BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HOÀNG KHÁNH LINH Ầ NGHIÊN CỨ C Ố Y ỌC CỦ C Y ƯỚ C DỤ RỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult.) LUẬ VĂ ẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ C Í MI , ĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỒNG KHÁNH LINH NGHIÊN CỨ Ầ A ỌC ƯỚ C DỤ C Ố Y CỦ C Y ỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult.) LUẬ VĂ ẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, ĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HỒNG KHÁNH LINH NGHIÊN CỨ Ầ ỌC ƯỚ C DỤ C Ố Y CỦ C Y ỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult.) NGÀNH: DƯỢC LIỆU – DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 8720206 LUẬ VĂ ƯỜI ẠC SĨ DƯỢC HỌC ƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VÕ VĂN LẸO THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, ĂM 2022 LỜI C M Đ Tôi xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu kết luận văn trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình nghiên cứu khoa học Tác giả luận văn Nguyễn Hoàng Khánh Linh LUẬ VĂ TÓM TẮT ẠC SĨ DƯỢC HỌC KHÓA 2019 – 2021 Chuyên ngành: Dƣợc học cổ truyền, mã số: 8720206 ên đề tài: Nghiên cứu t n p ần o ọ ớn t ụn n o o (Vitis heyneana Roem & Schult.) Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Võ Văn Lẹo Học viên thực hiện: Nguyễn Hoàng Khánh Linh ủ Nho rừng Mở đầu Cây Nho rừng (hay gọi Nho lơng, Nho năm góc, Nho ngũ giác, Nho tía), tên khoa học Vitis heyneana Roem & Schult., họ Nho Vitaceae Trong dân gian, rễ Nho rừng dùng trị viêm phế quản; làm thuốc lợi tiểu phối hợp với rễ dứa hãm sắc uống trị bệnh lậu Tuy nhiên cịn nghiên cứu phần mặt đất loài Việt Nam Đề tài tiến hành phân lập thành phần hóa học có thân Vitis heyneana Roem & Schult hƣớng tác dụng chống oxy hóa nhằm cung cấp thêm thơng tin để ứng dụng lồi làm thuốc Đ i t ợng nghiên cứu: Thân Nho rừng (Vitis heyneana Roem & Schult.) thu hái Vĩnh Phúc (12/2019) n p p n iên ứu: Định danh, lựa chọn nguyên liệu, khảo sát đặc điểm thực vật, kiểm tra độ tinh khiết; Khảo sát hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa (mơ hình DPPH) Phân lập, tinh chế, định danh đánh giá hoạt tính chống oxy hóa chất tinh khiết Kết Xác định nguyên liệu: Định danh nguyên liệu xác Nho rừng Đánh giá tác dụng sinh học: Từ 7kg thân Nho rừng, chiết ngấm kiệt thu đƣợc 903,5 g cao cồn, tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng thu đƣợc 48,6g phân đoạn PE, 25,7g phân đoạn CHCl3, 78,7g phân đoạn EtOAc Qua thử nghiệm, phân đoạn EtOAc có IC50 thấp nên (40,42 µg/ mL) nên hoạt tính dập tắt gốc tự DPPH cao Từ đó, phân đoạn EtOAc đƣợc lựa chọn để làm đối tƣợng phân lập hợp chất Từ 3kg Nho rừng, chiết ngấm kiệt thu đƣợc 154 g cao cồn, tiến hành chiết phân bố lỏng – lỏng thu đƣợc 42 g phân đoạn PE, 15 g phân đoạn CHCl3, 12 g phân đoạn EtOAc Qua thử nghiệm, phân đoạn EtOAc có IC50 thấp nên (37,02 µg/ mL) nên hoạt tính dập tắt gốc tự DPPH cao Từ đó, phân đoạn EtOAc đƣợc lựa chọn để làm đối tƣợng phân lập hợp chất Phân lập xác định cấu trúc: Từ 15g phân đoạn EtOAc thân qua sắc ký cột nhanh kết hợp kết tinh phân đoạn thu đƣợc kết tinh Thông qua kỹ thuật phổ định danh đƣợc chất: VH3 (201 mg) – trans-resveratrol, VH4 (95mg) - hopeaphenol VH5 (55 mg) - spinasterol Từ 9g phân đoạn EtOAc qua sắc ký cột nhanh kết hợp kết tinh phân đoạn thu đƣợc kết tinh Thông qua kỹ thuật phổ định danh đƣợc chất: VH6 (28 mg) - Daucosterol VH7 (10 mg) - Apigenin Thử tác dụng sinh học: Trans-resveratrol 18,792 (µg/ mL), hopeaphenol 395,37 (µg/ mL) so với trolox 8,862 (µg/ mL) Đối với spinasterol, tác dụng nên không xác định IC50 Bàn luận: cần tiếp tục thử nghiệm tác dụng sinh học chất tinh khiết phân lập chất từ phân đoạn giàu tiềm SUMMARY THESIS OF MASTER PHARMACY – Course 2019 - 2021 Major: Traditional Pharmacy, code: 8720206 STUDY OF ANTIOXIDANTS OF CHEMICAL COMPOSITION OF Vitis heyneana Roem & Schult Instructor: Vo Van Leo, Dr Student: Nguyễn Hoàng Khánh Linh Introduction: Vitis heyneana Roem & Schult., Vitaceae is known as Wild grape in Vietnam Following the folk, the root can use for asthma, use as a diuretic drug, or boil and extract with pineapple root to cure gonorrhea However, there is still a lack of research about the on-earth part of this plant in Vietnam nowadays The study of antioxidants of chemical composition of Vitis heyneana Roem & Schult provide additional information to be able to use this herbal as medicine Materials: Stem and leaves of Vitis heyneana Roem & Schult was collected in Vinh Phuc (12/2019) Methods: Extraction, separation, isolation, and purification were done; Structure elucidation was based on NMR and MS spectrometric methods In vitro screening of fractions, isolated compounds for antioxidant effects (DPPH) Isolation, purification, identification and evaluation of antioxidant activity of pure substances Results: Bio-assay screening: 7kg of Vitis heyneana Roem & Schult stem powder was extracted with 96% to produce 903,5g ethanol extract which was successively portioned with solvent to obtain 49,6g PE, 25,7g CHCl3, 78,7g EtOAc EtOAc has a low IC50 (40,42 µg/ mL) which can highly quench DDPH free radicals Therefrom, EtOAc is chosen to be isolated From 3kg of Vitis heyneana Roem & Schult leaves powder was extracted with 96% to produce 154g ethanol extract which was successively portioned with solvent to obtain 42 g PE, 15 g CHCl3, and 12 g EtOAc EtOAc has a low IC50 (40,42 µg/ mL) which can highly quench DDPH free radicals Therefrom, EtOAc is chosen to be isolated Chemical composition: From 15g EtOAc of stem extract was separated by flash-column and fractional crystallization to obtain crystallines By the spectrometric method, VH3 (201 mg) – trans-resveratrol, VH4 (95mg) – hopeaphenol, and VH5 (55 mg) – Spinasterol was isolated From 9g EtOAc of leaves extract was separated by flash-column and fractional crystallization to obtain crystallines By the spectrometric method, VH6 (28 mg) - Daucosterol and VH7 (10 mg) Apigenin Bio-assay testing: Trans-resveratrol has IC50 = 18,792 (µg/ml), hopeaphenol is 395,37 (µg/ml) and trolox is 8,862 (µg/ml) Spinasterol has very little effect so IC50 is not necessary Conclusion: Further studies about the effect of constituents from Vitis heyneana Roem & Schult has to be conducted i MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH iv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC 14 1.4 MỘT SỐ CÔNG DỤNG CỦA NHO RỪNG 25 1.5 CÁC PHƢƠNG PHÁP SÀNG LỌC KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA 26 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 30 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 3.1 KHẢO SÁT THỰC VẬT HỌC VÀ VI HỌC 35 3.2 KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC 39 3.3 BÀN LUẬN 79 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 81 KẾT LUẬN 81 ĐỀ NGHỊ 82 TÀI LIỆU THAM KHẢO 83 PHỤ LỤC 89 PHỤ LỤC 92 ii DANH MỤC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C ữ viết tắt Từ nguyên AO 3-O--D-glucopyranosyl-(14)--D glucuronopyranosyl-oleanolic acid 28-O-D-glucopyranosyl ester BT Bài thuốc hỗ trợ điều trị thối hóa cột sống Lƣơng y Nguyễn Thiện Chung BVTV Bảo vệ thực vật BuOH n-Butanol CK Cao khô phun sấy CL Cao lỏng DAD Diode Array Detector DĐVN Dƣợc điển Việt Nam ĐL Đinh lăng EtOAc Ethyl acetat E.A Phân đoạn ethyl acetat EtOH Ethanol HPLC High performance liquid chromatography MD Mía dị MeOH Methanol N Nhàu PĐ Phân đoạn RM Râu mèo SKLM Sắc ký lớp mỏng SPE Solid-phase extraction TCCS Tiêu chuẩn sở TLTK Tài liệu tham khảo TT Thuốc thử YHCT Y học cổ truyền WHO World Health Organization n tiếng Việt Đầu dò dãy diod quang Sắc ký lỏng hiệu cao Chiết pha rắn Tổ chức Y tế giới iii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Danh sách loài thuộc chi Vitis Việt Nam Bảng 1.2 Một số hợp chất stilbenoid phân lập từ loài thuộc chi Vitis Bảng 1.3 Một số hợp chất flavonoid từ loài V labrusca V.vinifera 10 Bảng 1.4 Các acid béo hàm lƣợng chúng dầu hạt nho 11 Bảng 1.5 So sánh thành phần hóa học rễ-thân-lá nho rừng 13 Bảng 1.6 Tác dụng kháng vi rút polyphenol có nguồn gốc từ V amurensis 22 Bảng 1.7 Một số tác dụng sinh học loài thuộc chi Vitis 25 Bảng 2.8 Cách pha mẫu đo phƣơng pháp DPPH 34 Bảng 3.9 Kết sơ thành phần hóa học Nho rừng 39 Bảng 3.10 Kết sơ thành phần hóa học thân Nho rừng 40 Bảng 3.11 Kết sắc ký cột pha thuận phân đoạn ethyl acetat cao Nho rừng 43 Bảng 3.12 Giá trị IC50 cao phân đoạn 42 Bảng 3.13 Kết sắc ký cột nhanh phân đoạn ethyl acetat cao Nho rừng 48 Bảng 3.14 Chƣơng trình sắc ký HPLC xác định độ tinh khiết hợp chất VH3 51 Bảng 3.15 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VH3 53 Bảng 3.16 So sánh phổ NMR hợp chất VH3 trans-resveratrol theo tài liệu tham khảo 54 Bảng 3.17 Chƣơng trình sắc ký HPLC xác định độ tinh khiết hợp chất VH4 55 Bảng 3.18 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VH4 58 Bảng 3.19 So sánh phổ NMR hợp chất VH4 hopeaphenol theo tài liệu tham khảo59 Bảng 3.20 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VH5 61 Bảng 3.21 Bảng so sánh liệu phổ VH5 Spinasterol 63 Bảng 3.22 Dữ liệu phổ NMR hợp chất VH6 66 Bảng 3.23 So sánh phổ NMR hợp chất VH6 theo tài liệu tham khảo 68 Bảng 3.24 Dữ liệu phổ MNR hợp chất VH7 69 Bảng 3.25 Bảng so sánh liệu phổ VH7 Apigenin 70 Bảng 3.26 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa chất đối chiếu trolox 71 Bảng 3.27 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao petroleum ether 72 Bảng 3.28 Thông số hoạt tính chống oxy hóa cao cloroform 72 Bảng 3.29 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao ethyl acetat 73 Bảng 3.30 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa hợp chất trans-resveratrol 74 Bảng 3.31 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa hợp chất hopeaphenol 75 Bảng 3.32 Thông số hoạt tính chống oxy hóa cao petroleum ether 75 Bảng 3.33 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao cloroform 76 Bảng 3.34 Thơng số hoạt tính chống oxy hóa cao ethyl acetat 77 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.) Hình 1.2 Cấu trúc hóa học số oligostilbenoid phân lập từ V heyneana 12 Hình 1.3 Cấu trúc số hợp chất nhóm triterpenoid 13 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học polyphenol V amurensis đƣợc nghiên cứu 23 Hình 2.5 Sơ đồ chuẩn bị mẫu nghiên cứu 33 Hình 3.6 Vi phẫu Nho rừng 35 Hình 3.7 Các thành phần vi phẫu Nho rừng 36 Hình 3.8 Vi phẩu thân Nho rừng 36 Hình 3.9 Các thành phần bột Nho rừng 37 Hình 3.10 Cấu tử bột thân Nho rừng 38 Hình 3.11 SKLM kiểm tra phân đoạn chiết phân bố cao Nho rừng 42 Hình 3.12 SKLM phân đoạn từ sắc ký cột pha thuận 43 Hình 3.13 SKLM phân đoạn rửa giải từ phân đoạn 44 Hình 3.14 SKLM chất VH1 - VH2 - VH3 45 Hình 3.18 Quy trình chiết xuất dƣợc liệu Nho rừng 47 Hình 3.15 SKLM phân đoạn từ sắc ký cột nhanh 48 Hình 3.16 SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH3 50 Hình 3.17 Sắc ký đồ HPLC hợp chất VH3 51 Hình 3.18 Phổ MS hợp chất VH3 52 Hình 3.19 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất VH3 phân lập 52 Hình 3.20 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) hợp chất VH3 phân lập 52 Hình 3.21 Một số tín hiệu tƣơng quan phổ NMR hợp chất VH3 54 Hình 3.22 Cơng thức cấu tạo VH3 (trans-resveratrol) 54 Hình 3.23 SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH4 55 Hình 3.24 Sắc ký đồ HPLC hợp chất VH4 56 Hình 3.25 Phổ MS hợp chất VH3 56 Hình 3.26 Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) hợp chất VH4 phân lập 57 Hình 3.27 Phổ 13C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) hợp chất VH4 phân lập 57 Hình 3.28 Một số tín hiệu tƣơng tác phổ NMR hợp chất VH4 59 v Hình 3.29 Cơng thức cấu tạo VH4 (hopeaphenol) 60 Hình 3.30 SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH5 60 Hình 3.31 Nhận định sơ cấu trúc VH5 62 Hình 3.32 Cấu trúc VH5 62 Hình 3.33 Một số tín hiệu tƣơng quan phổ HMBC hợp chất VH5 63 Hình 3.34 SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH6 64 Hình 3.35 SKLM khảo sát độ tinh khiết hợp chất VH7 69 Hình 3.36 Cấu trúc VH7 70 Hình 3.37 Một số tín hiệu tƣơng quan phổ HMBC VH7 70 Hình 3.38 Hoạt tính chống oxy hóa trolox 71 Hình 3.39 Hoạt tính chống oxy hóa cao petroleum ether 72 Hình 3.40 Hoạt tính chống oxy hóa cao cloroform 73 Hình 3.41 Hoạt tính chống oxy hóa cao ethyl acetat 73 Hình 3.42 Hoạt tính chống oxy hóa trans-resveratrol 74 Hình 3.43 Hoạt tính chống oxy hóa hopeaphenol 75 Hình 3.44 Hoạt tính chống oxy hóa cao petroleum ether 76 Hình 3.45 Hoạt tính chống oxy hóa cao cloroform 76 Hình 3.46 Hoạt tính chống oxy hóa cao ethyl acetat 77 Hình 3.47 HTCO chất chiết từ thân Nho rừng 78 ĐẶT VẤ ĐỀ Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới ẩm, gió mùa, có nguồn tài nguyên thực vật phong phú đa dạng, có nhiều lồi đƣợc sử dụng làm thuốc Việc sử dụng thuốc thực phẩm bảo vệ sức khỏe có nguồn gốc từ thực vật chủ yếu cịn dựa kinh nghiệm dân gian, chƣa có đầy đủ chứng khoa học để chứng minh tác dụng, chế tác dụng, tác dụng không mong muốn cỏ làm thuốc Trong đó, Nho rừng gần đƣợc nhiều ngƣời quan tâm Ở Việt Nam, loài nho cho khai thác Vitis vinifera cịn có nhiều lồi nho mọc hoang dại khác phân bố phổ biến khu vực miền núi phía bắc nhƣ Vitis labrusca L (Nho chồn), Vitis balansana Planch (nho đất, nho dại nhỏ quả), Vitis flexnosa Thunb (Nho dại, nho cong queo), Vitis heyneana Roem & Schult (Vitis pentagona Diels et Gilg) (Nho rừng, Nho lơng, Nho năm góc), Vitis retordii Rom Caill Ex Planch (Nho lông hoe), V retordii, V balansaeana (nho đất) Chúng đƣợc sử dụng nhiều y học cổ truyền với tác dụng chống viêm nhƣ thuốc cầm máu, tiêu sƣng, chống viêm, trị phong thấp, khớp xƣơng đau nhức, viêm gan vàng da, mụn nhọt, viêm vú, viêm khớp, tác dụng chống oxy hóa [1] Cây Nho rừng (hay cịn gọi nho lơng, nho năm góc, nho ngũ giác, nho tía), tên khoa học Vitis heyneana Roem & Schult., họ Nho Vitaceae [1, 2].Trong dân gian, rễ Nho rừng dùng trị viêm phế quản; làm thuốc lợi tiểu phối hợp với rễ dứa hãm sắc uống trị bệnh lậu Vỏ rễ đƣợc dùng trị kinh nguyệt không bạch đới, dùng điều trị chứng sƣng , đau chấn thƣơng, gân cốt tê đau; toàn dùng trị bệnh sởi; dùng trị bệnh lỵ, mụn nhọt sƣng lở; số tác dụng khác [1] Hiện nay, nghiên cứu thành phần hóa học lồi Vitis heyneana Roem & Schult Việt Nam cịn Trong dân gian hay sử dụng phần dƣới mặt đất để làm thuốc nên đề tài muốn nghiên cứu riêng phần mặt đất để góp phần phong phú lồi nho Chính vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học hƣớng tác dụng chống oxy hóa phần mặt đất Nho rừng” đƣợc thực với mục tiêu nhƣ sau: - Thử tác dụng chống oxy hóa in vitro phƣơng pháp đánh bắt gốc tự DPPH cao phân đoạn chiết từ phần mặt đất Nho rừng - Phân lập xác định cấu trúc hoạt chất từ cao có tác dụng chống oxy hóa mạnh thơng qua sàng lọc mơ hình DPPH - Thử hoạt tính chống oxy hóa chất tinh khiết thu đƣợc sau phân lập, để phục vụ cho mục đích kiểm nghiệm thử nghiệm sinh học sau C ƯƠ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 THỰC VẬT HỌC 1.1.1 Vị trí phân loại Vị trí chi Vitis hệ thống phân loại thực vật Takhtajan (2009) [3]: Giới thực vật (Plantae) Ngành Hạt kín (Angiospermae) Lớp Hai mầm (Dicotyledones) Phân lớp Hoa Hồng (Rosidae) Bộ Nho (Vitales) Họ Nho (Vitaceae) Chi Nho (Vitis) Phân bố: Trên giới chi Vitis có khoảng 66 lồi, chủ yếu vùng ơn đới, mở rộng đến vùng cận nhiệt đới [4, 5, 6] Ở nƣớc ta chi có lồi [1, 2, 4] Danh sách loài thuộc chi Vitis Việt Nam đƣợc trình bày Bảng 1.1 Bảng 1.1 Danh sách loài thuộc chi Vitis Việt Nam STT Tên lồi ên t ơn t ờng Phân b Vitis vinifera L Nho Phú n, Khánh Hịa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Lâm Đồng, TP Hồ Chí Minh Vitis labrusca L Nho chồn Việt Nam Vitis balansana Planch Nho đất, nho dại nhỏ Thái Nguyên, Hà Nội, Hải Dƣơng,Hải Phịng, Ninh Bình, Quảng Trị,Huế, Đà Nẵng, Nha Trang, Khánh Hòa Vitis flexuosa Thunb Nho dại, nho cong queo Sơn La, Tây Ninh Vitis heyneana Roem & Schult Nho rừng, nho lơng, nho năm góc, nho tía, nho ngũ giác Lạng Sơn, Ninh Bình, Ninh Thuận Vitis retordii Roman du Caill Ex Nho lông hoe Hà Nam, Nam Định, Ninh Bình Planch 1.1.2 Đặ điểm hình thái thực vật chi Vitis Dây leo, thân gỗ, thƣờng đơn tính khác gốc, lƣỡng tính Có tua quấn, thƣờng chia làm đơi Lá đơn, chia thùy, xẻ chân vịt, kèm tiêu giảm Cụm hoa mọc chùm tụ tán, hoa cánh có đài hình đĩa, đài ngun Cánh hoa liền phía đỉnh tỏa nhƣ phễu Nhị hoa mọc đối diện với cánh hoa, không phát triển rụng sớm hoa Hoa nhụy, mảnh, đầu nhụy mở rộng Quả mọng hình cầu, có từ 2-4 hạt Hạt hình trứng hay elip hình lê, nội nhũ hình chữ M theo mặt cắt ngang [4] 1.1.3 Đặ điểm thực vật loài Nho rừng Cây nhỡ leo; cành màu đỏ, phủ lông nhện tựa bông, lông màu xám nâu, tua chia làm đôi đối diện với [4, 7] Cành hình trụ với đƣờng cong chạy dọc, có lông màu xám nâu, tua chia làm đôi [7] Lá đơn; kèm màu nâu hình trứng hay hình mác dài 3-5mm, rộng 2-3mm, đỉnh nhọn tù; cuống dài 2,5-6 cm với lớp lông tơ dày đặc; phiến chia thùy dài 4-12 cm, rộng 3-8 cm, lớp lông tơ xám nâu thƣa dần, lơng gân xa trục đơi có lông, gần trục với lớp lông tơ thƣa thớt cịn non sau khơng có lơng, gân xa trục nhẵn đơi có vài lơng tơ, gân có từ 3-5, gân bên có 4-6 cặp, hình tim đến gần hình tim, khe tù sắc nhọn, mép từ 9-19 cƣa bên, sắc nhọn Cụm đối dài 4-14 cm, phân nhánh phát triển; cuống dài 1-2 cm với lông màu xám nâu Cuống nhỏ 1-3 mm, nhẵn Nụ hình trứng elip, 1,5-2 cm, đỉnh tròn [7] Đài hoa 0,1mm Chỉ nhị hình sợi, 1-1,2 mm, bao phấn màu vàng hình elip; nhụy hoa bầu dục, ngắn Quả mọng, màu tím đen chín, hình cầu đƣờng kính 1-1,3 cm [7] Hạt 2-4 [4], hình trứng, đỉnh trịn, rốn có lỗ hƣớng lên [7] Sinh thái: rừng, bụi, sƣờn đồi, thung lũng [7], hoa tháng 5-6, có tháng 10-11 [4] Phân bố: Lạng Sơn, Ninh Bình vào Bình Thuận; cịn có Trung Quốc, Lào, Campuchia [4] Hình 1.1 Đặc điểm hình thái Nho rừng (Vitis heyneana Roem.& Schult.) [8] Chú thích: a Cành mang lá, cụm quả; b Thân già; c Thân non; d Tua cuốn; e Lá; f Gốc lá; g Ngọn lá; h Cụm quả; i Quả; j Quả cắt ngang; k Hạt (mặt bụng); l Hạt (mặt lƣng); m Hạt cắt ngang; n Hạt cắt dọc 1.2 THÀNH PHẦN HĨA HỌC 1.2.1 Thành phần hóa học chi Vitis Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu thành phần hóa học loài thuộc chi Vitis Các kết nghiên cứu chủ yếu tập trung V vinifera, V amurensis V balansana cho thấy chúng có chứa hợp chất thuộc nhóm stilbenoid, flavonoid, tanin, polysaccharid, acid amin steroid 1.2.1.1 Nhóm chất stilbenoid Stilbenoid nhóm hợp chất đặc trƣng chi Vitis nói riêng họ Vitaceae nói chung Đã có khoảng 100 stilbenoid dạng monomer, dimer oligomer đƣợc tìm thấy từ lồi Vitis [9] Từ cao chiết ethanol thân V amurensis phân lập xác định đƣợc oligostilbenoid (r-2-viniferin (1), trans-amurensin B (2), trans-ε-viniferin (3), gnetin H (4), amurensin G (5), (+)-ampelopsin A (6)) stilbenoid (transresveratrol (7), (+)-ampelopsin F (8), piceatannol (9), trans-piceid (10)) [10] Năm 1998, tác giả Piere Waffo Teguo cộng phân lập từ phân đoạn ethyl acetat loài V vinifera hợp chất stilbenoid gồm (E)-astringin (11), (E)resvertrolosid (12), (E)-piceid (13), piceatannol (9), (E)-resveratrol (14), (Z)astringin (15), (Z)-resvertrolosid (16), (Z)-piceid (17), (Z)-resveratrol (18) [11] Năm 2011, từ cao chiết ethanol phần mặt đất V thunbergii phân lập đƣợc stilbenoid gồm trans-resveratrol (7), (+)-ε-viniferin (19), ampelopsin C (20), ampelopsin A (6), (-)-vitisin B (21), (+)-vitisin A (22) Năm 2013, Sylvain Schnee cộng phân lập đƣợc oligostilbenoid cao chiết methanol V vinifera, chúng gồm ampelopsin A (6), hopeaphenol (23), ampelopsin H (24), ε-viniferin (25), E-vitisin B) (26) [12] Bảng 1.2 Một số hợp chất stilbenoid phân lập từ loài thuộc chi Vitis STT Tên chất CTCT Loài/Bộ phận dùng TLTK [11, 14, 15, 16] (E)-Piceid (13) V vinifera (lá, thân, quả) V amurensis (lá, thân) V larbusca (quả) [11, 15] (Z)-Piceid (17) V vinifera (lá, thân, quả) V larbusca (quả) V heyneana (thân) [10, 11, 17] Piceatannol (9) V vinifera (lá, thân, quả) V amurensis (lá, thân) trans- Resveratrol (7) V vinifera (lá, thân, quả) V amurensis (lá, thân) V thunbergii (lá, thân) V larbusca (lá, thân, quả) V heyneana (thân) [10, 11, 14, 15, 16, 17, 18] [11, 14, 15] (Z)-Resveratrol (18) V vinifera (lá, thân, quả) V larbusca (quả) [17, 18, 19, 20, 21] (+)-Ampelopsin A (6) V thunbergii (rễ, thân) V amurensis (lá, thân, rễ) V vinifera (thân) V heyneana (thân) [10, 21] (+)-Ampelopsin F (8) V amurensis (lá, thân) V thunbergii (lá, thân) [18, 22] Amurensin H (27) V amurensis (rễ) V vinifera (thân) [18] (+)-(E)-ε-Viniferin (28) V vinifera (lá, thân) V heyneana (thân) [12, 16, 24] 10 Hopeaphenol (23) V vinifera (thân) V amurensis (rễ) [21] 11 (+)-Viniferol A (29) V vinifera (thân) [10] 13 r-2-Viniferin (1) V amurensis (lá, thân) [12] 14 (E)-Vitisin B (26) V vinifera (thân) 10 1.2.1.2 Nhóm chất flavonoid phenol khác Năm 1999, Yinrong Lu cộng phân lập xác định đƣợc 16 hợp chất từ bã nho xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập đƣợc dựa theo phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân (NMR), phổ MS ….Chúng gồm hợp chất thuộc nhóm acid phenolic (acid gallic (30), acid 4-O-glucosid gallic (31), acid 3-O-glucosid gallic (32), trans-acid caftaric (33), trans- acid coutaric (34), cis-acid coutaric (35)), hợp chất dẫn xuất hydroxy phenol (2hydroxy-5-(2-hydroxy-ethyl) phenylglucosid (36)) hợp chất thuộc nhóm flavonoid (catechin (37), epicatechin (38), procyanidin B1 (39), quercetin 3-Oglycosid (40), quercetin 3-O-glucuronid (41), kaempferol 3-O-glycosid (42), kaempferol 3-O-galactosid (43), astilbin (44), engeletin (45) [25] Một nghiên cứu khác Ismael Ivan Rockenbach cộng bột hạt vỏ loài V vinifera V labrusca cho thấy hàm lƣợng phenol hạt cao vỏ (2128-16518mg catechin/100g hạt 660-1839mg catechin /100g vỏ) Nghiên cứu cho thấy cao chiết từ hạt nho có tổng hàm lƣợng polyphenol cao vỏ, đặc biệt oligome polyme flavanol [26] Năm 2008, Zhenchang Liang cộng tiến hành phân tích 110 mẫu vỏ nho phƣơng pháp LC-MS Kết phát 29/33 pic hợp chất anthocyanin Tất anthocyanin dẫn xuất monoglucosid diglucosid anthocyanin (delphinidin, cyanidin, petunidin, peonidin malvidin) nhƣ delphinidin-3-O-glucosid (46), cyanidin-3-O-glucosid (47), peonidin-3-O-glucosid (48), malvidin-3-O-glucosid (49 …[28] Bảng 1.3 Một số hợp chất flavonoid từ loài V labrusca V.vinifera STT Tên chất Catechin (37) CTCT Loài TLTK V labrusca, V vinifera [28] 11 Quercetin (50) V labrusca, V vinifera [28] Rutin (51) V labrusca, V vinifera [28] Kaempferol (52) V labrusca, V vinifera [28] 1.2.1.3 Sterol Các nhà nghiên cứu chọn giống nho đỏ nhiều vùng, sau tách lấy hạt nho điều chế dầu hạt nho Nghiên cứu xác định đƣợc hàm lƣợng nhƣ loại acid béo sterol hạt nho (xem Bảng 1.4) [29] Bảng 1.4 Các acid béo hàm lƣợng chúng dầu hạt nho m l ợn (%) Acid béo Acid béo m l ợn (%) Myristic ≤ 0,1 % Linoleic 58-77 % Palmitic 5-10 % Linolenic ≤1% Stearic 3-5 % Arachidic ≤ 0,1 % Oleic 12-26 % Các sterol bao gồm 15 chất: cholesterol (53), brassicasterol (54), 24-methylen cholesterol (55), campesterol (56), campestanol (57), stigmasterol (58),∆7- campesterol (59), ∆5,23-stigmastadienol (60), clerosterol (61), β-sitosterol (62), sitostanol (63), ∆5-avenasterol (64), ∆5,24-stigmastadienol (65), ∆7-stigmasterol (66) ∆7-avenasterol (67) [29] 12 Các thành phần khác Nghiên cứu Sónia O Prozil cộng xác định đƣợc polysaccharid thân V vinifera chủ yếu cellulose, heteroxylan glucan, cellulose chiếm 30,3%, heteroxylan chiếm 12% glucan chiếm khoảng 15% Các loại đƣờng có nho monosaccharid (rhamnose, arabinose, xylose, mannose, galactose, glucose) [30] Nhóm nghiên cứu xác định đƣợc hàm lƣợng protein bã nho chiếm khoảng 6,1-13% [30] 1.2.2 Thành phần hóa học lồi Nho rừng Hiện nay, giới có số nghiên cứu loài V heyneana Roem & Schult Một số hợp chất đƣợc phân lập từ loài chủ yếu thuộc nhóm stilbenoid, acid phenol terpenoid [16, 31] 1.2.2.1 Nhóm chất stilbenoid Năm 1996, Li W W cộng phân lập đƣợc oligomer từ thân V heyneana heyneanol A (68), ampelopsin C (20), amelopsin A (6) (+)-εviniferin (19) [31] Năm 2013, từ rễ V heyneana, Yue L cộng phân lập đƣợc monomer (vitisinol A (69), (E)-piceid (13) hopeaphenol (23) Hình 1.2 Cấu trúc hóa học số oligostilbenoid phân lập từ V heyneana 13 1.2.2.2 Nhóm chất megastigman glycosid Năm 2012, từ cao chiết aceton 70% V heyneana, Hai-Jian Cong cộng phân lập đƣợc megastigman glucosid có megastigman glucosid (3S,5R,6R,9R)-megastigman-3, 5, 6, 9-tetrol 9-O- β-ᴅglucopyranosid (70) megastigman glucosid actinidioionsid (71), (6S,9R)roseosid (72), icarisid B5 (73) icarisid B1 (74) [32] 1.2.2.3 Một số thành phần khác Năm 2013, Yue Li cộng phân lập đƣợc hợp chất từ rễ V heyneana, bao gồm β-sitosterol (62), aviculin (86), acid betulinic (87), benzyl O-β-Dapiofuranosyl-(1→2-β-D-glucopyranosid (88) methyl rosmarinat (89) [16] Từ cao chiết V heyneana, Hai-Jian Cong cộng phân lập xác định đƣợc cycloartan nortriterpenoid 25,26,27-trinor-3β, 24-dihydroxycycloartan (90) cycloartan triterpenoid cycloart-23-en-3β, 25-diol (91) [32] 25,26,27-trinor-3β, 24dihydroxycycloartan cycloart-23-en-3β, 25-diol Hình 1.3 Cấu trúc số hợp chất nhóm triterpenoid Bảng 1.5 So sánh thành phần hóa học rễ-thân-lá nho rừng BỘ Ậ IÊ CỨ THÀNH Ầ ỌC Ễ ợp ất β-sitosterol (62), aviculin (86), acid betulinic (87), benzyl O-βD-apiofuranosyl-(1→2 -βD glucopyranosid (88) methyl rosmarinat (89) Stilbenoid THÂN LÁ Stilbenoid: - Triterpenoid Heyneanol A (68), - Stilbenoid ampelopsin C (20), - ợp ất amelopsin A (6) Megastigman (+)-ε- viniferin (19) glucosid Polysaccharid 14 1.3 TÁC DỤNG SINH HỌC Hiện nghiên cứu dƣợc lý chủ yếu lồi V vinifera, số nghiên cứu tiến hành loài V amurensis V thunbergii 1.3.1 Tác dụng ch ng viêm Kết nghiên cứu Min-Ji Bak cộng cho thấy procyanidin từ hạt lồi V amurensis có tác dụng chống viêm mạnh thơng qua ức chế iNOS COX-2 cách điều khiển đƣờng truyền tín hiệu NFκB p38 MAPK [33] Năm 2005, Greenspan P cộng tiến hành thí nghiệm cho chuột ăn phần ăn chứa 5% vỏ nho V rotundifolia 14 ngày, sau tiêm carrageenan vào chân chuột đo thể tích bàn chân chuột sau 3h Kết cho thấy chuột có chế độ ăn vỏ nho hàng ngày bị phù nề khoảng 50% so với chuột không ăn, điều chứng tỏ vỏ nho có tác dụng kháng viêm in vivo Nghiên cứu năm 2011 KunTeng Wang cộng tác dụng ức chế giải phóng IL-1β PGE2 gây LPS cao chiết methanol từ thân lồi V thunbergii có tác dụng ức chế tốt phận khác (cành, rễ) lần lƣợt 71,29 ± 7,08% 22,50 ± 6,20% không gây độc Tác dụng ức chế PGE2 resveratrol ampelopsin C phân lập từ phần thân loài V thunbergii cho kết ức chế cao với giá trị IC50 lần lƣợt 73,32 ± 1,74 15,52 ± 2,69 µM Mặt khác resveratrol ức chế hoạt động COX-2 đáng kể với IC50 = 27,01 ± 1,11µM [34] Nghiên cứu Bakhta Aouey cộng năm 2016 cho thấy cao chiết thủy phân V vinifera với liều 100, 200 400 mg/kg làm giảm đáng kể thể tích phù bàn chân chuột lần lƣợt 34,48% (p