: 90 phút Quy trình điều chế: Cho dịch chiết vào hệ thống cô quay, điều chỉnh thông số thiết bị phù hợp Khi dung môi gần bay hết, cho vào bình quay lượng PEG 400 tương ứng tỷ lệ lựa chọn CLT bình tiếp tục cô quay đến thu cao PEG Linh chi chất độ ẩm phù hợp (