NGUYỄN HUỲNH HUỲNH KIM KIM KHÓA KHÓA2019 2019– –2021 2021 - NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM BÀO NGUYỄN - NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀVÀ BÀO CHẾCHẾ THUỐC BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HUỲNH KIM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN 4VH4 PHÂN LẬP TỪ ĐỊA Y LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGUYỄN HUỲNH KIM NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN 4VH4 PHÂN LẬP TỪ ĐỊA Y NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS NGUYỄN TÚ ANH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2022 TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y Học viên: Nguyễn Huỳnh Kim Giảng viên hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Tú Anh Đặt vấn đề mục tiêu nghiên cứu: Tình hình đề kháng kháng sinh giới nói chung Việt Nam nói riêng trở thành vấn đề đáng quan ngại điều trị bệnh lý nhiễm khuẩn Trong nỗ lực tìm kiếm kháng sinh việc phân lập loài xạ khuẩn từ vùng sinh thái khác chiến lược nhiều nhóm nghiên cứu thực Hệ cộng sinh địa y nguồn sinh thái thu nhận mẫu nghiên cứu năm gần Xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y đánh giá cụ thể hoạt tính kháng vi sinh vật Trong nghiên cứu này, tiến hành: (i) Xác định đặc điểm sinh học định danh chủng xạ khuẩn 4VH4; (ii) Khảo sát điều kiện ni cấy quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ dịch ni cấy có hoạt tính kháng vi sinh vật; (iii) Khảo sát hoạt tính cao toàn phần cao phân đoạn từ dịch chiết môi trường lên men xạ khuẩn 4VH4 Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y Dirinaria applanata Xạ khuẩn 4VH4 xác định đặc điểm sinh học gồm đặc điểm hình thái, khả sinh enzym, khả sử dụng đường Xạ khuẩn 4VH4 định danh kết hợp đặc điểm sinh học phương pháp sinh học phân tử giải trình tự gen 16S rADN Tiếp theo, khảo sát mơi trường lên men xạ khuẩn, đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch Dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 chiết dung mơi thích hợp, tiến hành sắc ký cột thu cao phân đoạn; xác định phân đoạn có hoạt tính phương pháp đĩa giấy khuếch tán kỹ thuật hình sinh học Phân tích LC – MS cao tồn phần cao phân đoạn có hoạt tính thu từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 dự đoán hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) cao toàn phần cao phân đoạn xác định phương pháp vi pha loãng phiến nhựa 96 giếng Kết quả: Mô tả đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn bao gồm màu sắc khuẩn ty chất (vàng), màu sắc khuẩn ty khí sinh (trắng) sinh sắc tố môi trường ISP2, ISP4, ISP5, MYA, SC Xạ khuẩn 4VH4 có khả sinh enzym: catalase, urease, cellulase lipase Trình tự gen 16S rADN xạ khuẩn 4VH4 tương đồng 100% với loài Streptomyces albus Kết hợp với đặc điểm sinh học, xác định xạ khuẩn 4VH4 thuộc lồi Streptomyces albus Mơi trường lên men xạ khuẩn thu chất kháng vi sinh vật môi trường ISP2 cải tiến với nồng độ thành phần carbohydrat g/l glucose, g/l chiết xuất mạch nha, thành phần nitơ g/l chiết xuất nấm men pH Thu cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 phân đoạn F6 cao chiết DCM có hoạt tính kháng khuẩn Bằng phương pháp LC-MS, phân đoạn F6 chứa hợp chất kháng khuẩn dự đốn có cơng thức phân tử C25H22N4O8 C22H14N14O2 với khối lượng phân tử 506,15 Da MIC cao toàn phần DCM Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, MRSA, MSSA µg/ml, µg/ml, 64 µg/ml, 32 µg/ml MIC phân đoạn F6 K. pneumoniae, E coli, MRSA, MSSA 0,25 µg/ml, µg/ml, µg/ml, µg/ml Đặc biệt MIC phân đoạn F6 K pneumoniae 0,25 µg/ml, tương đương gentamicin Kết luận kiến nghị: Xạ khuẩn 4VH4 thuộc lồi S albus có hoạt tính kháng khuẩn tốt vi khuẩn gram âm, đặc biệt K pneumoniae Môi trường ISP2 cải tiến phù hợp để lên men thu kháng sinh Để xác định hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, cần tinh khiết hóa xác định cấu trúc phổ NMR Với phân đoạn khác, khảo sát thêm số hoạt tính sinh học Ngồi ra, cần tìm kiếm nhóm gen chịu trách nhiệm sinh tổng hợp hợp chất polyketid nonribosomal peptid chất thường tìm thấy xạ khuẩn có nhiều hoạt tính ABSTRACT THESIS OF MASTER OF PHARMACY Study on antimicrobial activity of actinomycete strain 4VH4 isolated from lichen Student: Nguyen Huynh Kim Instructor: Assoc Prof Dr Nguyen Tu Anh Introductions and research objectives: Antibiotic resistance is becoming a matter of concern in the treatment of infectious diseases in all parts of the world In the effort to discover new antibiotics, the isolation actinomycetes from different ecological regions is a strategy being implemented by many research groups Lichen symbiosis is one of the ecological sources of sample collection studied in recent years Actinomycete 4VH4 isolated from lichens was specifically evaluated for antimicrobial activity In this study, we conducted: (i) Biological characterization and identification of actinomycete strain 4VH4; (ii) Investigation of culture conditions and extraction procedure of fractions from cell-free supernatant with antimicrobial activity; (iii) Investigation of antimicrobial activity of total extract and fractions from cell-free supernatant of fermentation actinomycete 4VH4 Objective and research methods: Actinomycete 4VH4 isolated from lichen Dirinaria applanata Actinomycete 4VH4 were determined biological characteristics: morphological characteristics, enzyme production, and carbon utilization Actinomycete 4VH4 were identified by a combination of biological characteristics and molecular biology methods 16S rDNA gene sequencing The fermentation medium was investigated, and the antimicrobial activity was evaluated by the agar well diffusion method Fermentation cell-free supernatant of actinomycete 4VH4 was extracted with a suitable solvent, column chromatography was performed; disk diffusion method, and bioautography were used to identify the active fraction DCM extract and active fraction were analyzed by LC-MS and predicted antibacterial compounds Minimum inhibitory concentration (MIC) of total extract and fraction were determined by microdilution on 96-well plates Results: This study has described the biological characteristics of actinomycete strains including morphological characteristics include in the color of the substrate mycelium (yellow), the color of the aerial mycelium (white), and the production of pigment on the media ISP2, ISP4, ISP5, MYA, SC Investigating the ability to produce enzymes, actinomycete 4VH4 can produce enzymes: catalase, urease, cellulase, and lipase DNA extraction of Actinomycete 4VH4, 16S rDNA gene sequencing, and sequence analysis based on NCBI data bank 100% homology with Streptomyces albus species, combined with biological characteristics to identify actinomycete 4VH4 belonging to S albus species The determination of fermentation medium for actinomycete strains to obtain antimicrobial agents is the modified ISP2 medium with the concentration of carbohydrate components (3 g/l glucose, g/l malt extract), and nitrogen content (3 g/l yeast extract) and pH Total DCM extract from S albus 4VH4 and the F6 fraction had antibacterial activity By the LC-MS method, the F6 fraction containing the antibacterial compound is predicted with the molecular formula C 25H22N4O8 or C22H14N14O2 and molecular weight of 506.15 Da MIC of total DCM extract against Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, MRSA, and MSSA is µg/ml, µg/ml, 64 µg/ml, and 32 µg/ml, respectively MIC of the F6 fraction against K pneumoniae, E coli, MRSA and MSSA is 0.25 µg/ml, µg/ml, µg/ml and µg/ml, respectively Especially, the MIC of the F6 fraction against K. pneumoniae is 0.25 µg/ml, equivalent to gentamicin Conclusions and recommendations: Actinomycete 4VH4 belonging to S. albus species has good antibacterial activity against gram-negative bacteria, especially K. pneumoniae The modified ISP2 medium is suitable for antibiotic production Fraction F6 of total DCM extract could be purified and structurally determined of compounds with antimicrobial activity by NMR spectroscopy With other fractions, additional biological activities can be investigated In addition, it is necessary to search for a group of genes responsible for the biosynthesis of polyketide and nonribosomal peptides, which are commonly found in actinomycetes and have many biological activities LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành không chỉ bằng sự nỗ lực của bản thân mà còn từ sự hỗ trợ và giúp đỡ chân thành của thầy cô, gia đình và bạn bè Đây là khoảng thời gian vô cùng quí báu đối với Đầu tiên, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban giám hiệu, Phòng đào tạo Sau đại học Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh q Thầy Cơ Khoa Dược nói chung trang bị kiến thức tạo điều kiện cho tơi hồn thành khóa học Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô PGS TS Nguyễn Tú Anh đồng hành em q trình thực hồn thành nghiên cứu Sự hướng dẫn tận tình, chia sẻ định hướng, sự quan tâm giúp đỡ lời động viên của cô những lúc em gặp khó khăn trở thành động lực giúp em phấn đấu học tập nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn đến cô ThS Lê Thị Thanh Thảo, ThS Phan Cảnh Trình, ThS Hồ Lê Trúc Linh, TS Nguyễn Minh Thái, TS Vũ Thanh Thảo TS Nguyễn Vũ Giang Bắc lời khun góp ý chuyên môn thời gian em thực nghiên cứu Em xin gửi lời cảm ơn đến Anh/Chị Bộ môn Vi sinh Ký sinh giúp đỡ, tạo điều kiện để em hồn thành luận văn Cảm ơn bạn sinh viên Nhi, Hà, Duy, Diệu, Huy, Hậu, Linh giúp đỡ động viên suốt thời gian thực luận văn Bộ môn Vi sinh Ký sinh Cuối cùng, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ba mẹ, người đã nuôi dạy chăm sóc lo lắng và dõi theo từng bước của Sự động viên của ba mẹ là nguồn động lực giúp phấn đấu và làm tốt nhiệm vụ của mình luận văn này cũng cuộc sống.’ Nguyễn Huỳnh Kim LỜI CAM ĐOAN Tôi tên Nguyễn Huỳnh Kim, học viên khóa 2019 – 2021 Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh, chuyên ngành Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực Bộ môn Vi sinh Ký sinh hướng dẫn PGS TS Nguyễn Tú Anh Các số liệu, hình ảnh, kết nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm cam kết Tác giả luận văn Nguyễn Huỳnh Kim MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .i DANH MỤC BẢNG iii DANH MỤC HÌNH .iv MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Địa y .3 1.2 Xạ khuẩn 1.3 Nuôi cấy xạ khuẩn 15 1.4 Chiết xuất phân lập chất có hoạt tính sinh học 19 1.5 Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ 21 1.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 23 1.7 Tình hình nghiên cứu nước 27 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.1 Đối tượng nghiên cứu 29 2.2 Thiết bị hóa chất .30 2.3 Phương pháp nghiên cứu .32 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 42 3.1 Đặc điểm chủng xạ khuẩn 4VH4 42 3.2 Định danh chủng xạ khuẩn 4VH4 46 3.3 Khảo sát môi trường lên men chủng xạ khuẩn thu chất kháng vi sinh vật .49 3.4 Xác định hợp chất kháng vi sinh vật .53 CHƯƠNG BÀN LUẬN 64 4.1 Đặc điểm sinh học định danh chủng xạ khuẩn 4VH4 .64 4.2 Xác định môi trường lên men xạ khuẩn 4VH4 65 4.3 Hợp chất kháng khuẩn cao toàn phần DCM cao phân đoạn F6 từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 67 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 71 5.1 Kết luận 71 5.2 Đề nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ viết đầy đủ Tiếng việt ADN Acid deoxyribonucleic Acid deoxyribonucleic ARN Acid ribonucleic Acid ribonucleic ATCC American type culture collection Bộ sưu tập chủng APCI Atmospheric ionization API Atmospheric pressure ionization Ion hóa áp suất khí BHA Brain Heart Infusion Agar Môi trường BHA DCM Dichloromethan Dicloromethan EA Ethyl acetat Ethyl acetat ESI Electrospray ionization Ion hóa tia điện HR-ESI-MS High resolution – Electrospray Phép đo khối phổ ion hóa ionization – Mass spectrometry tia điện phân giải cao ISP International Streptomyces Project LC-MS Liquid chromatography – mass Sắc ký lỏng – khối phổ spectrometry MeOH Methanol Methanol MHA Muller Hinton Agar Môi trường Muller Hinton MHAG Muller Hinton Agar – Glucose MHA bổ sung glucose MIC Minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu pressure chemical Ion hóa hóa học áp suất khí Chương trình Streptomyces quốc tế MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus kháng methicillin MSSA Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus nhạy cảm methicillin MYA Malt extract – Yeast extract agar Môi trường chiết xuất mạch nha – nấm men RT Retention time Thời gian lưu SKLM Sắc ký lớp mỏng SC Starch casein Tinh bột – casein SDA Sabouraud Dextrose Agar Môi trường Sabouraud smBGCs Secondary Metabolite Biosynthetic Cụm gen sinh tổng hợp Gene Clusters chất chuyển hóa thứ cấp SSY Starch Succrose Yeast Tinh bột succrose nấm men TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn YIM 308 Yi Jiang medium 308 Môi trường Yi Jiang 308 YIM 310 Yi Jiang medium 310 Môi trường Yi Jiang 310 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số đặc điểm chi Actinomycetales 10 Bảng 1.2 Một số nhóm kháng sinh nguồn gốc từ Streptomyces spp .13 Bảng 1.3 Tác động nguồn carbon sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn 16 Bảng 1.4 Tác động nguồn nitơ sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn 17 Bảng 2.1 Thiết bị sử dụng nghiên cứu 30 Bảng 2.2 Hóa chất, dung môi sử dụng nghiên cứu 31 Bảng 2.3 Sắc ký với hệ gradient dung môi 39 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 4VH4 mơi trường nuôi cấy 42 Bảng 3.2 So sánh đặc điểm hình thái, sinh hóa chủng 4VH4 với S albus .48 Bảng 3.3 Đường kính vịng ức chế vi sinh vật thử nghiệm dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 môi trường khác 49 Bảng 3.4 Các phân đoạn sắc ký cột 56 Bảng 3.5 Một số chất có hoạt tính sinh học dự đốn có cao tồn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 chương trình Masshunter Qualitative Agilent 60 Bảng 4.1 So sánh MIC phân đoạn F6 cao chiết DCM streptonigrin 69 Bảng 4.2 So sánh m/z phân mảnh hợp chất dự đoán phân đoạn F6 cao chiết DCM streptonigrin sở liệu 69 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ba dạng tản địa y Hình 1.2 Vòng đời xạ khuẩn Hình 1.3 Bào tử dạng gai dạng nhẵn kính hiển vi điện tử Hình 1.4 Cấu trúc mang bào tử số xạ khuẩn .8 Hình 1.5 Hệ thống phân loại Actinobacteria theo Bergey Hình 1.6 Hình thái chuỗi bào tử 11 Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống LC-MS 22 Hình 1.8 Kỹ thuật hình sinh học tiếp xúc 25 Hình 1.9 Kỹ thuật hình sinh học trực tiếp .25 Hình 1.10 Kỹ thuật hình sinh học phủ thạch 26 Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 32 Hình 2.2 Xác định phân đoạn kháng vi sinh vật phương pháp hình sinh học 39 Hình 3.1 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP2 43 Hình 3.2 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP4 43 Hình 3.3 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP5 43 Hình 3.4 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường MYA 44 Hình 3.5 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường SC .44 Hình 3.6 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP2 kính hiển vi theo thời gian 45 Hình 3.7 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường với nguồn carbon khác 45 Hình 3.8 Khả sinh enzym xạ khuẩn 4VH4 46 Hình 3.9 Kết điện di gel agarose 1% ADN nhiễn sắc thể 47 Hình 3.10 Kết phân tích trình tự 16S rADN cơng cụ Blast NCBI 47 Hình 3.11 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ glucose khác 50 Hình 3.12 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ chiết xuất mạch nha khác 51 Hình 3.13 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ chiết xuất nấm men khác 52 Hình 3.14 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường ISP2 cải tiến có pH khác 52 Hình 3.15 Đường kính vịng ức chế K pneumpniae dịch nuôi cấy xạ khuẩn 4VH4 với môi trường ISP2 cải tiến theo thời gian 53 Hình 3.16 Khả ức chế K pneumoniae cao toàn phần từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 với dung môi khác 54 Hình 3.17 Xác định vết có hoạt tính kháng K. pneumoniae cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 kỹ thuật hình sinh học .55 Hình 3.18 Sơ đồ thu nhận phân đoạn F1-F6 từ cao chiết toàn phần DCM .56 Hình 3.19 Khả ức chế K pneumoniae phân đoạn thu từ cao chiết DCM 57 Hình 3.20 SKLM phân đoạn F6 triển khai với hệ dung môi EA-MeOH-H2O (100:17:13) quan sát UV 365 nm, UV 254 nm, ánh sáng khả kiến 58 Hình 3.21 Xác định vết có hoạt tính kháng K pneumoniae phân đoạn F6 cao chiết DCM kỹ thuật hình sinh học .58 Hình 3.22 Sắc ký đồ LC cao toàn phần DCM từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 59 Hình 3.23 Sắc ký đồ LC phân đoạn F6 cao chiết DCM 59 Hình 3.24 Phổ HR-ESI-MS hợp chất phân đoạn F6 cao chiết DCM 60 Hình 3.25 MIC cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 vi khuẩn thử nghiệm 62 Hình 3.26 MIC phân đoạn F6 cao chiết DCM vi khuẩn thử nghiệm .63 Hình 4.1 Phổ LC-MS-MS hợp chất dự đoán phân đoạn F6 cao chiết DCM 69 MỞ ĐẦU Tình hình đề kháng kháng sinh giới nói chung Việt Nam nói riêng trở thành vấn đề đáng quan ngại điều trị bệnh lý nhiễm khuẩn Năm 2019, ước tính có khoảng 700.000 bệnh nhân nhiễm khuẩn tử vong đề kháng kháng sinh số lên đến 10 triệu người vào năm 2050 Trước tình hình đó, nghiên cứu phát triển kháng sinh ln chủ đề nhà nghiên cứu quan tâm Khoảng 80% kháng sinh sử dụng có nguồn gốc từ xạ khuẩn Trong nỗ lực tìm kiếm kháng sinh việc phân lập lồi xạ khuẩn từ vùng sinh thái khác chiến lược nhiều nhóm nghiên cứu thực Hệ cộng sinh địa y nguồn sinh thái thu nhận mẫu nghiên cứu năm gần 3-6 Địa y hệ sinh thái cộng sinh đa dạng bao gồm nấm, tảo vi khuẩn có vi khuẩn lam (Cyanobacteria) xạ khuẩn (Actinobacteria) sản xuất nhiều chất biến dưỡng thứ cấp có hoạt tính sinh học Năm 2005, nghiên cứu “Đánh giá đa dạng xác định trình tự gen sinh tổng hợp xạ khuẩn phân lập từ địa y” González cộng cho thấy địa y nguồn phong phú để phân lập loài xạ khuẩn với khả sản xuất nhiều chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học chưa khai thác, có kháng sinh Năm 2019, nhóm nghiên cứu Bộ mơn Vi sinh Ký sinh thực đề tài: “Sàng lọc số xạ khuẩn có tiềm sản xuất kháng sinh từ địa y” thu nhận số chủng xạ khuẩn có khả sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật Xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ nghiên cứu chọn để tiếp tục đánh giá cụ thể tiềm sản xuất hợp chất kháng khuẩn Vì vậy, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu hoạt tính kháng vi sinh vật chủng xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y” MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Xác định đặc điểm sinh học định danh xạ khuẩn 4VH4 Khảo sát điều kiện nuôi cấy quy trình chiết xuất cao phân đoạn từ dịch ni cấy có hoạt tính kháng vi sinh vật Khảo sát hoạt tính cao tồn phần cao phân đoạn từ dịch chiết môi trường lên men xạ khuẩn 4VH4 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Địa y 1.1.1 Đặc điểm Địa y dạng cộng sinh nấm (mycobiont) sinh vật quang hợp (photobiont hay phycobiont) Sinh vật quang hợp tảo lục (thường chi Trebouxia) và/hoặc khuẩn lam (thường chi Nostoc) Trong mối quan hệ cộng sinh này, nấm có vai trị bảo vệ tảo cung cấp nguồn nitơ từ sản phẩm phân hủy chất hữu cho tảo, ngược lại, tảo cung cấp chất dinh dưỡng từ trình quang hợp cho nấm Có khoảng 30.000 lồi địa y tồn giới 10 Địa y tìm thấy nhiều nơi lá, cành cây, đá, tường gạch, đất,… sống điều kiện khắc nghiệt sa mạc 11 Tản địa y gồm phần vỏ phần tủy, tạo thành từ tế bào nấm lớp sinh vật quang hợp bao gồm tế bào tảo và/hoặc vi khuẩn lam bao bọc sợi nấm Lớp vỏ bảo vệ cho sinh vật quang hợp không bị nước giảm tác động cường độ ánh sáng mức, cấu trúc lớp tủy lỏng lẻo giúp tăng cường trao đổi khí Sự xắp xếp tảo hệ sợi nấm tạo thành cấu trúc tản đặc trưng địa y với ba dạng gồm 12: - Địa y khảm (crustose lichen) có bề dày tản mỏng bám chặt vào giá thể sợi nấm vùng tuỷ (Hình 1.1-I) - Địa y phiến (foliose lichen) có tản dạng phiến lá, mặt khác biệt rõ rệt Tản bám lỏng lẻo bề mặt giá thể rễ giả (Hình 1.1-II) - Địa y sợi (fruticose lichen) có tản dạng sợi giống bụi nhỏ, đứng bề mặt giá thể xõa xuống (Hình 1.1-III) Hình 1.1 Ba dạng tản địa y 13-16 I: địa y khảm; II: địa y phiến; III: địa y sợi A: lớp vỏ trên, B: lớp tảo; C: lớp tủy; D: lớp vỏ dưới; E: rễ giả Địa y có nhiều màu sắc khác tùy thuộc vào sinh vật quang hợp Một số sắc tố đặc biệt tạo nên màu sắc địa y màu cam nồng độ cao parietin – chất thuộc nhóm xanthon thường gặp địa y, màu trắng xanh acid usnic, màu trắng có chứa tinh thể calci oxalat,… Khi khơng có sắc tố đặc biệt, địa y thường có màu lục sáng đến xám olive 1.1.2 Hệ vi sinh vật cộng sinh Vi khuẩn cộng sinh địa y phân lập lần vào nửa đầu kỷ 20 17,18 Năm 1983, Lenova Blum ước tính có hàng triệu vi khuẩn gam tản địa y Hiện phương pháp giải trình tự, sử dụng công nghệ omics, nhà khoa học chứng minh địa y có hệ vi sinh vật cộng sinh phức tạp, gọi “microbiome” Có 800 loại vi khuẩn hệ vi sinh vật cộng sinh cá thể địa y 19 Những vi khuẩn tìm thấy tự nhiên đặc trưng cho loài địa y thường khác với vi khuẩn tồn môi trường sống xung quanh chúng So sánh trình tự gen 16S rARN vi khuẩn cộng sinh loài địa y Lobaria pulmonaria thu thập từ vùng khác giống khoảng 16%, nghĩa hệ vi khuẩn cộng sinh chúng khác 20 Do địa y chịu tác nhân stress khắc nghiệt có khả hấp thụ chất độc hại, kim loại nặng, chất phóng xạ nguồn tiềm để phân lập vi sinh vật, hợp chất hoá học enzym có khả ứng dụng nhiều lĩnh vực 19 Cho đến nay, hầu hết nghiên cứu hệ vi sinh vật cộng sinh tập trung vào địa y họ Lecanoromycetes, có Lobaria pulmonaria L Hoffm Phần lớn vi khuẩn cộng sinh với địa y L Pulmonaria thuộc Rhizobiales (đặc biệt họ Methylobacteriaceae, Bradyrhizobiaceae Rhizobiaceae), Betaproteobacteria, Firmicutes Deinococcus Archaea 4,21-23 Actinobacteria, Các vi khuẩn Stenotrophomonas, Pseudomonas, Burkholderia xạ khuẩn hệ vi sinh vật cộng sinh L. Pulmonaria sản xuất nhiều chất có hoạt tính sinh học giúp bảo vệ địa y khỏi mầm bệnh 24,25 Năm 2005, González cộng công bố nghiên cứu xạ khuẩn cộng sinh địa y hoạt tính sinh học chúng, phát nhiều xạ khuẩn thuộc họ Streptomycetaceae có khả tạo nhiều chất có hoạt chất kháng khuẩn Ngoài ra, xạ khuẩn họ Micromonosporaceae, Pseudonocardiaceae Thermomonosporaceae tìm thấy, khoảng 30% vi khuẩn có khả sinh chất biến dưỡng có hoạt tính kháng khuẩn 19 Một số nghiên cứu khác phát Streptomyces uncialis từ địa y Cladonua uncialis sản xuất uncialamycin – dẫn chất enediyn có hoạt tính kháng Escherichia coli, Burkholderia cepacia Staphylococcus aureus 26,27 Xạ khuẩn Streptomyces uncialis tạo alkaloid cladoniamid A-G có độc tính chống lại tế bào MCF-7 ung thư vú người 28 Xạ khuẩn Streptomyces cyaneofuscatus cộng sinh với địa y Lichina confinis tổng hợp cyaneodimycin – dẫn xuất methacrylat có tác dụng gây độc tế bào 25 1.2 Xạ khuẩn 1.2.1 Đặc điểm chung Xạ khuẩn vi khuẩn gram dương, ADN có tỉ lệ G+C cao (55%), phân bố rộng rãi đất nước 29,30 Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào phức tạp, hình thái xạ khuẩn thay đổi vòng đời phát triển điều kiện ni cấy khác nhau, đặc điểm hình thái xạ khuẩn mơi trường khác tiêu chí quan trọng để phân loại xạ khuẩn 31 (Hình 1.2) Hình 1.2 Vịng đời xạ khuẩn 32 Trên môi trường nuôi cấy, xạ khuẩn phát triển dạng sợi sinh bào tử Hệ sợi xạ khuẩn gồm khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh Sợi bám vào bề mặt thạch gọi khuẩn ty chất, sợi bề mặt khơng khí khuẩn ty khí sinh Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, bề mặt xù xì có dạng phấn, dạng nhung, dạng bơng, trường hợp khơng có khuẩn ty khí sinh bề mặt khuẩn lạc có dạng màng dẻo 33 - Khuẩn ty chất xạ khuẩn khác kích thước, hình dạng, độ dày màu sắc Màu sắc khuẩn ty chất thay đổi từ trắng gần không màu đến vàng, nâu, đỏ, hồng, cam, xanh đen 33 - Khuẩn ty khí sinh thường dày khuẩn ty chất Đây tiêu chí quan trọng để phân loại chi Streptomyces 33 - Bào tử xạ khuẩn sinh đầu số khuẩn ty theo kiểu hình thành vách ngăn (septa) 34 Chuỗi bào tử khác chiều dài số lượng bào tử: hai bào tử (di- bi-sporous), vài bào tử (oligosporous) nhiều bào tử (polysporous) Chiều dài, hình dạng, vị trí, màu sắc chuỗi bào tử sở quan trọng để phân loại xạ khuẩn Các bào tử dày khoảng – µm, thường có hình cầu, hình trứng, hình que,… Một số bào tử có roi, bề mặt nhẵn xù xì, có gai, có lơng, có hạt u nhỏ… 35 (Hình 1.3) Hình 1.3 Bào tử dạng gai dạng nhẵn kính hiển vi điện tử (thanh tỷ lệ: µm) (a): bào tử gai Streptomyces actinomycinicus 36 (b): bào tử dạng nhẵn Streptomyces violazeoruber 37 (c): bào tử có lơng Streptomyces finlayi 38 - Bào tử chứa túi đặc biệt gọi túi bào tử hay nang bào tử Các chi Actinoplanes, Ampulariella, Planomonospora, Planobispora, Dactylosporangium Streptosporangium, phân loại dựa hình thái túi bào tử chúng Ở chi Micromonospora, Micropolyspora Thermoactinomycetes, hình thành bào tử xảy trực tiếp khuẩn ty chất, Streptomyces bào tử phát triển từ khuẩn ty khí sinh Các chi Actinoplanes Actinosynnema đặc trưng bào tử di động cịn Thermoactinomyces có nội bào tử chịu nhiệt 31 Hình 1.4 minh họa cấu trúc mang bào tử khác thấy chi xạ khuẩn Hình 1.4 Cấu trúc mang bào tử số xạ khuẩn 32 1.2.2 Phân loại Phân loại xạ khuẩn chủ yếu dựa vào trình tự gen 16S 23S rARN, đoạn chèn đoạn gen bảo tồn Xạ khuẩn khác vi khuẩn khác chúng có số protein đặc trưng cytochrome-C, oxidase subunit 1, CTP synthase and glutamyl-Trna synthase Theo hệ thống phân loại Bergey, đến năm 2012, có khoảng 3.000 loài xạ khuẩn thuộc 222 chi, 53 họ, 23 30 Ngành xạ khuẩn chia thành sáu lớp: Actinobacteria, Acidimicrobiia, Coriobacteriia, Nitriliruptoria, Rubrobacteria Thermoleophilia Với số lượng đa dạng loài, ngành Actinobacteria nhóm phân loại lớn vi khuẩn 39 Phân loại trước dựa hình thái sinh lý không phản ánh hết mối quan hệ phát sinh lồi tự nhiên khơng xác định đầy đủ phân biệt cấp độ phân loại Actinobacteria 40 (Hình 1.5) Hình 1.5 Hệ thống phân loại Actinobacteria theo Bergey 41 Vi khuẩn Actinobacteria có nhiều chức quan trọng, bao gồm khả phân hủy chất hữu cellulose, polysaccarid, chất béo protein, acid hữu hay sản xuất kháng sinh ứng dụng dược phẩm, bên cạnh số chi xạ khuẩn gây hại cho người, động, thực vật Một số đặc điểm chi thuộc Actinomycetales mô tả bảng 1.1 31 Bảng 1.1 Một số đặc điểm chi Actinomycetales 32 Chi Đặc điểm Actinomyces Dạng sợi phân nhánh, số loài gây bệnh cho người (Actinomyces israelii, Actonomyces naeslundii, Actinomyces meyeri…) Corynebacterium Gây bệnh cho người (Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium xerosis…) Frankia Cố định nitơ Gardnerella Gây bệnh cho người (Gardnerella vaginalis) Tropheryma Gây bệnh cho người (Tropheryma whipplei) Mycobacterium Kháng acid, gây bệnh cho người (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Mycobacterium fortuitum…) Nocardia Dạng sợi, phân nhánh, gây bệnh hội (Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis…) Propionbacterium Sinh tổng hợp acid propionic (Propionibacterium freudenreichii, Propionibacterium acidipropionici…) Streptomyces Dạng sợi phân nhánh, sản xuất nhiều kháng sinh 1.2.3 Các phương pháp định danh xạ khuẩn Hiện nay, phân loại định danh vi khuẩn chủ yếu dựa phân tích kiểu hình, hóa phân loại phân tích kiểu gen 31 Kỹ thuật giải trình tự ADN, đặc biệt gen 16S rARN xem công cụ tốt để định danh vi sinh vật 42 1.2.3.1 Kỹ thuật truyền thống Định danh vi sinh vật phương pháp truyền thống dựa đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa Đặc điểm nhận dạng chi mơ tả Khóa phân loại Bergey Khóa phân loại ISP Nonomura 43,44 - Màu sắc khuẩn ty khí sinh môi trường nuôi cấy ghi nhận: trắng, xám, đỏ, xanh cây, xanh lam tím Khi màu sắc nằm hai chuỗi màu hay màu sắc trung gian hai màu ghi nhận - Sắc tố melanoid: phân nhóm dựa sắc tố melanoid (màu nâu xanh nhạt, nâu đen nâu riêng biệt) Các chủng phân thành tạo sắc tố (+) không tạo sắc tố (-) - Sắc tố bên khóm: chủng chia thành nhóm sắc tố phân biệt (+), khơng phân biệt không tạo sắc tố (-), màu vàng, olive, nâu vàng xem không tạo sắc tố - Sắc tố hòa tan: chủng chia thành tạo sắc tố hịa tan (+) khơng tạo sắc tố (-) - Hình thái chuỗi bào tử cấu trúc bề mặt bào tử xác định kính hiển vi điện tử qt Các lồi thuộc chi Streptomyces chia thành ba phân nhóm rectiflexibiles (RF), retinaculiaperti (RA), spirales (S) Khi chủng tạo thành hai loại chuỗi bào tử, hai loại ghi nhận Hình thái chuỗi bào tử minh họa hình 1.6 Các đặc điểm bề mặt bào tử có gai, nhẵn, có đốm có lơng ghi nhận Hình 1.6 Hình thái chuỗi bào tử 32 (a) : rectiflexibiles, (b) : retinaculiaperti, (c) : spirales 1.2.3.2 Hóa định danh (Chemotaxanomy) Hố định danh dựa vào thành phần hóa học có tế bào để xếp sinh vật thành nhóm có thành phần tương đồng Các thành phần hóa học sử dụng phổ biến cách phân loại đường toàn tế bào, acid amin thành tế bào, lipid, menaquinon, acid mycolic acid béo màng tế bào 45 1.2.3.3 Kỹ thuật sinh học phân tử Gen 16S rADN trình tự mục tiêu tốt để nghiên cứu mối quan hệ phát sinh lồi có mặt tất vi khuẩn, không đổi mặt chức bao gồm vùng bảo tồn cao vùng có biến đổi Mặc dù gen 16S rADN từ vi khuẩn khác có vài nucleotid khác nằm rải rác trình tự, nucleotid đầu cuối gen vi sinh vật 32 1.2.4 Ứng dụng xạ khuẩn ngành dược phẩm ngành công nghiệp khác Xạ khuẩn tạo chất chuyển hóa sơ cấp thứ cấp ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Một số khả xạ khuẩn kể đến sản xuất kháng sinh, enzym, chất hoạt động bề mặt sinh học, probiotic, tổng hợp nano kim loại, chất có hoạt tính diệt cỏ, diệt trùng sắc tố 31 1.2.4.1 Sản xuất enzym Các enzym amylase, protease, lipase, cellulase, xylanase, inulinase, dextranase keratinase sản xuất xạ khuẩn Hiện nay, trình tự nhóm gen mã hoá enzym xác định, giúp sàng lọc xạ khuẩn có khả tổng hợp enzym với hiệu suất cao 31 1.2.4.2 Sản xuất kháng sinh Khoảng 80% kháng sinh sử dụng lâm sàng có nguồn gốc từ xạ khuẩn, chủ yếu từ chi Streptomyces Micromonospora Đặc biệt, chi Streptomyces sản xuất khoảng 7.600 hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh Kháng sinh từ xạ khuẩn thuộc nhiều họ khác aminoglycosid (streptomycin kanamycin), ansamycin (rifampin), anthracyclin (doxorubicin), β-lactam (cephalosporin), macrolid (erythromycin) tetracyclin Một kháng sinh tìm thấy sử dụng streptomycin từ Streptomyces griseus Kháng sinh xạ khuẩn sản xuất khác chất hóa học, hoạt tính kháng khuẩn độc tính tế bào chủ 31 (Bảng 1.2) Một số xạ khuẩn sản xuất nhiều kháng sinh (S griseus) kháng sinh sản xuất nhiều loại xạ khuẩn (actinomycin, streptothricin) 31 Bảng 1.2 Một số nhóm kháng sinh nguồn gốc từ Streptomyces spp Nhóm kháng sinh Kháng sinh Aminoglycosid Tetracyclin Macrolid Xạ khuẩn Phổ kháng khuẩn Streptomycin Streptomyces griseus Vi khuẩn gram âm Spectinomycin Streptomyces spp Mycobacterium tubeculosis, Neisseria gonomhoeae tiết Penicillinase Neomycin Streptomyces fradiae Phổ rộng, sử dụng chỗ độc tính Tetracyclin Streptomyces aureofaciens Phổ rộng vi khuẩn gram âm gram dương, rickettsias Chlamydia, Mycoplasma Chlortetracyclin Streptomyces aureofaciens Tương tetracyclin Eryhthromycin Saccharopolyspora erythraea Hầu hết vi khuẩn gram dương, tự Nhóm kháng sinh Kháng sinh Xạ khuẩn Phổ kháng khuẩn Legionella Polyen Phenicol Clindamycin Streptomyces lincolnensis Vi khuẩn kỵ khí đặc biệt Bacterooides fragilis Nystatin Streptomyces noursei Nấm, đặc biệt nhiễm Candida Amphotericin B Streptomyces nodosus Nấm Chloramphenicol Streptomyces venezuelae Phổ rộng 1.2.4.3 Sản xuất hợp chất kháng khối u Các hợp chất chuyển hóa từ xạ khuẩn có khả chống ung thư thuộc số nhóm cấu trúc anthracyclin, enediyn, indolocarbazol, isoprenoid, macrolid, nonribosomal peptid Hoạt tính kháng khối u thể thơng qua chế gây chết tế bào theo chương trình nhờ phân cắt ADN qua trung gian ức chế topoisomerase I II, ức chế mitochondria enzym quan trọng tham gia vào q trình tín hiệu protease, chuyển hóa tế bào số trường hợp cách ức chế tăng sinh mạch khối u gây Nhờ công nghệ ADN tái tổ hợp, số cụm gen sinh tổng hợp kháng khối u đặc trưng cho xạ khuẩn thiết lập 46 1.2.5 Chủng xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y Dirinaria applanata Trong đề tài khóa luận “Phân lập xạ khuẩn liên kết số địa y Việt Nam có tiềm tổng hợp kháng sinh” Nguyễn Hồng Trang thực môn Vi sinh Ký sinh (Khoa Dược, ĐHYD TP HCM), xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y Dirinaria applanata từ thân dừa huyện Giồng Trơm, Bến Tre Hoạt tính kháng vi sinh vật khảo sát phương pháp đường vạch đối kháng cho thấy chất chuyển hoá từ chủng 4VH4 có khả kháng vi sinh vật thử nghiệm, đặc biệt vi khuẩn gram âm (Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Pseudomonas aeginosa) môi trường YIM61 Tuy nhiên, sử dụng môi trường này, gặp nhiều khó khăn việc tinh chế kháng sinh, nên đề tài Nguyễn Hồng Trang lựa chọn xạ khuẩn 4VH3 để nghiên cứu Và nghiên cứu tiếp tục lựa chọn xạ khuẩn 4VH4 để thực thử nghiệm 1.3 Nuôi cấy xạ khuẩn Môi trường lên men với mục đích thu kháng sinh cần cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng để sinh khối xạ khuẩn phát triển, đồng thời đảm bảo khả tạo chất chuyển hố thứ cấp có hoạt tính kháng sinh 1.3.1 Thành phần môi trường lên men Loại chất dinh dưỡng nồng độ chúng môi trường đóng vai trị quan trọng sản xuất chất chuyển hóa sơ cấp thứ cấp Việc cung cấp hạn chế chất dinh dưỡng thiết yếu ảnh hưởng phát triển tế bào vi sinh vật hình thành sản phẩm 47 Nguồn carbon Tỷ lệ nguồn carbon ảnh hưởng đến hình thành sinh khối sản xuất chất chuyển hóa Lựa chọn nguồn carbon thường vào yếu tố: sản phẩm q trình lên men, giá thành ngun liệu, độ tinh khiết nguyên liệu Một số nguồn carbon thường sử dụng: carbohydrat (ngũ cốc, bắp, khoai tây, bột mì, rỉ mật, cellulose,…), chất béo (dầu olive, dầu bắp, dầu đậu phộng, acid béo,…), hydrocarbon dẫn xuất (các alkan, methan, methanol) 48 Tốc độ chuyển hóa nguồn carbon ảnh hưởng đến hình thành sinh khối và/hoặc sản xuất chất chuyển hóa sơ cấp thứ cấp Nghiên cứu Okami cộng nhận thấy bổ sung chiết xuất nấm men vào môi trường tăng trưởng xạ khuẩn Streptomyces sp phân lập từ vùng biển giúp tối đa hóa lượng kháng sinh thu 49 Nguồn carbon chuyển hóa nhanh glucose giúp vi khuẩn đạt tốc độ phát triển tế bào tối đa, lại cản trở trình sản xuất chất chuyển hóa 50 Sự “kìm hãm chất dị hóa” cho chất trung gian tạo từ q trình dị hóa nhanh chóng glucose can thiệp vào hoạt động enzym trình chuyển hóa thứ cấp Gallo Katz cho enzym xúc tác hình thành vịng phenoxazinon actinomycin bị ức chế glucose 51 (Bảng 1.3) Bảng 1.3 Tác động nguồn carbon sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn 47 Chất chuyển hóa Streptomycin Xạ khuẩn Streptomyces griseus Nguồn carbon Nguồn carbon cản trở sản xuất khơng cản trở chất chuyển sản xuất chất hóa chuyển hóa Glucose Mannose Actinomycin Streptomyces parvullus Glycerol - Actinomycin Streptomyces sp Glucose - Actinomycin Streptomyces antibioticus - Galactose D Fructose Simocyclinon Streptomyces antibioticus - Glycerol Penicillin Streptomyces chrysogenum Glucose - Gentamycin Micromonospora purpurea - Fructose Maltose Erythromycin Streptomyces serytheus Sucrose Lactose Mannose Kanamycin Streptomyces kanamyceticus - Tinh bột Mannose Ghi chú: (-) khơng có báo cáo Nguồn nitơ Đa số chủng vi sinh vật sử dụng nguồn nitơ hữu (acid amin, protein, ure, phức hợp môi trường chiết xuất nấm men) nitơ vơ (muối amoni muối nitrat) Q trình sản xuất kháng sinh chịu ảnh hưởng loại nồng độ nguồn nitơ sử dụng 48 Bổ sung acid amin giúp tăng suất sản xuất kháng sinh số trường hợp, nhiên sử dụng acid amin khơng phù hợp làm ức chế tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp 52 Quá trình sinh tổng hợp actinomycin V liên quan đến đường chuyển hóa tryptophan, bổ sung tryptophan vào môi trường giúp tăng cường sản xuất chất kháng sinh 53 Ngược lại, tryptophan cho thấy tác động ức chế sản xuất candicidin từ Streptomyces griseus 50 (Bảng 1.4) Bảng 1.4 Tác động nguồn nitơ sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn 47 Chất chuyển Xạ khuẩn hóa Spiramycin Streptomyces Nguồn nitơ cản Nguồn nitơ không trở sản xuất chất cản trở sản xuất chuyển hóa chất chuyển hóa NH4+ L-isoleucin NH4+ L-prolin ambofaciens Erythromycin Streptomyces serytheus Streptomycin Streptomyces griseus NH4+ Tetracyclin Streptomyces spp NH4+ Actinomycin Streptomyces L-alanin antibioticus DL-phenyl alanin Streptomyces L-isoleucin parvullus DL-aspartat Actinomycin D Tryptophan - L-prolin Streptothricin Streptomyces rochei Cloramphenicol Streptomyces - DL-aspartat - Leucin venezulae Candicidin Streptomyces griseus DL-phenyl alanin Tryptophan - Chú thích: (-) khơng có báo cáo Khống chất Chức khoáng chất đa dạng, liên quan đến hoạt tính enzym, hoạt động chất xúc tác cho phản ứng sinh hóa bên tế bào Nồng độ khoáng chất bổ sung tùy thuộc nhu cầu vi sinh vật 48 Một số nghiên cứu cho thấy khoáng chất ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp kháng sinh lồi xạ khuẩn Các ion hóa trị Mn 2+ , Cu2+ , Fe2+ kích thích sinh tổng hợp kháng sinh macrolid AK-111-81 xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus 55 Nghiên cứu Georgieva-Borisova cho thấy bổ sung Fe 2+ and Mn2+ thúc đẩy trình sản xuất niphimycin 56 1.3.2 Điều kiện lên men Quá trình lên men tạo kháng sinh chịu ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ, pH, thơng khí Hầu hết xạ khuẩn có nhu cầu oxy cao cho việc tăng trưởng sinh khối tổng hợp chất chuyển hoá 31 - pH Đa số vi sinh vật sinh trưởng phát triển bình thường phạm vi pH trung tính, số xạ khuẩn sống khoảng pH acid từ 3,5 – 6,5 với pH tối ưu 4,5 – 5,5 31 Điều chỉnh pH môi trường phương pháp sau 48:  Sử dụng dung dịch NH3, NaOH, H2SO4  Sử dụng hệ đệm môi trường đệm phosphat, carbonat  Đặc biệt, tỷ lệ carbon nitơ mơi trường kiểm soát pH hệ đệm - Nhiệt độ Mỗi loại vi sinh vật có nhiệt độ phát triển tối ưu khác Xạ khuẩn ưa ấm sống khoảng nhiệt độ 20 – 42 °C, xạ khuẩn ưa nhiệt có khoảng nhiệt độ tối ưu từ 45 – 55 °C 31 - Oxy Nhu cầu oxy thay đổi tùy theo chủng vi sinh vật giai đoạn tăng trưởng Trong môi trường nước, hàm lượng oxy hòa tan tối đa 7,6 mg/l 30 °C Trong mơi trường lên men, hàm lượng oxy hịa tan phụ thuộc vào 48:  Khả cung cấp không khí oxy  Hiệu khuấy trộn dịch lên men  Áp suất khí nồi lên men Theo hướng dẫn thiết kế môi trường sinh chất thứ cấp Nisbet 1982, thành phần môi trường lên men nguồn carbon, nitơ, phospho, oxy cần giới hạn phù hợp để không gây ức chế vi khuẩn 57 Dựa vào ảnh hưởng yếu tố đến môi trường lên men, môi trường nuôi cấy xạ khuẩn thường lựa chọn sử dụng nguồn carbon từ glucose, lactose, tinh bột, glycerol, cám lúa mì Nguồn nitơ thường sử dụng hỗn hợp acid amin, cao nấm men, cao men bia, nước thải ngâm bắp 58-60 Giai đoạn sinh tổng hợp kháng sinh cần tối ưu điều kiện để phát triển sinh khối chủng tổng hợp lượng kháng sinh cao Điều phụ thuộc vào khả sinh tổng hợp chủng, thời gian tích lũy kháng sinh cao nhất, chất lượng mơi trường nuôi cấy, tiền chất bổ sung lượng tiêu hao liên quan đến phát triển chủng sản xuất kháng sinh 61 Trong trình lên men, nồng độ kháng sinh tích tụ ngày tăng mơi trường làm cho lực sinh tổng hợp kháng sinh chủng giảm dần theo thời gian lên men Bên cạnh phụ thuộc vào nhiệt pH môi trường, lượng kháng sinh sinh bị phân hủy theo thời gian 62 Nhằm giảm thiểu tổn thất trên, sau kết thúc trình lên men cần xử lý thu sản phẩm sớm có giải pháp hạ thấp nhanh nhiệt độ dịch lên men 62 1.3.3 Phương pháp lên men Lên men sử dụng để thu sản phẩm chuyển hóa từ vi sinh vật Các phương pháp lên men bao gồm lên men rắn, lên men chìm hay lên men lỏng 63 - Lên men chìm/ Lên men lỏng trình lên men vi sinh vật mơi trường lỏng Lên men chìm sử dụng cơng nghiệp suất cao, chi phí thấp; nhiên, tiêu tốn nhiều lượng nhiều nước thải 48 - Lên men rắn quy trình lên men vi sinh vật phát triển chất rắn điều kiện khơng có gần khơng có nước tự do, cần độ ẩm để hỗ trợ phát triển hoạt động trao đổi chất vi sinh vật 64 1.4 Chiết xuất phân lập chất có hoạt tính sinh học Các kỹ thuật sắc ký (đặc biệt sắc ký trao đổi ion), chiết xuất lỏng-lỏng lỏng-rắn cột nhựa resin thường sử dụng để chiết xuất tinh khiết kháng sinh phổ biến từ môi trường lên men 65,66 Trong kỹ thuật này, sử dụng nhiều kĩ thuật chiết lỏng-lỏng dung môi hữu dịch nuôi cấy lên men 65 Phụ thuộc vào chất hóa học chất kháng sinh mà lựa chọn phương pháp tách chiết phù hợp Chiết tách kháng sinh từ môi trường lên men lỏng, phương pháp lọc ly tâm sử dụng để tách sinh khối dịch lên men Kháng sinh thường bị hoạt tính nhiệt độ cao, acid kiềm mạnh, tách chiết tinh cần khảo sát yếu tố 61 Chiết tách kháng sinh từ môi trường lên men rắn, sản phẩm chuyển hóa thu cách chiết với dung môi (dung môi đơn hỗn hợp dung môi) Loại dung môi nồng độ, tỷ lệ dung môi với môi trường rắn pH biến số quan trọng ảnh hưởng hiệu suất chiết 67 Sau lên men, sinh khối rắn chiết ngâm lạnh, chưa chiết bảo quản điều kiện đơng lạnh Với nhóm kháng sinh bền, nhiệt độ chiết yếu tố cần khảo sát 61 Quy trình chiết kháng sinh từ mơi trường lên men xạ khuẩn quy mơ phịng thí nghiệm thường sử dụng phương pháp chiết xuất lỏng-lỏng dung môi hữu với dịch nuôi cấy, dung môi sử dụng không đồng tan nước ethyl acetat, cloroform, hexan, butanol hay diethyl ether, ethyl acetat dung mơi thường dùng độc tính thấp dễ dàng dung mơi 68-70 Có nhiều phương pháp để phân lập hoạt chất kết tinh, tách, chưng cất phân đoạn hay phương pháp sắc ký Sắc ký điều chế phương pháp sử dụng nhiều đóng vai trị quan trọng nghiên cứu hợp chất tự nhiên Thành phần dịch chiết thường phức tạp, tính chất chất phân tách thay đổi, từ không hay phân cực đến phân cực mạnh, từ phân tử có kích thước nhỏ đến đại phân tử, hàm lượng chất hỗn hợp thừ vài phần trăm đến phần ngàn Trong trường hợp này, phương pháp phân lập kết tinh chưng cất phân đoạn khơng thể đáp ứng được, kỹ thuật sắc ký lựa chọn sử dụng 71 Sắc ký cột cổ điển Sắc ký cột loại sắc ký pha tĩnh nhồi cột thủy tinh hay thép không gỉ Sắc ký cột nhằm mục đích phân lập nhiều hợp chất tinh khiết với khối lượng lớn từ hỗn hợp nhiều thành phần Nguyên tắc: mẫu thử nạp vào cột chứa chất hấp phụ (thường silica gel, oxid nhôm) Cột chứa chất hấp phụ đóng vai trị pha tĩnh, dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo cột làm di chuyển cấu tử mẫu thử Do cấu tử có độ phân cực khác nên lực chúng với pha tĩnh khác nhau, bị dung mơi giải hấp di chuyển với vận tốc khác nhau, khỏi cột các thời điểm khác 71 Loại chất hấp phụ: thay đổi tùy theo độ phân cực chất cần phân lập Ví dụ: để phân lập chất có độ phân cực yếu tới độ phân cực trung bình dùng chất hấp phụ phân cực (chất hấp phụ pha thuận) silica gel, nhôm oxid 71 - Sắc ký cột chân không (Vacuum Liquid Chromatography, VLC) phát triển từ sắc ký cột cổ điển Về chất sắc ký cột chân không sắc ký hấp phụ khai triển với tốc độ nhanh VLC phương pháp phổ biến để thu phân đoạn chất chiết thô dễ sử dụng dung lượng mẫu cao Các phân đoạn rửa giải khai triển sắc ký lớp mỏng phân tích thành phần 71 - Sắc ký cột nhanh (Flash Chromatography) kỹ thuật cải tiến để thu phân đoạn chiết xuất thô Cột sắc ký sử dụng áp suất dương cách đóng chặt, đưa dịng khí nitơ khơng khí nén bơm đẩy dung mơi qua cột 71 1.5 Phương pháp sắc ký lỏng – khối phổ Sắc ký lỏng (Liquid Chromatography, LC) kỹ thuật tách thành phần mẫu dựa khác biệt lực tương tác chúng pha tĩnh pha động Khối phổ (Mass Spectrometry, MS) kỹ thuật phân tích hố học với độ nhạy cao, kỹ thuật chất phân tích chuyển sang trạng thái khí ion hóa, tỷ lệ khối lượng/điện tích cường độ chúng (m/z) ghi nhận Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) kết hợp hai kỹ thuật chọn lọc cho phép phân tích đo lường chất quan tâm hỗn hợp phức tạp Sắc ký – hệ thống MS phổ biến phân tích hóa học nhờ kết hợp tăng cường khả riêng lẻ kỹ thuật Trong sắc ký lỏng phân tách hỗn hợp với nhiều thành phần, phép đo MS cung cấp thông tin phổ giúp xác định thành phần dự đốn mảnh riêng biệt 72 (Hình 1.7) Hình 1.7 Sơ đồ hệ thống LC-MS 72 Các phận hệ thống LC-MS - Sắc ký lỏng - Nguồn ion sử dụng q trình hóa hơi/ion hóa phân tử đích Hiện ion hóa tia điện tử (ESI) ion hóa áp suất khí (APCI) kỹ thuật ion hóa áp suất khí (API) phổ biến để định lượng phân tử nhỏ LC-MS - Bộ phân tích khối sử dụng để tách ion pha khí theo tỷ lệ khối lượng điện tích (m/z) Hầu hết thiết bị LC-MS sử dụng phân tích bao gồm số thành phần song song, phổ biến để định lượng LC-MS phổ kế tứ cực (QqQ) - Đầu dò giúp phát khối lượng ion phân tách LC – MS sử dụng để phân tích hợp chất sinh hóa, hữu vơ mẫu phức tạp có nguồn gốc sinh học môi trường Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực bao gồm công nghệ sinh học, giám sát môi trường, chế biến thực phẩm, phát triển dược phẩm hóa chất nơng nghiệp công nghiệp mỹ phẩm Từ đầu năm 2000, LC-MS (hay cụ thể LC-MS-MS) bắt đầu sử dụng nghiên cứu hợp chất tự nhiên Năm 2014, I Djinni cộng nghiên cứu chất chuyển hóa Streptomyces sundarbansensis WR1L1S8 nội sinh có nguồn gốc từ biển phương pháp LCMS đánh giá điều kiện nuôi cấy hoạt tính kháng khuẩn phát triển hệ sợi 73 Năm 2020, Nguyễn Thị Huệ cộng nghiên cứu chủng Streptomyces sp VN1 phương pháp phân tích HR Q-TOF ESI/MS/MS chiết xuất thơ xác nhận trình sinh tổng hợp chất tương tự lobophorin có hoạt tính kháng ung thư 74 1.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng vi sinh vật 1.6.1 Phương pháp khuếch tán 1.6.1.1 Phương pháp giếng khuếch tán Nguyên tắc: vi sinh vật thử nghiệm trải lên bề mặt mơi trường thạch Sau đục lỗ hình trụ đường kính 6-8 mm Chất thử pha nồng độ thích hợp, cho vào giếng với thể tích 20-100 µl Đĩa thạch ủ điều kiện thích hợp với vi sinh vật thử nghiệm Chất thử khuếch tán vào mơi trường, có ức chế vi sinh vật thử nghiệm cho vòng ức chế sau thời gian ủ 75 1.6.1.2 Phương pháp đĩa giấy khuếch tán Nguyên tắc: dịch chiết kháng sinh tẩm vào khoanh giấy lọc có đường kính 5-6 mm, sấy khô nhiệt độ 50 °C đặt lên đĩa thạch trải vi sinh vật thử nghiệm Chất thử khuếch tán vào mơi trường, có ức chế vi sinh vật thử nghiệm cho vòng ức chế sau thời gian ủ 75 1.6.2 Phương pháp pha loãng Phương pháp pha loãng phương pháp thích hợp để xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration – MIC) 1.6.2.1 Pha lỗng mơi trường lỏng Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng cấp số chất kháng vi sinh vật môi trường thử nghiệm cho vào ống thể tích tối thiểu ml sử dụng phiến nhựa 96 giếng (vi pha lỗng) Dịch ni cấy vi sinh vật thử nghiệm cho vào môi trường ủ thời gian thích hợp Kết quan sát mắt thường dùng quang phổ kế đo độ đục Ở nồng độ chất thử có tác dụng ức chế vi sinh vật, ống thử suốt; chất thử khơng có tác dụng, vi sinh vật phát triển làm môi trường trở nên đục Giá trị MIC định nghĩa nồng độ thấp chất thử có tác dụng ức chế phát triển nhìn thấy vi sinh vật thử nghiệm biểu thị µg/ml mg/l 75 1.6.2.2 Pha lỗng mơi trường thạch Phương pháp pha lỗng mơi trường thạch thực cách cho chất thử nghiệm với nồng độ mong muốn (thường pha loãng cấp số 2) vào mơi trường thạch, sau cấy vi sinh vật thử nghiệm lên bề mặt đĩa thạch Điểm cuối MIC ghi nhận nồng độ chất thử thấp ức chế hoàn toàn phát triển vi sinh vật điều kiện ủ thích hợp Nếu hợp chất (hoặc dịch chiết) thử nghiệm có màu cản trở việc đọc kết quả, phương pháp pha lỗng mơi trường thạch thường ưu tiên so với pha lỗng mơi trường lỏng để xác định MIC 75 1.6.3 Phương pháp hình sinh học (bioautography) Hiện hình sinh học hay tự sinh đồ kỹ thuật nhanh chóng để sàng lọc số lượng mẫu lớn có hoạt tính sinh học phân đoạn có hoạt tính sinh học Có ba kỹ thuật thường sử dụng: - Hiện hình sinh học tiếp xúc (Contact bioautography) Bản sắc ký lớp mỏng (SKLM) sau khai triển hệ dung mơi thích hợp đặt bề mặt thạch cấy vi sinh vật để chất thử khuếch tán Sau thời gian ủ để khuếch tán, sắc ký lấy vi sinh vật thử nghiệm tiếp tục ủ nhiệt độ thích hợp Chất thử khuếch tán từ mỏng môi trường, cho vịng ức chế tương ứng với vị trí chất kháng vi sinh vật có 75 (Hình 1.8) Hình 1.8 Kỹ thuật hình sinh học tiếp xúc - Hiện hình sinh học trực tiếp (Direct bioautography) Hình 1.9 Kỹ thuật hình sinh học trực tiếp Bản SKLM sau khai triển phun nhúng huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm ủ điều kiện ẩm vịng 48 giờ, hình thuốc thử thị tế bào sống, chết Các muối tetrazolium (p-iodonitrotetrazolium tím) thường sử dụng cho thử nghiệm khả chuyển đổi thành hợp chất formazan có màu nhờ enzym dehydrogenase tế bào sống Thuốc thử muối tetrazolium phun lên tự sinh đồ, ủ 25 °C 24 ở 37 °C 3-4 đọc kết quả, vòng ức chế sáng màu SKLM tương ứng với vị trí chất kháng vi sinh vật Môi trường Mueller Hinton bổ sung lượng nhỏ agar xem dịch lỏng thích hợp cho phép bám dính tốt vào mỏng sắc ký trì độ ẩm thích hợp cho phát triển vi khuẩn 75 (Hình 1.9) - Hiện hình sinh học phủ thạch (Agar overlay bioassay) Hình 1.10 Kỹ thuật hình sinh học phủ thạch Bản SKLM sau khai triển phủ mơi trường thạch đun chảy có chứa vi sinh vật thử nghiệm Đặt mỏng nhiệt độ thấp vài để chất khuếch tán vào mơi trường Sau ủ điều kiện thích hợp, thuốc thử tetrazolium phun trực tiếp lên mỏng, vùng sáng màu tương ứng với vị trí chất kháng vi sinh vật 76 (Hình 1.10) 1.7 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.7.1 Tình hình nghiên cứu nước - Năm 2010, Motohashi cộng phát dẫn chất angucycline có tác dụng chống tế bào ung thư kháng khuẩn phân lập từ Streptomyces sp có nguồn gốc từ địa y 77 - Năm 2017, Liu cộng phân lập dẫn chất từ Streptomyces hebeiensis có nguồn gốc từ địa y, có dẫn chất nanaomycin, hai hợp chất biết nanaomycin αA βA Các cấu trúc nanaomycins – thiết lập cách sử dụng phân tích liệu quang phổ NMR UV, IR MS Hợp chất cho thấy hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm78 - Năm 2019, AE Susanti cộng nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn xạ khuẩn Streptomyces sp cộng sinh với địa y LC-23, dịch chiết ethyl acetat chủng cho thấy hoạt tính kháng Staphylococcus aureus BTCC B-611 Micrococcus luteus BTCC B-552 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) dịch chiết nhỏ 2,106 ppm 79 - Năm 2019, Zheng cộng khám phá dẫn chất phthalazinone isoflavonoid glycosid từ xạ khuẩn Amycolatopsis sp cộng sinh với địa y Squamarina sp 80 - Năm 2020, Liu cộng phát steffimycin F có hoạt tính kháng Staphylococcus aureus từ Streptomyces sp có nguồn gốc từ địa y Peltigera sp 81 - Năm 2021, Hei cộng nghiên cứu “Hoạt tính kháng khuẩn tiềm sinh tổng hợp xạ khuẩn cộng sinh Địa y từ cao nguyên Thanh Hải – Tây Tạng” chọn 27 chủng có đặc điểm hình thái khác biệt, qua xác định gen 16S rARN cho thấy 13 chủng loài mới, 14 27 chủng cho thấy hoạt tính sinh học kháng vi sinh vật thử nghiệm Các chất chuyển hóa 13 chủng Streptomyces sp có hoạt tính kháng khuẩn phân tích LCHRMS, 18 hợp chất khác xác định NMR và/hoặc LC-HRMS Các hợp chất xác định chủ yếu pyrrolidin, dẫn xuất indol anthracyclin 82 1.7.2 Tình hình nghiên cứu nước - Tại Việt Nam, đề tài nghiên cứu xạ khuẩn liên kết địa y hạn chế Năm 2019, đề tài khóa luận “Phân lập xạ khuẩn liên kết số địa y Việt Nam có tiềm tổng hợp kháng sinh” Nguyễn Hồng Trang với kết phân lập 66 chủng xạ khuẩn 63 chủng có hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm - Năm 2020, đề tài khóa luận nghiên cứu xạ khuẩn Streptomyces sp 4VH3 có nguồn gốc từ địa y Nguyễn Xuân Lộc xác định phân đoạn có hoạt tính kháng vi sinh vật nồng độ ức chế tối thiểu cao tồn phần Với tình hình nghiên cứu ngồi nước, chúng tơi thấy xạ khuẩn nguồn đa dạng quan trọng để khai thác cấu trúc kháng sinh mới, xạ khuẩn phân lập từ hệ sinh thái địa y có nhiều tiềm để tìm kiếm hợp chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học Vì đề tài tiến hành nghiên cứu sâu chủng xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y để đánh giá cụ thể tiềm sản xuất hợp chất kháng khuẩn chủng CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Chủng xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y Dirinaria applanata Trong nghiên cứu “Phân lập xạ khuẩn liên kết số địa y Việt Nam có tiềm tổng hợp kháng sinh” Nguyễn Hồng Trang, xạ khuẩn 4VH4 phân lập từ địa y Dirinaria applanata từ thân dừa huyện Giồng Trôm, Bến Tre Xạ khuẩn 4VH4 lưu trữ glycerol 25% (kl/tt), -70 °C Bộ môn Vi sinh Ký sinh, Khoa Dược, Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh Xạ khuẩn được rã đơng nhiệt độ phịng hoạt hóa mơi trường SC nhiệt độ phịng, 72 trước tiến hành thử nghiệm 2.1.2 Vi sinh vật thử nghiệm Các vi khuẩn, vi nấm sử dụng thử nghiệm sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật chủng chuẩn (ATCC) Các chủng lưu trữ glycerol 15%, -70 °C Bộ môn Vi sinh Ký sinh Các chủng rã đơng nhiệt độ phịng hoạt hóa trước tiến hành thử nghiệm Chủng vi khuẩn hoạt hóa mơi trường BHI 37 °C 18 Chủng nấm men hoạt hóa mơi trường SDA, 37 °C 48 - Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus ATCC 25923 (MSSA) - Methicillin-resistant Staphyloccocus aureus ATCC 33591 (MRSA) - Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 - Enterococcus faecalis ATCC 29212 - Escherichia coli ATCC 25922 - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 - Candida albicans ATCC 10231 2.2 Thiết bị hóa chất 2.2.1 Thiết bị dụng cụ Bảng 2.5 Thiết bị sử dụng nghiên cứu STT Thiết bị Model Nơi sản xuất Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HV110 Nhật Bản Tủ sấy memmert WBU 45 – UM 500 Đức Bể cách thuỷ memmert WNB Đức Cân phân tích Precisa XB 220A Đức Tủ cấy vô trùng Esco AVC – 4A1 Mỹ Máy Vortex 3412EU Đức Tủ ấm Heraues DIN 58945 Đức Máy quang phổ shimazu UV – 1280 Nhật Bản Thước kẹp Insize 1108 – 150 Đức 6545 series Mỹ 1900 Mỹ IKA-RV Nhật 10 11 12 Hệ thống khối phổ MS QTOF Agilent Hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent Máy cô quay Các dụng cụ sử dụng khác gồm kính hiển vi, bếp cách thủy, đèn UV, silica gel GF254, đĩa giấy Whatman mm dụng cụ thuỷ tinh thông thường phịng thí nghiệm, thước đo đường kính vịng ức chế, kẹp vô trùng, pipet, micropipet, đầu tip, 2.2.2 Hóa chất, dung mơi, mơi trường Hóa chất, dung môi sử dụng liệt kê bảng 2.2 Bảng 2.6 Hóa chất, dung mơi sử dụng nghiên cứu STT - HÓA CHẤT NGUỒN GỐC n-hexan Việt Nam Diclomethan Trung Quốc Cloroform Trung Quốc Ethyl acetat Trung Quốc Isoamyl alcohol Trung Quốc Methanol Trung Quốc n-butanol Trung Quốc Ethanol Trung Quốc Phenol Trung Quốc 10 Dimethyl sulfoxid Merck 11 Silica gel Merck 12 Thuốc thử Kovac’s Việt Nam 13 Đệm TE Merck 14 Lysozym Trung Quốc 15 SDS Trung Quốc 16 Natri acetat Trung Quốc 17 Agarose tinh khiết Promega 18 Đệm tải (DNA loading gel) Thermo Scientific 19 Đện TAE 1X Merck 20 Tween 20 Trung Quốc 21 1000 bp DNA Marker 500 µl Abm Mơi trường thử hoạt tính kháng vi sinh vật: Muller Hinton Agar (MHA), Brain Heart Agar (BHA), Sabouraud Dextrose Agar (SDA) - Môi trường thu nhận chất kháng VSV: Yi Jiang Medium 308 (YIM 308), Malt extract – Yeast extract Agar (MYA), Soybean meal –Sucrose – Yeast extract (SSY), Yi Jiang Medium 310 (YIM 310), Gause 1, International Streptomyces Project (ISP2) - Mơi trường nghiên cứu hình thái xạ khuẩn: ISP 2, ISP 4, ISP 5, MYA, Starch casein (SC) - Mơi trường nghiên cứu sinh hố xạ khuẩn: môi trường Bennett, ure, gelatin, tinh bột, cellulose – đỏ Congo - Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn để chiết ADN: Brain Heart infusion (BHI) Thành phần môi trường mô tả phụ lục 2.3 Phương pháp nghiên cứu Đề tài thực theo sơ đồ bố trí thí nghiệm (Hình 2.1): Xác định đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Chiết ADN, định danh xạ khuẩn Khảo sát điều kiện nuôi cấy chủng xạ khuẩn Sàng lọc hợp chất kháng vi sinh vật Xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao tồn phần cao phân đoạn Phân tích LC – MS cao toàn phần cao phân đoạn Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.3.1 Xác định đặc điểm sinh học xạ khuẩn 4VH4 2.3.1.1 Đặc điểm hình thái Xác định đặc điểm hình thái thực theo hướng dẫn “German Collection of Microorganisms and Cell Cultures” Viện Leibniz DSMZ 83 Theo hướng dẫn này, đặc điểm hình thái bao gồm màu sắc khuẩn ty chất, màu sắc khuẩn ty khí sinh sắc tố hịa tan chủng 4VH4 nghiên cứu môi trường ISP2, ISP4, ISP5, SC, MYA 83: - Màu sắc khuẩn ty chất: màu sắc mặt khóm xạ khuẩn, quan sát bị ảnh hưởng màu sắc tố hịa tan tiết mơi trường ni cấy - Màu sắc khuẩn ty khí sinh: màu mặt khóm xạ khuẩn, màu sắc khác chưa trưởng thành trưởng thành - Sắc tố hịa tan sắc tố khuếch tán vào mơi trường thạch xung quanh 2.3.1.2 Đặc điểm sinh hóa - Khả lên men đường Chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường môi trường Pridham Gottlieb 84 Bổ sung loại đường khác (xylose, raffinose, sucrose, mannitol, glucose, fructose) vào môi trường Sau ngày đánh giá khả đồng hóa cách quan sát khả tăng trưởng 85 - Khả sinh enzym Khả sinh enzym xạ khuẩn đánh giá thử nghiệm sinh enzym: oxidase, catalase, urease, protease, lipase, amylase, cellulase 83,86 Phản ứng oxidase Tiến hành: nhỏ giọt thuốc thử Kovacs’ oxidase 1% (kl/tt) (phụ lục 2) lên khuẩn lạc quan sát đổi màu Phản ứng catalase Tiến hành: nhỏ giọt H2O2 vào khuẩn lạc quan sát sủi bọt khí Phản ứng sử dụng urê Tiến hành: cấy xạ khuẩn vào ống môi trường urê ủ nhiệt độ phòng, đọc kết sau ngày Phản ứng dương tính mơi trường chuyển từ màu vàng sang màu hồng Phản ứng âm tính mơi trường khơng chuyển màu Phản ứng sử dụng gelatin Tiến hành: pha huyền dịch xạ khuẩn để OD600 ~ 0,1; cấy huyền dịch xạ khuẩn thành đường thẳng bề mặt môi trường, ủ 37 ºC, ngày Thủy phân cellulose Tiến hành: pha huyền dịch xạ khuẩn để OD600 ~ 0,1; cấy huyền dịch xạ khuẩn thành đường thẳng bề mặt môi trường cellulose – đỏ congo, ủ 37 ºC, ngày Khả sử dụng lipid Tiến hành: chuẩn bị môi trường thạch thử nghiệm lipase thêm Tween để đạt nồng độ 1% (kl/tt) Cấy chủng xạ khuẩn ủ nhiệt độ 37 ºC, vịng ngày Phản ứng dương tính xuất vùng mờ đục xung quanh khuẩn lạc Phản ứng thủy phân tinh bột Tiến hành: cấy xạ khuẩn vào mơi trường thạch tinh bột ủ nhiệt độ phịng, ngày Sau tráng bề mặt mơi trường với lượng vừa đủ dung dịch lugol (iod) Tinh bột tạo màu xanh với iod, phản ứng dương tính quan sát thấy vùng không màu xung quanh khuẩn lạc 2.3.2 Định danh xạ khuẩn phương pháp giải trình tự gen 16S rADN 2.3.2.1 Chiết tách ADN nhiễm sắc thể - Xạ khuẩn 4VH4 nuôi cấy mơi trường BHI, lắc với tốc độ 180 vịng/ phút 30 °C vòng 48 - Ly tâm 1,5 ml dịch nuôi cấy xạ khuẩn tốc độ 13.000 vòng phút; thu tế bào, thêm 480 μl đệm TE 20 μl lysozym (50 mg/ml), ủ 37 °C qua đêm - Thêm 50 μl SDS 20%, vortex phút, sau ủ 55 °C 60 phút - Ly tâm 10.000 vòng phút nhiệt độ phòng, lấy phần dịch vào eppendorf - Thêm 550 μl hỗn hợp gồm phenol/chloroform/isoamyl acohol (25:24:1), vortex phút, ly tâm 12.000 vòng 10 phút Chuyển dịch vào eppendorf - Thêm 50 μl natri acetat M, vortex nhẹ, thêm 800 μl ethanol 100% lạnh, ủ nhiệt độ phòng 10 phút - Ly tâm 12.000 vòng 10 phút, loại dịch nổi, thêm 200 μl ethanol 70%, trộn nhẹ, sau ly tâm 12.000 vịng phút, loại ethanol - Để khơ nhiệt độ phòng Thêm 50 μl đệm TE để hoà tan ADN bảo quản -20 °C 87 2.3.2.2 Kiểm tra ADN điện di gel agarose - Nguyên tắc phương pháp điện di: phân tử ADN mang điện tích âm, phân tích ADN phương pháp điện di gel agarose, ADN di chuyển cực dương Để quan sát, ADN, nhuộm SafeViewTMNucleic AcidStain SafeViewTMNucleic AcidStain gắn vào base nitơ ADN phát huỳnh quang tia tử ngoại Tốc độ di chuyển phân tử ADN gel dựa vào kích thước cấu dạng, phân tử ADN khác tách nhau, cho vệt khác quan sát tia tử ngoại - Chuẩn bị gel agarose tiến hành điện di  Cân g agarose vào 100 ml dung dịch TAE 1X  Đun sơi, sau để nguội đến 40-50 °C Thêm µl SafeViewTMNucleic Acid Stain lắc nhẹ nhàng  Đổ gel vào khuôn điện di  Chuẩn bị mẫu ADN: lấy 24 µl ADN trộn với µl đệm tải, nạp mẫu vào gel agarose  Chạy điện di điện 100 V/45 phút  Quan sát ADN UV 312 nm 87 2.3.2.3 Phân tích trình tự gen 16 S Radn ADN nhiễm sắc thể gửi giải trình tự đoạn gen 16S rADN để định danh Công ty Nam Khoa Kết giải trình tự xử lý phần mềm DNA Star so sánh trình tự với ngân hàng liệu NCBI 2.3.3 Khảo sát điều kiện lên men chủng xạ khuẩn Giai đoạn tăng sinh: xạ khuẩn 4VH4 tăng sinh TSB với tốc độ 150 vòng/phút 30 °C ngày - Môi trường lên men Xạ khuẩn 4VH4 tăng sinh bổ sung môi trường lỏng YIM308, YIM310, Gause 1, MYA, SSY, ISP2 với nồng độ 5% lắc với tốc độ 180 vòng/phút nhiệt độ phòng Sau 5-10 ngày tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng khuếch tán Môi trường nuôi cấy cho đường kính vịng ức chế lớn lựa chọn để khảo sát điều kiện nuôi cấy Sau lựa chọn môi trường lên men, tiến hành khảo sát ảnh hưởng yếu tố: nồng độ carbohydrat, nồng độ nitơ, pH Các yếu tố khảo sát độc lập - Nồng độ carbohydrat Do nguồn carbon môi trường khảo sát đa dạng nên nghiên cứu tiến hành khảo sát nồng độ carbohydrat môi trường lựa chọn Nồng độ carbohydrat thay đổi giữ nguyên thành phần môi trường khác Chủng xạ khuẩn ni cấy lắc 180 vịng/phút nhiệt độ phịng Sau ngày dịch ni cấy lọc tách sinh khối xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng khuếch tán - Nồng độ nguồn nitơ Tiến hành tương tự, thay đổi nồng độ nguồn nitơ giữ nguyên thành phần môi trường khác Chủng xạ khuẩn nuôi cấy lắc 180 vòng/phút nhiệt độ phòng Sau ngày xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng khuếch tán - pH Xạ khuẩn 4VH4 nuôi cấy lắc 180 vịng/phút mơi trường xác định nồng độ carbohydrat nitơ nhiệt độ phòng h khác (pH 3, 5, 7, 9, 11) Môi trường nuôi cấy điều chỉnh pH dung dịch NaOH HCl Sau ngày xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp giếng khuếch tán - Xác định thời gian kết thúc lên men Xạ khuẩn 4VH4 tăng sinh môi trường xác định với tốc độ 150 vòng/phút 30 °C sau ngày Sau bổ sung chủng vào mơi trường ISP2 với nồng độ 5% Thu dịch nuôi cấy thời điểm từ ngày từ đến ngày thứ 10, thử hoạt tính kháng khuẩn phương pháp giếng khuếch tán để xác định thời điểm kết thúc trình lên men 2.3.4 Sàng lọc hợp chất kháng vi sinh vật 2.3.4.1 Chiết cao toàn phần Lên men xạ khuẩn với 15 l mơi trường, ni cấy lắc 180 vịng/phút, nhiệt độ phịng Thời gian ni cấy tiến hành theo kết thí nghiệm xác định thời điểm kết thúc lên men, dịch nuôi cấy lọc qua để thu dịch Lắc phân bố dịch nuôi cấy với dung mơi thích hợp, quay thu cao tồn phần Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn cao toàn phần thu phương pháp đĩa giấy khuếch tán Vi khuẩn thử nghiệm lựa chọn dựa kết sàng lọc hoạt tính kháng vi sinh vật khảo sát môi trường lên men chủng xạ khuẩn 2.3.4.2 Phân tách hợp chất kháng vi sinh vật - Tách phân đoạn sắc ký cột cổ điển  Dụng cụ: cột sắc ký dài 45 cm, đường kính 2,5 cm có khóa, ống nghiệm chứa phân đoạn  Chuẩn bị mẫu: trộn cao toàn phần với silica gel (cỡ hạt 40 – 63 µm) vừa đủ để thu hỗn hợp bột khô, tơi, xốp, màu, đồng  Hoạt hóa silica gel: cho silica gel (cỡ hạt 40 – 63 µm) vào cốc có mỏ, sấy 100 – 120 ºC  Chuẩn bị cột: lót miếng thấm vào đáy cột Lượng silica gel sử dụng gấp khoảng 20 lần mẫu Silica gel hòa dung mơi n-hexan tạo hỗn dịch lỗng Khuấy hỗn dịch hệ thống nguội hoàn tồn khơng cịn bọt khí Vừa khuấy vừa đổ hỗn dịch silica gel nhexan vào lớp dung môi n-hexan nằm lớp đáy cột Để silica gel lắng, cho miếng giấy lọc lên bề mặt silica gel Ổn định cột  Nạp mẫu: nạp mẫu phương pháp nạp mẫu dạng bột khô Rắc mẫu lên lớp dung môi nằm đỉnh cột cho mẫu phân bố (gõ nhẹ cột vị trí chứa mẫu để mẫu phân bố)  Tiến hành: sử dụng dung môi từ phân cực đến phân cực gồm n-hexan, diclomethan (DCM), ethyl acetat (EA), methanol (MeOH) 250 ml n-hexan, 400 ml n-hexan - diclomethan (tỷ lệ từ 90:10 dến 10:90), 250 ml diclomethan, 400 ml diclomethan - ethyl acetat (tỷ lệ từ 90:10 dến 10:90), 250 ml ethyl acetat, 400 ml ethyl acetat - methanol (tỷ lệ từ 90:10 dến 10:90), 500 ml methanol, hứng phân đoạn đến kiểm tra SKLM không thu vết 71  Các phân đoạn kiểm tra sắc ký lớp mỏng, quan sát đèn UV 254 nm 365 nm, phân đoạn cho sắc ký đồ giống gộp chung, loại dung môi thu cắn 71 - Xác định cao phân đoạn có hoạt tính phương pháp khuếch tán thạch Thử hoạt tính cao phân đoạn phương pháp đĩa giấy khuếch tán Tiếp theo, phân đoạn có hoạt tính triển khai sắc ký lớp mỏng, xác định vết có hoạt tính kháng vi sinh vật kỹ thuật hình sinh học khuếch tán qua thạch (Hình 2.2) Hình 2.12 Xác định phân đoạn kháng vi sinh vật phương pháp hình sinh học - Phân tích cao toàn phần cao phân đoạn dịch chiết lên men xạ khuẩn S albus phương pháp LC – MS Cao toàn phần cao phân đoạn gửi đến phịng thí nghiệm Phân tích trung tâm Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên để phân tích thành phần phương pháp LC-MS với hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1900 (USA) hệ thống khối phổ MS 6545 series Q-TOF (Agilent) Điều kiện sắc ký:  Cột C18 Xterra, kích thước 4,6 mm  50 mm (đường kính x chiều dài cột), bề dày lớp film pha tĩnh 2,5 µm  Pha động: (A) acid formic (0,1% tt/tt) (B) acetonitril  Thể tích tiêm mẫu: µl  Tốc độ dịng: 0,4 ml/phút  Tiến hành sắc ký với hệ dung môi theo bảng 2.3 Bảng 2.7 Sắc ký với hệ gradient dung môi Thời gian (phút) Pha động A (% tt/tt) Pha động B (% tt/tt) 95 5 95 10 100 15 100 Detector phổ khối: Ion hóa: ESI dương Phạm vi m/z 100 – 1000; Điện áp phun 3500 V; Nhiệt độ hóa 350 °C; Lưu lượng khí l/phút; Áp suất đầu phun: 35 psi Phần mềm Masshunter Qualitative Agilent sử dụng để dự đốn cơng thức phân tử hợp chất Phương pháp LC-MS thực để xác định khối lượng phân tử dự đoán hợp chất sinh tổng hợp từ chủng xạ khuẩn 4VH4 Để phân biệt thành phần dự đốn, kết phân tích phổ LC-MS cao chiết so sánh với sở liệu khối phổ (Human Metabolome Database, Spectrabase, Dictionary of natural products Chapman Hall, GNPS), so sánh khối lượng phân tử/công thức phân tử thành phần cao chiết với chất thu nhận từ xạ khuẩn nghiên cứu công bố 88 2.3.5 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu Hợp chất kháng vi sinh vật xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) phương pháp pha loãng môi trường lỏng với vi sinh vật thử nghiệm E coli, K pneumoniae, MRSA MSSA theo hướng dẫn CLSI M07 – A11 (2020) Nồng độ ức chế tối thiểu xác định phương pháp vi pha loãng đĩa 96 giếng Thử nghiệm lặp lại lần - Chuẩn bị vi khuẩn thử nghiệm: sau cấy hoạt hóa đĩa thạch BHA, ủ 37 °C, 24 giờ, vi khuẩn pha dung dịch NaCl 0,85% phân tán máy vortex Huyền dịch vi khuẩn điều chỉnh giá trị OD600 khoảng 0,08 – 0,12 Tiếp tục pha lỗng huyền dịch 10 lần với mơi trường MHB Giá trị tương đương với mật độ vi khuẩn – x 107 CFU/ml - Chất thử nghiệm: cân xác cao tồn phần, cao phân đoạn pha dung dịch mẹ có nồng độ 10,24 mg/ml DMSO 10% Chuẩn bị dãy pha loãng 16 nồng độ với độ pha loãng 1/2 - Kháng sinh đối chứng: cân xác kháng sinh vancomycin, gentamicin pha dung dịch kháng sinh mẹ nồng độ 32 mg/ml DMSO 10% Chuẩn bị dãy pha loãng nồng độ với độ pha loãng 1/2 - Tiến hành: hút 100 µl huyền dịch vi khuẩn pha môi trường MHB vào tất giếng Tiếp theo, hút 100 µl chất thử có nồng độ khác vào giếng Chứng âm gồm 100 µl DMSO 10% 100 µl mơi trường MHB, chứng dương gồm 100 µl DMSO 10% 100 µl mơi trường MHB chứa vi khuẩn - Đọc kết quả: sau 16 – 20 giờ, quan sát độ đục giếng, xác định giá trị MIC CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm chủng xạ khuẩn 4VH4 3.1.1 Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chủng xạ khuẩn 4VH4 mô tả môi trường nuôi cấy với nguồn carbon khác (ISP2, ISP4, ISP5, SC, MYA) Trên môi trường ISP2 (gồm chiết xuất nấm men, chiết xuất mạch nha, glucose), khuẩn ty khí sinh có màu trắng xuất bào tử xám sau thời gian nuôi cấy 14 ngày Trên môi trường ISP4 (gồm tinh bột tan muối vô cơ), ISP5 (gồm glycerol asparagine), khuẩn ty khí sinh bào tử có màu trắng Trên mơi trường SC (gồm tinh bột – casein), sau 2-3 ngày khuẩn lạc có màu vàng, sau 5-6 ngày khuẩn ty khí sinh bào tử có màu trắng Khả tăng trưởng xạ khuẩn môi trường khác đánh giá dựa vào quan sát hình thành bào tử mật độ vi khuẩn 85,89 Xạ khuẩn 4VH4 đa dạng màu sắc nuôi cấy môi trường khác phụ thuộc vào thành phần mơi trường (Bảng 3.1 hình 3.1 – 3.5) Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng trịn, lồi, bề mặt khơ (Hình 3.1 – 3.5) Bảng 3.8 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 4VH4 môi trường nuôi cấy STT Môi trường Khả tăng trưởng Khuẩn ty chất Khuẩn ty khí sinh Sắc tố ISP2 Tốt Vàng (Broom yellow) Trắng (Cream) Nâu ISP4 Tốt Ngà (Ivory) Trắng (Traffic White) Không ISP5 Yếu Be (Beige) Trắng (Traffic White) Không SC Yếu Vàng (Traffic yellow) Trắng (Traffic White) Không MYA Tốt Vàng (Traffic yellow) Trắng (Traffic White) Nâu Ghi chú: màu sắc mô tả theo bảng màu RAL 85 (a) (b) Hình 3.13 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP2 (a) mặt (b) mặt (a) (b) Hình 3.14 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP4 (a) mặt (b) mặt (a) (b) Hình 3.15 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP5 (a) mặt (b) mặt (a) (b) Hình 3.16 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường MYA (a) mặt (b) mặt (a) (b) Hình 3.17 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường SC (a) mặt (b) mặt Xạ khuẩn 4VH4 phát triển sinh bào tử tốt môi trường ISP2 nên nhuộm gram quan sát kính hiển vi Ở thời điểm ngày thứ khuẩn ty bắt đầu phân nhánh, ngày thứ khuẩn ty bắt đầu xoắn xuất bào tử nhỏ, ngày sau khuẩn ty bào tử phát triển nhiều (Hình 3.6) Ngày Ngày Ngày Ngày Hình 3.18 Xạ khuẩn 4VH4 mơi trường ISP2 kính hiển vi theo thời gian 3.1.2 Đặc điểm sinh hoá Khả sử dụng đường Môi trường bổ sung xylose Môi trường bổ sung raffinose Môi trường bổ sung mannitol Môi trường bổ sung glucose Môi trường bổ sung sucrose Môi trường bổ sung fructose Hình 3.19 Xạ khuẩn 4VH4 môi trường với nguồn carbon khác Xạ khuẩn 4VH4 nuôi môi trường Pridham Gottlie (Phụ lục 1) Bổ sung loại đường khác (xylose, raffinose, sucrose, mannitol, glucose, fructose) vào môi trường Kết cho thấy xạ khuẩn 4VH4 tăng trưởng tốt tất môi trường bổ sung nguồn carbon khác (Hình 3.7) Khả sinh enzym Xạ khuẩn 4VH4 có khả sinh enzym catalase, urease, cellulase lipase (Hình 3.8) Catalase (+) Thủy phân tinh bột (-) Oxidase (-) Urease (+) Cellulase (+) Lipase (+) Gelatinase (-) Hình 3.20 Khả sinh enzym xạ khuẩn 4VH4 3.2 Định danh chủng xạ khuẩn 4VH4 ADN chủng 4VH4 sau chiết tách chạy điện di với agarose 1%, điện 100V 45 phút với thang chuẩn DNA 1000 bp (Hình 3.9) Hình 3.21 Kết điện di gel agarose 1% ADN nhiễn sắc thể xạ khuẩn 4VH4 ADN sau chiết tách gửi giải trình tự 16S rADN cơng ty TNHH Nam Khoa, Trình tự 16S rADN phân tích Blast NCBI, có độ tương đồng 100% lồi Streptomyces albus (hình 3.10, phụ lục 3) Hình 3.22 Kết phân tích trình tự 16S rADN cơng cụ Blast NCBI Tiếp theo, chủng 4VH4 so sánh đặc điểm với lồi Streptomyces albus mơ tả theo tài liệu DSMZ khóa phân loại Bergey (Bảng 3.2) Bảng 3.9 So sánh đặc điểm hình thái, sinh hóa chủng 4VH4 với S albus Đặc điểm Mơi trường Chủng 4VH4 S albus Màu sắc khuẩn ty ISP2 Vàng (Broom yellow) Vàng chất ISP4 Ngà (Ivory) Ngà (Ivory) ISP5 Be (Beige) Vàng SC Vàng (Traffic yellow) - MYA Vàng (Traffic yellow) - Trắng (Cream) Trắng ISP4 Trắng (Traffic White) Trắng ISP5 Trắng (Traffic White) Trắng SC Trắng (Traffic White) - MYA Trắng (Traffic White) - Catalase - NR Oxidase + NR Urease + + Gelatinase - +/- Cellulase + NR Thủy phân tinh bột - NR Lipase + NR Màu sắc khuẩn ty ISP2 khí sinh Ghi chú: NR (not reported): chưa có báo cáo, (+): dương tính, (-): âm tính Xạ khuẩn 4VH4 có khả sử dụng loại đường xylose, raffinose, sucrose, mannitol, glucose, fructose tương tự S albus Đối chiếu đặc điểm hình thái, sinh hóa chủng 4VH4 với tài liệu DSMZ, chủng 4VH4 có đặc điểm tương đồng với loài S albus TG Pridham, AJ Lyons Jr mô tả năm 1961 90 3.3 Khảo sát môi trường lên men chủng xạ khuẩn thu chất kháng vi sinh vật 3.3.1 Môi trường lên men lỏng Tăng sinh cấp 1: chủng 4VH4 hoạt hóa môi trường TSB lỏng ngày với tốc độ lắc 150 vòng/phút Bổ sung 1,5 ml dịch tăng sinh cấp vào bình nón chứa 28,5 ml môi trường ISP2, MYA, YIM308, YIM310, SSY, Gause (tỷ lệ tiếp giống 5%), ni cấy lắc 180 vịng/phút nhiệt độ phòng Thử nghiệm lặp lại lần với môi trường Sau ngày nuôi cấy tiến hành đánh giá sơ hoạt tính kháng vi sinh vật dịch nuôi cấy phương pháp giếng khuếch tán Bảng 3.10 Đường kính vịng ức chế vi sinh vật thử nghiệm dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 môi trường khác (mm) Môi trường ISP2 MYA SSY Gause Vi sinh vật K pneumoniae E coli YIM 308 310 26,27 ± 22,03 ± - 15,70 ± 11,33 ± - 0,25 0,17 0,25 - - 0,42 14,27 ± 10,20 ± 0,12 MRSA YIM - 0,26 27,93 ± 26,33 ± - 15,83 ± 12,50 ± - 0,15 0,15 0,12 0,44 P aeruginosa - - - - - - E faecalis - - - - - - C albicans - - - - - - (-) khơng có hoạt tính kháng khuẩn Bảng 3.3 cho thấy chủng 4VH4 có hoạt tính kháng vi khuẩn gram âm tốt K. pneumoniae kháng vi khuẩn gram dương tốt MRSA, môi trường ISP2 cho đường kính vịng ức chế lớn so với mơi trường Gause YIM308 (khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05, phụ lục 4) Do đó, chúng tơi lựa chọn mơi trường ISP2 để tiếp tục khảo sát nồng độ thành phần môi trường Trong mơi trường lên men, đường kính vịng ức chế lớn sử dụng mơi trường có nguồn nitơ chiết xuất nấm men (đường kính vịng ức chế mơi trường ISP2 MYA khác biệt có ý nghĩa thống kê so với môi trường Gause YIM308, p < 0,05, phụ lục 4) Chiết xuất nấm men nguồn nitơ phức tạp, chứa nhiều protein Khảo sát với môi trường Gause YIM 308 có thành phần tinh bột tan chiếm hàm lượng cao cho thấy hoạt tính kháng K pneumoniae MRSA Qua khảo sát sơ bộ, xạ khuẩn 4VH4 cho hoạt tính tốt vi khuẩn gram âm (K. pneumoniae E coli) Vì vậy, chúng tơi chọn K pneumoniae để thử nghiệm cho nghiên cứu Do môi trường ISP2 có nguồn carbon nitơ đa dạng nên sử dụng môi trường để khảo sát nồng độ thành phần với mục đích giảm chi phí lên men quy mơ lớn 3.3.2 Nồng độ carbohydrat Các thành phần môi trường thay đổi dựa hàm lượng glucose chiết xuất mạch nha môi trường ISP2 tác giả Shirling Gottlieb, nhằm thu kháng sinh với suất cao có hiệu kinh tế 91 Xạ khuẩn 4VH4 ni cấy mơi trường ISP2 có thay đổi nồng độ glucose khoảng 1,0 – 4,0 g/l nồng độ chiết xuất mạch nha khoảng 2,0 – 10,0 g/l - Nồng độ glucose Hình 3.23 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch ni cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ glucose khác Nhận xét: đường kính vịng ức chế lớn nồng độ glucose 3,0 g/l 4,0 g/l, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 1,0 2,0 g/l Hai nồng độ 3,0 g/l 4,0 g/l có đường kính vịng ức chế khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,16 > 0,05), lựa chọn nồng độ glucose g/l để giảm chi phí lên men thu kháng sinh (Hình 3.11) - Nồng độ chiết xuất mạch nha Hình 3.24 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ chiết xuất mạch nha khác Chiết xuất mạch nha nồng độ 4,0 – 10,0 g/l cho đường kính vịng ức chế từ 25,77 – 26,17 mm, nồng độ khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,27 > 0,05) Do lựa chọn mơi trường ISP2 với nồng độ glucose 3,0 g/l nồng độ chiết xuất mạch nha 4,0 g/l để lên men thu kháng sinh (Hình 3.12) 3.3.3 Nồng độ nitơ Sau xác định nồng độ glucose chiết xuất mạch nha, dựa hàm lượng nitơ môi trường ISP2, khảo sát nồng độ chiết xuất nấm men khoảng 1,0 – 4,0 g/l Ở nồng độ chiết xuất nấm men 1,0 g/l cho đường kính ức chế khoảng 6,90 mm, lượng chất kháng khuẩn có xu hướng giảm cung cấp hạn chế nguồn nitơ Ở nồng độ chiết xuất nấm men 3,0 g/l 4,0 g/l, đường kính vịng ức chế cao nhất, khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nồng độ 1,0 2,0 g/l (p < 0,05, phụ lục 8) Giữa nồng độ 3,0 g/l 4,0 g/l, đường kính vịng ức chế khác khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,16 >0,05), chọn nồng độ chiết xuất nấm men 3,0 g/l mơi trường lên men thu kháng sinh (Hình 3.13) Hình 3.25 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ chiết xuất nấm men khác Sau khảo sát nồng độ thành phần, môi trường ISP2 cải tiến (3 g/l glucose, g/l chiết xuất mạch nha g/l chiết xuất nấm men) sử dụng để thực thử nghiệm 3.3.4 pH Xạ khuẩn 4VH4 nuôi cấy lắc 180 vịng/phút, nhiệt độ phịng với mơi trường ISP2 có pH khác nhau, pH điều chỉnh dung dịch NaOH dung dịch HCl để đạt pH 3, 5, 7, 9, 11 Dịch nuôi cấy đánh giá hoạt tính kháng khuẩn phương pháp giếng khuếch tán, ghi nhận đường kính vịng ức chế (Hình 3.14) Hình 3.26 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường ISP2 cải tiến có pH khác Hoạt tính kháng K pneumonia thể tốt pH 7, đường kính vịng ức chế dịch nuôi cấy pH khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,81 > 0,05) Môi trường ISP2 chưa điều chỉnh NaOH HCl có pH khoảng 6-7, phù hợp để lên men xạ khuẩn thu dịch nuôi cấy 3.3.5 Khảo sát thời gian lên men xạ khuẩn 4VH4 Sử dụng môi trường lên men ISP2 cải tiến với thành phần khảo sát glucose 3 g/l, chiết xuất mạch nha g/l chiết xuất nấm men g/l, pH 7, thời gian lên men thu sản phẩm có hoạt tính kháng khuẩn cao khảo sát khoảng – 10 ngày ni cấy (Hình 3.15) Hình 3.27 Đường kính vịng ức chế K pneumpniae dịch nuôi cấy xạ khuẩn 4VH4 với môi trường ISP2 cải tiến theo thời gian Từ thời điểm ngày thứ 3, dịch nuôi cấy xạ khuẩn S albus 4VH4 bắt đầu có hoạt tính kháng khuẩn, từ ngày đến ngày 10 đường kính vịng ức chế đạt cao ngày này, đường kính vịng ức chế khơng có khác biệt đáng kể Do thời điểm ngày thứ chọn để kết thúc q trình lên men thu dịch ni cấy 3.4 Xác định hợp chất kháng vi sinh vật 3.4.1 Chiết cao toàn phần từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 Xạ khuẩn 4VH4 nuôi cấy môi trường ISP2 cải tiến, lắc tốc độ 180 vòng/phút, nhiệt độ phịng, thu dịch ni cấy sau ngày Chiết dịch nuôi cấy xạ khuẩn với dung môi EA, DCM n-butanol Dịch chiết EA DCM loại tồn dung mơi, thu cắn khơ n-butanol dung môi phân cực mạnh nhất, cắn dịch chiết n-butanol có dạng sánh đặc; thành phần đường, polysaccarid dịch chiết Các dịch chiết có hoạt tính kháng K. pneumoniae Dịch chiết DCM n-butanol có đường kính vịng ức chế lớn Dịch chiết DCM thu cắn khơ có ưu điểm dễ loại bỏ dung môi so với n-butanol nên cao chiết DCM dùng cho thử nghiệm (Hình 3.16) Hình 3.28 Khả ức chế K pneumoniae cao toàn phần từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 với dung môi khác Từ 15 l môi trường ISP2 cải tiến nuôi cấy 4VH4, sau lọc bỏ sinh khối thu 10,1 l dịch nuôi cấy Chiết dịch nuôi cấy với DCM cô dịch chiết đến cắn thu 812 mg cao DCM Cao chiết dùng để khảo sát SKLM sắc ký cột thu cao phân đoạn 3.4.2 Xác định hoạt tính kháng khuẩn cao toàn phần phương pháp hình sinh học Triển khai sắc ký lớp mỏng cao chiết tồn phần DCM với hệ dung mơi: EA MeOH (4:3), n-Hexan - EA - MeOH (2:6:2), n-Hexan - EA - MeOH (1:4:3) EA - MeOH - H2O (100:17:13), hệ dung môi EA - MeO - H2O (100:17:13) cho vết tách tốt sắc ký đồ nên chọn để triển khai sắc ký lớp mỏng thực kỹ thuật hình sinh học (Phụ lục 14) (a) (b) Hình 3.29 Xác định vết có hoạt tính kháng K. pneumoniae cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 kỹ thuật hình sinh học (a) SKLM cao tồn phần DCM với hệ dung mơi EA - MeOH - H2O (100:17:13) (b) Tự sinh đồ SKLM cao toàn phần DCM Vết sắc ký có Rf = 0,62 cho thấy hoạt tính kháng K pneumoniae với đường kính vịng ức chế 22 mm (Hình 3.17) 3.4.3 Thu cao phân đoạn sắc ký cột cổ điển 3.4.3.1 Sắc ký cột Triển khai sắc ký cột pha thuận để tách phân đoạn với điều kiện sắc ký sau: - Mẫu: 812 mg cao DCM - Cột: cột thủy tinh trung tính kích thước 2,5 x 45 cm - Pha động: dung môi từ phân cực đến phân cực n-hexan: diclomethan: ethyl acetat: methanol - Thể tích hứng ống nghiệm: 10 ml - Chuẩn bị mẫu: hịa tan tồn mẫu ml DCM Sau đó, mẫu trộn với 1,2 g pha tĩnh silica gel nhằm thu bột chất mịn, tơi xốp, khô - Nhồi cột ổn định cột: pha tĩnh nhồi vào cột phương pháp nạp cột ướt ổn định pha động - Nạp mẫu: nạp mẫu phương pháp nạp mẫu dạng bột khô - Gộp ống nghiệm có vết sắc ký đồ tương tự thu phân đoạn (Hình 3.18 bảng 3.4) 10,1 l dịch nuôi cấy xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP2 cải tiến Lắc phân bố với dung mơi DCM 812 mg cao tồn phần DCM Thu cao phân đoạn F1 F2 F3 F4 F5 F6 28 mg Khơng có hoạt tính kháng khuẩn Hình 3.30 Sơ đồ thu nhận phân đoạn F1-F6 từ cao chiết toàn phần DCM Hiệu suất chiết phân đoạn F6 so với cao toàn phần 3,4% Bảng 3.11 Các phân đoạn sắc ký cột Phân đoạn Dung môi F1 n-hexan, DCM F2 n-hexan, DCM F3 n-hexan, DCM F4 DCM F5 DCM, EA DCM, EA, F6 Methanol Tỉ lệ dung môi n-hexan (100%), n-hexan - DCM (90:10 đến 70:30) n-hexan - DCM (60:40 đến 30:70) n-hexan - DCM (20:80 đến 10:90), DCM 100% DCM 100% DCM (100%), DCM - EA (90:10 đến 80:20) DCM - EA (70:30 đến 10:90), EA 100%, EA - Methanol (90:10 đến 10:90), Methanol 100% Thử hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn phương pháp đĩa giấy khuếch tán, xác định phân đoạn phân đoạn chứa hợp chất kháng khuẩn (Hình 3.19) (a) (b) Hình 3.31 Khả ức chế K pneumoniae phân đoạn thu từ cao chiết DCM (a) phân đoạn từ cao chiết DCM, (b) kháng sinh đối chứng ciprofloxacin µg 3.4.3.2 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phân đoạn F6 Phân đoạn (F6) tiếp tục triển khai sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi EA - MeOH - H2O (100:17:13) khảo sát hoạt tính kháng khuẩn kỹ thuật hình sinh học Tự sinh đồ phân đoạn cho thấy có vết có hoạt tính kháng khuẩn vết số 6, có Rf = 0,62 tương ứng với vết có hoạt tính xác định cao toàn phần, vết tắt quang UV 365 quan sát ánh sáng khả kiến (Hình 3.20 3.21) Hình 3.32 SKLM phân đoạn F6 triển khai với hệ dung môi EA - MeOH - H2O (100:17:13) quan sát UV 365 nm, UV 254 nm, ánh sáng khả kiến (a) (b) Hình 3.33 Xác định vết có hoạt tính kháng K pneumoniae phân đoạn F6 cao chiết DCM kỹ thuật hình sinh học (a) Tự sinh đồ SKLM phân đoạn F6, (b) Tự sinh đồ vết cắt từ SKLM phân đoạn F6 3.4.4 Phân tích LC-MS cao tồn phần DCM phân đoạn F6 Cao chiết toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 cao phân đoạn F6 gửi phân tích hệ thống khối phổ MS 6545 series Q-TOF (Agilent) hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1900 (USA) với cột Xterra C18, 4,6 × 50 mm, 2,5 µm So sánh sắc ký đồ LC phân đoạn F6 cao toàn phần DCM, thành phần trùng thời gian lưu (RT) có hoạt tính khoảng RT 9,2-9,8 (Hình 3.22 3.23) Dự đốn cơng thức chất chuyển hóa phân tích HR-LC-MS, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) với nguồn ion hóa phun điện tử (ESI) phân tử trùng cao toàn phần phân đoạn F6 khoảng RT 9,2 – 9,8 Hình 3.34 Sắc ký đồ LC cao toàn phần DCM từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 Hình 3.35 Sắc ký đồ LC phân đoạn F6 cao chiết DCM Kết phổ HR-ESI-MS cho mảnh ion dương m/z [M+H] + 507,1505, với khối lượng phân tử xác định 506,1432 Da, cơng thức phân tử dự đốn C25H22N4O8 C22H14N14O2 (Hình 3.24) Hình 3.36 Phổ HR-ESI-MS hợp chất phân đoạn F6 cao chiết DCM Dự đoán theo chương trình Masshunter Qualitative Agilent, phân tích phổ HR-ESIMS cao tồn phần DCM, cao chiết chứa số hợp chất trình bày bảng 3.5 Bảng 3.12 Một số chất có hoạt tính sinh học dự đốn có cao tồn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 chương trình Masshunter Qualitative Agilent STT Hợp chất dự đoán Cyclo(4-hydroxy-S- Cơng thức Khối Thời Hoạt tính phân tử dự lượng gian sinh học đốn xác lưu C16H17N3O3 299,12 8,056 Độc tế bào C15H10N2O 234,079 8,499 Độc tế bào C18H20N2 264,1623 8,527 Điều trị trầm Pro-S-Trp) 5H-Indolo[3,2-B] Quinolin-11(10H)One Mianserin cảm N-[2-(5-methyl-1H- C13H16N2O 216,1266 8,639 Ức chế thụ indol-3- thể yl)ethyl]acetamide melatonin Atenolol C14H22N2O3 266,1643 10,19 Thuốc chẹn beta, điều trị tăng huyết áp đau ngực liên quan tim 3.4.5 MIC cao toàn phần DCM phân đoạn F6 Cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 phân đoạn F6 cao chiết thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu phương pháp vi pha loãng phiến nhựa 96 giếng Kết thu MIC cao toàn phần DCM K pneumoniae, E coli, MRSA, MSSA µg/ml, µg/ml, 64 µg/ml, 32 µg/ml MIC phân đoạn F6 K pneumoniae, E coli, MRSA, MSSA 0,25 µg/ml, µg/ml, µg/ml, µg/ml (Hình 3.24 3.25) MIC K pneumonia e µg/ ml MIC E coli µg/ ml MIC 64 MRSA µg/ ml MIC 32 MSSA µg/ ml Hình 3.37 MIC cao tồn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 vi khuẩn thử nghiệm Ghi chú: giếng khoanh tròn giếng có nồng độ MIC Nồng độ chất thử giếng (µg/ml): giếng (512), giếng (256), giếng (128), giếng (64), giếng (32), giếng (16), giếng (8), giếng (4), giếng (2), giếng 10 (1), giếng 11 (0,5), giếng 12 (0,25), giếng 13 (0,125), giếng 14 (0,0625), giếng 15 (0,03125), giếng 16 (0,015625) MIC K pneumoniae 0,25 µg/ml MIC E coli µg/ml MIC MRSA µg/ml MIC MSSA µg/ml Hình 3.38 MIC phân đoạn F6 cao chiết DCM vi khuẩn thử nghiệm Ghi chú: giếng khoanh tròn giếng có nồng độ MIC Nồng độ chất thử giếng (µg/ml): giếng (512), giếng (256), giếng (128), giếng (64), giếng (32), giếng (16), giếng (8), giếng (4), giếng (2), giếng 10 (1), giếng 11 (0,5), giếng 12 (0,25), giếng 13 (0,125), giếng 14 (0,0625), giếng 15 (0,03125), giếng 16 (0,015625) CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm sinh học định danh chủng xạ khuẩn 4VH4 - Xạ khuẩn 4VH4 có đặc điểm hình thái sinh lý – sinh hóa:  Đặc điểm hình thái: khuẩn ty chất có màu vàng, khuẩn ty khí sinh có màu trắng sinh sắc tố nâu môi trường ISP2 MYA  Đặc điểm sinh lý – sinh hóa: xạ khuẩn 4VH4 có khả sử dụng loại đường xylose, raffinose, sucrose, mannitol, glucose, fructose; khả sinh enzym catalase, urease, cellulase lipase Như vậy, theo mô tả tài liệu DSMZ khóa phân loại Bergey, xạ khuẩn 4VH4 có đặc điểm hình thái phù hợp với chi Streptomyces 83,92 - Trình tự 16S rADN xạ khuẩn 4VH4 có độ tương đồng 100% với loài Streptomyces albus Tuy nhiên, số lồi xạ khuẩn có trình tự gen 16S rADN tương đồng nên để xác định xác, cần phải kết hợp phân loại theo phương pháp truyền thống phương pháp sinh học phân tử Đề tài so sánh đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa với định danh dựa đoạn gen 16S rADN xác định xạ khuẩn 4VH4 thuộc loài S albus S albus lồi Streptomyces có phân bố địa lý rộng rãi phân lập từ môi trường đa dạng bao gồm đất, bọt biển, trầm tích biển 93-96 Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu cho thấy S albus phân lập từ địa y Đây loài xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp nhiều loại kháng sinh strepturidin, kháng sinh nhóm butenolid dẫn xuất phthalaldehyd, số kháng sinh nhóm polyketid/nonribosomal peptid salimycin, oxazolomycin, porothramycin, salimycin phê duyệt sử dụng ngành chăn ni thú y 97-101 Ngồi ra, chủng S albus J1074 sử dụng rộng rãi cho nghiên cứu biểu dị hợp gen kích thước nhỏ (6,8 Mb) 102 Trong nghiên cứu tin sinh học “Sự đa mức độ chủng trình sinh tổng hợp chất thứ cấp S albus”, Ryan F Seipke cộng phân tích chủng S. albus, xác định cụm gen sinh tổng hợp chất chuyển hóa thứ cấp (smBGCs) đặc hiệu chủng, phản ánh đa dạng hóa học cấp độ chủng, cho thấy chủng thuộc lồi có cụm gen sinh tổng hợp hợp chất đặc trưng cho chủng Nhiều cụm gen mã hóa Streptomyces khơng biểu điều kiện phịng thí nghiệm Do đó, để khai thác tối đa tiềm sinh tổng hợp sinh vật này, phương pháp tiếp cận tin sinh học, kích thích biểu gen đồng nuôi cấy thúc đẩy việc khám phá hợp chất 103 4.2 Xác định môi trường lên men xạ khuẩn 4VH4 - Xạ khuẩn 4VH4 khảo sát mơi trường lên men đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật vi khuẩn K pneumoniae, E coli, MRSA, P aeruginosa, E faecalis vi nấm C albicans Khi nuôi cấy môi trường ISP2, MYA, Gause 1, YIM308, chủng S albus 4VH4 cho hoạt tính ức chế sinh trưởng K. pneumoniae, E coli MRSA Ngồi ra, S albus 4VH4 ni cấy mơi trường có thành phần chiết xuất nấm men cho hoạt tính kháng vi sinh vật thử nghiệm cao nên môi trường ISP2 (gồm nguồn carbohydrat: glucose, chiết xuất mạch nha nguồn nitơ chiết xuất nấm men) lựa chọn để thực lên men chủng xạ khuẩn Trong nghiên cứu Okami cộng cho thấy bổ sung chiết xuất nấm men vào môi trường tăng trưởng xạ khuẩn Streptomyces sp phân lập từ vùng biển giúp tối đa hóa lượng kháng sinh thu 30 Nhiều nghiên cứu lựa chọn ISP2 mơi trường thích hợp để lên men thu kháng sinh từ xạ khuẩn 104-106 Một số nghiên cứu khác sử dụng môi trường ISP2 cải tiến để sản xuất chất kháng khuẩn, nghiên cứu Balasubramanian S cộng sử dụng môi trường ISP2 cải tiến (2,5 g/l chiết xuất mạch nha, 1,0 g/l chiết xuất nấm men D-mannitol 25 mM) lên men Streptomyces SBT343, báo cáo Dezfully NK cộng lựa chọn môi trường ISP2 bổ sung tinh bột lên men Streptomyces flavogriseus cho hoạt tính tốt 107 - Hàm lượng carbon nitơ môi trường ảnh hưởng đến khả sinh chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật chủng S albus 4VH4 Trong nghiên cứu chúng tôi, môi trường ISP2 lựa chọn để lên men S. albus, kết khảo sát nồng độ thành phần carbohydrat nguồn nitơ để thu hoạt chất kháng khuẩn g/l glucose, g/l chiết xuất mạch nha, g/l chiết xuất nấm men Kết tương đồng với nghiên cứu LTH Tan, nồng độ chiết xuất nấm men nằm khoảng 0,3 – 1% (kl/tt) giúp tăng hoạt tính kháng khuẩn Streptomyces sp., báo cáo P Sharma cộng cho thấy môi trường lên men Streptomyces sp. GBTPR-167 với nồng độ glucose 0,125-0,25% (kl/tt) cho hoạt tính kháng khuẩn tốt 108,109 Trong nghiên cứu khác Abdelghani cộng sự, môi trường lên men với nồng độ chiết xuất mạch nha 1% (kl/tt), Streptomyces albovinaceus cho hoạt tính kháng khuẩn tốt 110 Tuy nhiên nghiên cứu chúng tơi dịch lên men S albus 4VH4 có hoạt tính tương đương mơi trường có nồng độ chiết xuất mạch nha khác 1; 0,8; 0,6 0,4% (kl/tt), điều nhu cầu dinh dưỡng khác giai đoạn sản sinh chất thứ cấp có hoạt tính lồi Streptomyces spp 111,112 Vì vậy, cần phải khảo sát nhiều môi trường lên men nồng độ thành phần (nguồn carbon, nguồn nitơ) để tăng suất sản xuất kháng sinh mang lại hiệu kinh tế - Các thơng số q trình lên men cần kiểm sốt để tối ưu hóa khả sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học Trong nghiên cứu này, điều kiện lên men nồng độ thành phần, pH thời gian lên men khảo sát nhằm tăng suất mang lại hiệu kinh tế Dịch lên men S albus 4VH4 thể hoạt tính kháng khuẩn tốt pH 7, sau thời gian nuôi cấy ngày Những kết tương đồng với nghiên cứu S Barbuto Ferraiuolo cộng chủng S. albus tái tổ hợp với thời gian nuôi cấy ngày để sản xuất kháng sinh apigenin 113 Phần lớn nghiên cứu cho thấy thời gian lên men thông thường để thu kháng sinh Streptomyces spp từ 4 đến ngày 114-116 Thời gian lên men ngắn không đủ để chủng vi sinh vật tạo kháng sinh, thời gian lên men q dài giảm hoạt tính kháng sinh hiệu kinh tế 117 Kết khảo sát pH phù hợp với báo cáo Kutzer Locci, đa số loài Streptomyces phát triển tốt pH trung tính kiềm 6,5 – 8, sản xuất kháng sinh tốt pH trung tính 111,118-122 4.3 Hợp chất kháng khuẩn cao toàn phần DCM cao phân đoạn F6 từ dịch lên men xạ khuẩn 4VH4 - Hoạt tính kháng khuẩn cao toàn phần DCM cao phân đoạn F6 Xạ khuẩn S albus 4VH4 cho hoạt tính kháng K pneumoniae, E coli MRSA môi trường ISP2 Dịch lên men lắc phân bố với DCM tiến hành sắc ký cột, thu phân đoạn phân đoạn (F6) có hoạt tính kháng vi sinh vật SKLM phân đoạn với hệ dung môi EA - MeOH - H 2O (100:17:13) thử nghiệm hình sinh học phát vết Rf = 0,62 có hoạt tính kháng khuẩn Một số nghiên cứu phổ kháng khuẩn dịch lên men S albus nghiên cứu F Santos-Beneit cộng sử dụng môi trường nuôi cấy R5A, Bennet SM17; chiết xuất với dung mơi ethyl acetat cao chiết cho hoạt tính kháng C. albicans, khơng thể hoạt tính kháng MRSA 123 Trong nghiên cứu khác, S albus G nuôi cấy môi trường gồm glucose, dịch ngơ chất khống; dịch lên men chiết xuất với cloroform - ethyl acetat (2:1) thu kháng sinh có hoạt tính kháng mạnh S aureus, kháng yếu K pneumoniae E. coli 124 Sự khác hoạt tính dịch lên men S albus số chủng vi khuẩn gây bệnh khác nguồn phân lập, vị trí địa lý, thành phần mơi trường ni cấy dung môi chiết xuất MIC cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 K pneumoniae, E coli, MRSA, MSSA µg/ml, µg/ml, 64 µg/ml, 32 µg/ml Trong thử nghiệm đánh giá sơ hoạt tính kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán qua giếng, dịch lên men S albus 4VH4 môi trường ISP2 cho đường kính vịng ức chế K pneumoniae MRSA 26,27 ± 0,25 mm 27,93 ± 0,15 mm, giá trị tương đương thử nghiệm định lượng phương pháp vi pha loãng, cao toàn phần DCM cho giá trị MIC K pneumoniae (2 µg/ml) mạnh 32 lần so với MRSA (64 µg/ml) Điều khả khuếch tán khác chất dịch nuôi cấy môi trường thạch MIC gentamicin K pneumoniae E coli < 0,5 µg/ml MIC vancomycin MRSA µg/ml, MSSA < 0,5 µg/ml Như vậy, vi khuẩn thử nghiệm nhạy với kháng sinh đối chứng theo CLSI M100 – S29 125 MIC phân đoạn F6 K. pneumoniae 0,25 µg/ml (tương đương với gentamicin), E coli µg/ml (yếu so với gentamicin), MRSA MSSA µg/ml µg/ml (yếu so với vancomycin) Số liệu cho thấy chất kháng khuẩn phân đoạn F6 cao chiết DCM từ dịch lên men S. albus 4VH4 ức chế tốt vi khuẩn gram âm, đặc biệt với K pneumoniae - Dự đốn cơng thức hợp chất kháng khuẩn Phân tích phổ LC – MS cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 cao phân đoạn F6 để dự đốn cơng thức hợp chất có hoạt tính HR-ESI-MS phân đoạn F6 cho thấy mảnh ion [M+H]+ 507,1505, hợp chất dự đốn có khối lượng phân tử 506,15 Da, công thức phân tử C 25H22N4O8 C22H14N14O2 Trong nghiên cứu Appadurai Muthamil Iniyan cộng sự, dịch chiết ethyl acetat S. albus ICN33 phân lập từ biển cho dự đoán hợp chất có khối lượng phân tử 506 Da, có hoạt tính kháng MRSA E. coli, khơng có hoạt tính kháng K. pneumoniae 126 Từ sở liệu Human Metabolome Database (HMDB), Spectrabase, GNPS, dự đốn cơng thức phân tử C 25H22N4O8 phù hợp với streptonigrin (506,46 g/mol) phân lập từ Actinomyces albus Tuy nhiên, công thức phân tử thứ dự đốn C22H14N14O2 khơng tìm thấy kết phù hợp Hợp chất chuyển hóa m/z [M+H] + 507 phân tích LC-MS-MS hệ thống sắc ký lỏng siêu cao áp Agilent 1900 (USA) hệ thống khối phổ MS 6545 series Q-TOF (Agilent) để so sánh phân mảnh với phổ LC-MS-MS sở liệu (Hình 4.1 bảng 4.1) Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Các ion phân mảnh phổ kháng khuẩn phân đoạn F6 cao chiết DCM khơng hồn tồn phù hợp với liệu streptonigrin sở liệu Human Metabolome Database GNPS (Bảng 4.1 bảng 4.2), không loại trừ khả phân đoạn F6 chứa hợp chất kháng khuẩn khác Khối lượng công thức phân tử dự đốn tương ứng với nhiều cơng thức hóa học khác nhau, cần tinh khiết hóa hợp chất phân tích phổ NMR sử dụng chất chuẩn streptonigrin phân tích LC – MS để xác định xác cấu trúc hóa học phân tử 127 Bảng 4.13 So sánh MIC phân đoạn F6 cao chiết DCM streptonigrin vi khuẩn thử nghiệm MIC MRSA MSSA E coli K pneumoniae Phân đoạn F6 µg/ml µg/ml µg/ml 0,25 µg/ml Streptonigrin 0,78 µg/ml NR 100 µg/ml NR Ghi chú: NR (not reported): chưa có báo cáo Hình 4.39 Phổ LC-MS-MS hợp chất dự đoán phân đoạn F6 cao chiết DCM Bảng 4.14 So sánh m/z phân mảnh hợp chất dự đốn phân đoạn F6 cao chiết DCM streptonigrin sở liệu Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Hợp chất chuyển hóa [M+H]+ streptonigrin [M+H]+ streptonigrin m/z [M+H]+ 507 theo GNPS theo HMDB 61,0286 350,1133 73,0290 242,2847 385,0933 191,0708 274,2744 403,1033 216,0661 327,2351 413,0872 336,0984 343,2302 431,0981 364,1297 401,2878 461,1451 378,1090 489,1414 489,1398 394,1089 507,1519 507,1505 403,1042 408,1196 461,1461 490,1250 Ghi chú: số tô đậm phân mảnh trùng hợp chất chuyển hóa m/z [M+H] + 507 [M+H]+ streptonigrin theo GNPS Đối với hợp chất khơng có sở liệu, dự đốn RT (trong điều kiện sắc ký) xem cơng cụ hữu ích để phân biệt phân tử dựa khối phổ có độ phân giải thấp (LRMS) khối phổ độ phân giải cao (HRMS) LC kết hợp với UV/Vis, MS NMR cung cấp nhiều thông tin thành phần hợp chất mẫu So với phương pháp truyền thống, phân tích LC-MS nhanh, nhạy phù hợp để xác định đặc điểm chất trung gian, chất chuyển hóa dịch ni cấy giúp làm rõ thay đổi chuyển hóa sau phân lập chủng cải tiến 88 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Sau thời gian thực đề tài, đạt mục tiêu đề với kết sau: - Mô tả đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn bao gồm đặc điểm hình thái màu sắc khuẩn ty chất (vàng), màu sắc khuẩn ty khí sinh (trắng) sinh sắc tố môi trường ISP2, ISP4, ISP5, MYA, SC Khảo sát khả sinh enzym, xạ khuẩn 4VH4 có khả sinh enzym: catalase, urease, cellulase lipase - Chiết ADN xạ khuẩn 4VH4, giải trình tự gen 16S rADN phân tích dựa ngân hàng liệu NCBI Kết định danh dựa trình tự gen 16S rADN cho thấy chủng xạ khuẩn 4VH4 tương đồng 100% với loài Streptomyces albus - Xác định môi trường lên men chủng xạ khuẩn thu chất kháng vi sinh vật môi trường ISP2 cải tiến với nồng độ thành phần carbohydrat g/l glucose, g/l chiết xuất mạch nha, thành phần nitơ g/l chiết xuất nấm men pH - Thu cao toàn phần DCM từ dịch lên men S albus 4VH4 phân đoạn F6 cao chiết DCM có hoạt tính kháng khuẩn Bằng phương pháp LC-MS, phân đoạn F6 chứa hợp chất kháng khuẩn dự đoán có cơng thức phân tử C25H22N4O8 C22H14N14O2 với khối lượng phân tử 506,15 Da - Xác định MIC cao toàn phần DCM phân đoạn F6 phương pháp vi pha loãng phiến nhựa 96 giếng vi khuẩn E coli, K. pneumoniae, MRSA, MSSA Đặc biệt MIC phân đoạn F6 K. pneumoniae 0,25 µg/ml, tương đương gentamicin 5.2 Đề nghị - Xác định cấu trúc hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật có phân đoạn F6 phổ NMR - Khảo sát đồng nuôi cấy S albus 4VH4 với xạ khuẩn khác phân lập từ địa y Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn vi khuẩn gây bệnh khác để đánh giá tiềm sản xuất kháng sinh - Khảo sát hoạt tính sinh học khác phân đoạn - Tìm kiếm nhóm gen chịu trách nhiệm sinh tổng hợp hợp chất polyketid nonribosomal peptid – hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học thường tìm thấy chi Streptomyces Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn TÀI LIỆU THAM KHẢO WHO New report calls for urgent action to avert antimicrobial resistance crisis Joint News Release Accessed 15/07/2021, https://www.who.int/news/item/2904-2019-new-report-calls-for-urgent-action-to-avert-antimicrobial-resistancecrisis Jensen PR, Dwight R, Fenical W Distribution of actinomycetes in near-shore tropical marine sediments Applied and environmental microbiology 1991;57(4):1102-1108 González I, Ayuso-Sacido A, Anderson A, Genilloud O Actinomycetes isolated from lichens: evaluation of their diversity and detection of biosynthetic gene sequences FEMS microbiology ecology 2005;54(3):401-415 doi:10.1016/j.femsec.2005.05.004 Cardinale M, Puglia AM, Grube M Molecular analysis of lichen-associated bacterial communities FEMS Microbiology Ecology 2006;57(3):484-495 doi:10.1111/j.1574-6941.2006.00133.x Yamamura H, Ashizawa H, Nakagawa Y, et al Actinomycetospora iriomotensis sp nov., a novel actinomycete isolated from a lichen sample The Journal of antibiotics 2011;64(4):289-292 doi:10.1038/ja.2011.15 Li B, Xie C-H, Yokota A Nocardioides exalbidus sp nov., a novel actinomycete isolated from lichen in Izu-Oshima Island, Japan Actinomycetologica 2007:0705170020-0705170020 Suzuki MT, Parrot D, Berg G, Grube M, Tomasi S Lichens as natural sources of biotechnologically relevant bacteria Applied microbiology and biotechnology 2016;100(2):583-595 Dobson FS Lichens: an illustrated guide to the British and Irish species Richmond Publishin; 2005 Hale ME The biology of lichens The biology of lichens 1967:428 10 Tehler A, Wedin M Systematics of lichenised fungi Lichen biology 2008:336352 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 11 Kershaw KA Physiological ecology of lichens Cambridge University Press; 1985 12 Brodo IM, Sharnoff SD, Sharnoff S Lichens of north America Yale University Press; 2001 13 Ahmadjian V The lichen symbiosis John Wiley & Sons; 1993 14 Last of the Lichens Accessed 16/10/2022, http://hiltonpond.org/ThisWeek010222.html 15 Hollinger J The lichen Flavoparmelia caperata (L.) Hale Specimen photographed in Castro Crest, Malibu Creek State Park, Los Angeles Co., California, USA 16 Alpine Lichens Accessed 16/10/2022, https://teara.govt.nz/en/photograph/10992/alpine-lichens-ist-of-2 17 Honegger R Functional aspects of the lichen symbiosis Annual review of plant biology 1991;42(1):553-578 doi:10.1146/annurev.pp.42.060191.003005 18 Genkel P, Plotnikova T Nitrogen-fixing bacteria in lichens Izvestiia Akademii nauk SSSR Seriia biologicheskaia 1973;6:807-813 19 Grimm M, Grube M, Schiefelbein U, Zühlke D, Bernhardt J, Riedel K The Lichens’ Microbiota, Still a Mystery? Frontiers in Microbiology 2021;12:714 doi:10.3389/fmicb.2021.62383 20 Calcott MJ, Ackerley DF, Knight A, Keyzers RA, Owen JG Secondary metabolism in the lichen symbiosis Chemical Society Reviews 2018;47(5):1730-1760 doi:10.1039/c7cs00431a 21 Hodkinson BP, Lutzoni F A microbiotic survey of lichen-associated bacteria reveals a new lineage from the Rhizobiales Symbiosis 2009;49(3):163-180 doi:10.1007/s13199-009-0049-3 22 Schneider T, Schmid E, de Castro Jr JV, et al Structure and function of the symbiosis partners of the lung lichen (Lobaria pulmonaria L Hoffm.) analyzed by metaproteomics Proteomics 2011;11(13):2752-2756 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 23 Eymann C, Lassek C, Wegner U, et al Symbiotic interplay of fungi, algae, and bacteria within the lung lichen Lobaria pulmonaria L Hoffm as assessed by state-of-the-art metaproteomics Journal of proteome research 2017;16(6):2160-2173 doi:10.1021/acs.jproteome.6b00974 24 Cernava T, Müller H, Aschenbrenner IA, Grube M, Berg G Analyzing the antagonistic potential of the lichen microbiome against pathogens by bridging metagenomic with culture studies Frontiers in microbiology 2015;6:620 doi:10.3389/fmicb.2015.00620 25 Cernava T, Erlacher A, Aschenbrenner IA, et al Deciphering functional diversification within the lichen microbiota by meta-omics Microbiome 2017;5(1):1-13 doi:10.1186/s40168-017-0303-5 26 Davies J, Wang H, Taylor T, Warabi K, Huang X-H, Andersen RJ Uncialamycin, a new enediyne antibiotic Organic letters 2005;7(23):52335236 doi:10.1021/ol052081f 27 Parrot D, Legrave N, Delmail D, Grube M, Suzuki M, Tomasi S Review– lichen-associated bacteria as a hot spot of chemodiversity: focus on uncialamycin, a promising compound for future medicinal applications Planta Medica 2016;82(13):1143-1152 doi:10.1055/s-0042-105571 28 Williams DE, Davies J, Patrick BO, et al Cladoniamides A− G, tryptophanderived alkaloids produced in culture by Streptomyces uncialis Organic letters 2008;10(16):3501-3504 doi:10.1021/ol801274c 29 Servin JA, Herbold CW, Skophammer RG, Lake JA Evidence excluding the root of the tree of life from the actinobacteria Molecular biology and evolution 2008;25(1):1-4 doi:10.1093/molbev/msm249 30 Kämpfer P Genus I Streptomyces Waksman and Henrici 1943, 339AL emend Witt and Stackebrandt 1990, 370 emend Wellington, Stackebrandt, Sanders, Wolstrup and Jorgensen 1992, 159 Bergey’s manual of systematic bacteriology 2012;5:1455-1767 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 31 Anandan R, Dharumadurai D, Manogaran GP An introduction to actinobacteria Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications Intechopen; 2016:3-15:chap 32 Barka EA, Vatsa P, Sanchez L, et al Taxonomy, physiology, and natural products of Actinobacteria Microbiology and Molecular Biology Reviews 2016;80(1):1-43 doi:10.1128/MMBR.00019-15 33 Li Q, Chen X, Jiang Y, Jiang C Morphological identification of actinobacteria Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications Rijeka, Croatia: InTech 2016:59-86 doi:10.5772/61461 34 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học NXB Giáo Dục Việt Nam; 2010:767 35 Holt JG, Williams ST Bergey's manual of systematic bacteriology Lippincott Williams & Wilkins; 1989 36 Kanchanasin P, Moonmangmee D, Phongsopitanun W, Tanasupawat S, Moonmangmee S Streptomyces cerasinus sp nov., isolated from soil in Thailand International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2017;67(10):3854-3859 doi:10.1099/ijsem.0.002212 37 Zhang L, Willemse J, Yagüe P, de Waal E, Claessen D, van Wezel GP Branching of sporogenic aerial hyphae in sflA and sflB mutants of Streptomyces coelicolor correlates to ectopic localization of DivIVA and FtsZ in time and space bioRxiv 2020;doi:10.1101/2020.12.26.424426 38 S Amano, Miyadoh S Streptomyces finlayi In: 4637T SfJ, editor Digital Atlas of Actinomycete 39 Embley TM, Hirt RP, Williams DM Biodiversity at the molecular level: the domains, kingdoms and phyla of life Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B: Biological Sciences 1994;345(1311):21-33 doi:10.1098/rstb.1994.0083 40 Stackebrandt E, Schumann P Introduction to the taxonomy of actinobacteria Prokaryotes 2006;3:297-321 doi:10.1007/0-387-30743-5_16 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 41 Ludwig W, Euzéby J, Schumann P, et al Road map of the phylum Actinobacteria Bergey’s manual® of systematic bacteriology Springer; 2012:1-28 42 Amin DH, Abdallah NA, Abolmaaty A, Tolba S, Wellington EM Microbiological and molecular insights on rare Actinobacteria harboring bioactive prospective Bulletin of the National Research Centre 2020;44(1):112 doi:10.1186/s42269-019-0266-8 43 Nonomura H Key for classification and identification of 458 species of the Streptomycetes included in ISP J Ferment Technol 1974;52:78-92 44 Holt JG The shorter Bergey's manual of determinative bacteriology The shorter Bergey's manual of determinative bacteriology 8th edition 1977 45 Busse H-J, Denner EB, Lubitz W Classification and identification of bacteria: current approaches to an old problem Overview of methods used in bacterial systematics Journal of biotechnology 1996;47(1):3-38 doi:10.1016/01681656(96)01379-x 46 Olano C, Méndez C, Salas JA Antitumor compounds from marine Actinomycetes Marine drugs 2009;7(2):210-248 doi:10.3390/md7020210 47 Singh V, Haque S, Niwas R, Srivastava A, Pasupuleti M, Tripathi C Strategies for fermentation medium optimization: an in-depth review Frontiers in microbiology 2017;7:2087 doi:10.3389/fmicb.2016.02087 48 Stanbury PF, Whitaker A, Hall SJ Principles of fermentation technology 3rd ed Elsevier; 2013 49 Okami Y, Okazaki T, Kitahara T, Umezawa H Studies on marine microorganisms V A new antibiotic, aplasmomycin, produced by a Streptomycete isolated from shallow sea mud The Journal of antibiotics 1976;29(10):1019-1025 doi:10.7164/antibiotics.29.1019 50 Sanchez S, Demain AL Metabolic regulation of fermentation processes Enzyme and Microbial Technology 2002;31(7):895-906 doi:10.1016/S01410229(02)00172-2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn 51 Gallo M, Katz E Regulation of secondary metabolite biosynthesis: catabolite repression of phenoxazinone synthase and actinomycin formation by glucose Journal of bacteriology 1972;109(2):659-667 doi:10.1128/jb.109.2.659667.1972 52 Marwick JD, Wright PC, Burgess JG Bioprocess intensification for production of novel marine bacterial antibiotics through bioreactor operation and design Marine Biotechnology 1999;1(5):495-507 doi:10.1007/pl00011806 53 Singh V, Khan M, Khan S, Tripathi C Optimization of actinomycin V production by Streptomyces triostinicus using artificial neural network and genetic algorithm Applied microbiology and biotechnology 2009;82(2):379385 54 Martín JF Phosphate control of the biosynthesis of antibiotics and other secondary metabolites is mediated by the PhoR-PhoP system: an unfinished story Journal of bacteriology 2004;186(16):5197-5201 doi:10.1128/JB.186.16.5197-5201.2004 55 Gesheva V, Ivanova V, Gesheva R Effects of nutrients on the production of AK-111-81 macrolide Microbiological antibiotic by Streptomyces research hygroscopicus 2005;160(3):243-248 doi:10.1016/j.micres.2004.06.005 56 Georgieva-Borisova, J.Ch Taxonomic characteristics of strain Actinomyces hygroscopicus B-255 and conditions for its antibiotic production Sofia; 1974 57 Fleming I, Nisbet L, Brewer S Target directed antimicrobial screens Bioactive Microbial Products Search and Discovery Ed, JD BU'LOCK et al 1982:107130 58 Igarashi M, Hayashi C, Homma Y, et al Tubelactomicin A, a novel 16membered lactone antibiotic, from Nocardia sp I Taxonomy, production, isolation and biological properties The Journal 2000;53(10):1096-1101 doi:10.7164/antibiotics.53.1096 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn of antibiotics Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 59 Nedialkova D, Naidenova M Screening the antimicrobial activity of actinomycetes strains isolated from Antarctica Accessed 30/08/2022, https://tspace.library.utoronto.ca/bitstream/1807/5200/1/cc05003.pdf 60 Selvameenal L, Radhakrishnan M, Balagurunathan R Antibiotic pigment from desert soil actinomycetes; biological activity, purification and chemical screening Indian journal of pharmaceutical sciences 2009;71(5):499 doi:10.4103/0250-474X.58174 61 Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng NXB Giáo Dục Việt Nam; 2009 62 Trương Thị Minh Hạnh Giáo trình Cơng nghệ dược phẩm 2007:22 63 Sadh PK, Kumar S, Chawla P, Duhan JS Fermentation: a boon for production of bioactive compounds by processing of food industries wastes (by-products) Molecules 2018;23(10):2560 doi:10.3390/molecules23102560 64 Bhargav S, Panda BP, Ali M, Javed S Solid-state fermentation: an overview Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 2008;22(1):49-70 65 Domínguez-Pérez M, Tomé LI, Freire MG, Marrucho IM, Cabeza O, Coutinho JA (Extraction of biomolecules using) aqueous biphasic systems formed by ionic liquids and aminoacids Separation and Purification Technology 2010;72(1):85-91 doi:10.1016/j.seppur.2010.01.008 66 Fedeniuk RW, Shand PJ Theory and methodology of antibiotic extraction from biomatrices Journal of Chromatography A 1998;812(1-2):3-15 67 Martins S, Mussatto SI, Martínez-Avila G, Montez-Saenz J, Aguilar CN, Teixeira JA Bioactive phenolic compounds: production and extraction by solidstate fermentation A review Biotechnology advances 2011;29(3):365-373 doi:10.1016/j.biotechadv.2011.01.008 68 Sharma M, Manhas RK Purification and characterization of actinomycins from Streptomyces strain M7 active against methicillin resistant Staphylococcus aureus and vancomycin resistant Enterococcus 2019;19(1):1-14 doi:10.1186/s12866-019-1405-y Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn BMC microbiology Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 69 El-Naggar NE-A, El-Bindary AA-A, Abdel-Mogib M, Nour NS In vitro activity, extraction, separation and structure elucidation of antibiotic produced by Streptomyces anulatus NEAE-94 active against multidrug-resistant Staphylococcus aureus Biotechnology & Biotechnological Equipment 2017;31(2):418-430 doi:10.1080/13102818.2016.1276412 70 Abarca-Vargas R, Pena Malacara CF, Petricevich VL Characterization of chemical compounds with antioxidant and cytotoxic activities in bougainvillea x buttiana holttum and standl,(Var rose) extracts Antioxidants 2016;5(4):45 doi:10.3390/antiox5040045 71 Trần Hùng, Nguyễn Viết Kình, Bùi Mỹ Linh, Võ Văn Lẹo Phương pháp nghiên cứu dược liệu Khoa Dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh; 2017 72 De Hoffmann E, Stroobant V Mass spectrometry: principles and applications 2nd ed John Wiley & Sons; 2007 73 Djinni I, Defant A, Kecha M, Mancini I Metabolite profile of marine‐derived endophytic Streptomyces sundarbansensis WR 1L1S8 by liquid chromatography–mass spectrometry and evaluation of culture conditions on antibacterial activity and mycelial growth Journal of applied microbiology 2014;116(1):39-50 doi:10.1111/jam.12360 74 Nguyen HT, Pokhrel AR, Nguyen CT, et al Streptomyces sp VN1, a producer of diverse metabolites including non-natural furan-type anticancer compound Scientific reports 2020;10(1):1-14 doi:10.1038/s41598-020-58623-1 75 Balouiri M, Sadiki M, Ibnsouda SK Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review Journal of pharmaceutical analysis 2016;6(2):71-79 76 Hadacek F, Greger H Testing of antifungal natural products: methodologies, comparability of results and assay choice Phytochemical Analysis: An International Journal of Plant Chemical and Biochemical Techniques 2000;11(3):137-147 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 77 Motohashi K, Takagi M, Yamamura H, Hayakawa M, Shin-Ya K A new angucycline and a new butenolide isolated from lichen-derived Streptomyces spp The Journal of antibiotics 2010;63(9):545-548 78 Liu C, Jiang Y, Lei H, et al Four new nanaomycins produced by Streptomyces hebeiensis derived from lichen Chemistry & biodiversity 2017;14(7):e1700057 doi:10.1002/cbdv.201700057 79 Susanti AE, Ratnakomala S, Mangunwardoyo W, Lisdiyanti P Antimicrobial Activity of Lichens-Associated Actinomycetes Strain LC-23 2019:91-96 80 Zheng K-X, Jiang Y, Jiang J-X, Huang R, He J, Wu S-H A new phthalazinone derivative and a new isoflavonoid glycoside from lichen-associated Amycolatopsis sp Fitoterapia 2019;135:85-89 doi:10.1016/j.fitote.2019.04.011 81 Liu C-Y, Li Y-L, Lu J-H, et al Steffimycin F, a new steffimycin-type derivative from the lichen-derived actinomycetes Streptomyces sp Journal of Molecular Structure 2021;1227:129352 doi:10.1016/j.molstruc.2020.129352 82 Hei Y, Zhang H, Tan N, et al Antimicrobial activity and biosynthetic potential of cultivable actinomycetes associated with Lichen symbiosis from QinghaiTibet Plateau Microbiological Research 2021;244:126652 doi:10.1016/j.micres.2020.126652 83 El-Naggar N, Abdel-Fattah M, Abo-Hamed N, et al Compendium of Actinobacteria from Dr Joachim M Wink, University of Braunschweig, an electronic manual including the important bacterial group of the actinomycetes Int J Pharmacol 2002;11:445-454 84 Pridham T, Gottlieb D The utilization of carbon compounds by some Actinomycetales as an aid for species determination Journal of bacteriology 1948;56(1):107 doi:10.1128/jb.56.1.107-114.1948 85 Wink J, Mohammadipanah F, Kazemi Shariat Panahi H Practical aspects of working with actinobacteria Biology and Biotechnology of Actinobacteria Springer; 2017:329-376 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 86 Li Q, Chen X, Jiang Y, Jiang C Cultural, physiological, and biochemical identification of actinobacteria Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications 2016:87-111 doi:10.5772/61462 87 Chen X, Jiang Y, Li Q, Han L, Jiang C Molecular phylogenetic identificaction of actinobacteria D Dharumadurai, & Y Jiang, Actinobacteria-Basics and Biotechnological Applications 2016:141-174 88 Pérez-Victoria I, Martín J, Reyes F Combined LC/UV/MS and NMR strategies for the dereplication of marine natural products Planta medica 2016;82(09/10):857-871 doi:10.1055/s-0042-101763 89 Palaniyandi S, Damodharan K, Yang S, Suh J Streptomyces sp strain PGPA39 alleviates salt stress and promotes growth of ‘Micro Tom’tomato plants Journal of applied microbiology 2014;117(3):766-773 90 Pridham T, Lyons Jr A Streptomyces albus (Rossi-Doria) Waksman et Henrici: taxonomic study of strains labeled Streptomyces albus Journal of Bacteriology 1961;81(3):431-441 91 Shirling ET, Gottlieb D Methods for characterization of Streptomyces species International journal of systematic bacteriology 1966;16(3):313-340 92 Kämpfer P Streptomyces Bergey's manual of systematics of archaea and bacteria 2015:1-414 93 Ian E, Malko DB, Sekurova ON, et al Genomics of sponge-associated Streptomyces spp closely related to Streptomyces albus J1074: insights into marine adaptation and secondary metabolite biosynthesis potential PLoS One 2014;9(5):e96719 doi:10.1371/journal.pone.0096719 94 Todosiichuk T, Zelena L, Klochko V Multistage selection of soil actinomycete Streptomyces albus as a producer of antimicrobial substances Emirates Journal of Food and Agriculture 2015:250-257 doi:10.9755/ejfa.v27i3.18267 95 Estévez MR, Myronovskyi M, Gummerlich N, Nadmid S, Luzhetskyy A Identification and Characterisation of the Nybomycin Gene Cluster from the Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Marine Strain Streptomyces albus subsp chlorinus NRRL B-24108 Marine Drugs 16 2018;11:435 doi:10.3390/md16110435 96 Schleissner C, Pérez M, Losada A, et al Antitumor actinopyranones produced by Streptomyces albus POR-04-15-053 isolated from a marine sediment Journal of natural products 2011;74(7):1590-1596 doi:10.1021/np200196j 97 Nguyen TB, Kitani S, Shimma S, Nihira T Butenolides from Streptomyces albus J1074 act as external signals to stimulate avermectin production in Streptomyces avermitilis Applied and environmental microbiology 2018;84(9):e02791-17 doi:10.1128/AEM.02791-17 98 Todosiichuk T, Klochko V, Savchuk Y, Kobzysta O New antibiotic substances of the Streptomyces albus enzybiotic complex Mikrobiolohichnyi zhurnal (Kiev, Ukraine: 1993) 2019;81(5):62-72 doi:10.15407/microbiolj81.05.062 99 TSUNAKAWA M, KAMEI H, KONISHI M, MIYAKI T, OKI T, KAWAGUCHI H Porothramycin, a new antibiotic of the anthramycin group: Production, isolation, structure and biological activity The Journal of Antibiotics 1988;41(10):1366-1373 doi:10.7164/antibiotics.41.1366 100 Zhao C, Coughlin JM, Ju J, et al Oxazolomycin biosynthesis in Streptomyces albus JA3453 featuring an “acyltransferase-less” type I polyketide synthase that incorporates two distinct extender units Journal of biological chemistry 2010;285(26):20097-20108 doi:10.1074/jbc.M109.090092 101 Miyazaki Y, SHIBUYA M, SUGAWARA H, et al Salinomycin, a new polyether antibiotic The Journal of antibiotics 1974;27(11):814-821 doi:10.7164/antibiotics.27.814 102 Kallifidas D, Jiang G, Ding Y, Luesch H Rational engineering of Streptomyces albus J1074 for the overexpression of secondary metabolite gene clusters Microbial cell factories 2018;17(1):1-14 doi:10.1186/s12934-0180874-2 103 Seipke RF Strain-level diversity of secondary metabolism in Streptomyces albus PLoS One 2015;10(1):e0116457 doi:10.1371/journal.pone.0116457 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 104 Sharon SFB, Daniel RR, Shenbagarathai R Optimization of antibiotic production by marine actinomycetes Streptomyces sp KOD10 Int J Pharm Pharm Sci 2014;6(2):506-510 105 Mandal S, Das P, Kundu S, Maiti PK, Sahoo P An antibacterial compound Pyrimidomycin produced by Streptomyces sp PSAA01 isolated from soil of Eastern Himalayan foot-hill Sci Rep 2022;12:10176 doi:10.1038/s41598-02214549-4 106 Canh NX, Hien TTT, Huyen NT, Minh PLA, Bao T, Tram NTTM Optimization of culture conditions of Streptomyces antibioticus strain 1083 to improve the antimicrobial activity against Aeromonas hydrophila Journal of Biotechnology 2018;16(4):713-719 107 Dezfully NK, Ramanayaka JG Isolation, identification and evaluation of antimicrobial activity of Streptomyces flavogriseus, strain ACTK2 from soil sample of Kodagu, Karnataka State (India) Jundishapur journal of microbiology 2015;8(2)doi:10.5812/jjm.15107 108 Tan LT-H, Lee L-H, Goh B-H Critical review of fermentation and extraction of anti-Vibrio compounds from Streptomyces Progress In Microbes & Molecular Biology 2020;3(1)doi:10.36877/pmmb.a0000051 109 Sharma P, Ranghar S, Baunthiyal M Identification and Optimization of Fermentation Medium for Production of Antibacterial Compounds from Endophytic Streptomyces sp GBTPR-167 International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences 2020;9doi:10.20546/ijcmas.2020.906.316 110 Abdelghani T Production of antibacterial and antifungal metabolites by S albovinaceus strain no 10/2 and media optimization Am Int J Biol 2017;5(1):1-24 doi:10.15640/aijb.v5n1a1 111 Velho-Pereira S, Kamat NM Optimization of an anti Staphylococcus antibiotic produced by tropical soil dwelling Streptomyces parvulus bioRxiv 2016:060392 doi:10.1101/060392 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 112 Ju Y, Son K-H, Jin C, Hwang BS, Park D-J, Kim C-J Statistical optimization of culture medium for improved production of antimicrobial compound by Streptomyces rimosus AG-P1441 Food science and biotechnology 2018;27(2):581-590 doi:10.1007/s10068-017-0257-1 113 Barbuto Ferraiuolo S, Restaino OF, Gutiérrez-del-Río I, et al Optimization of Pre-Inoculum, Fermentation Process Parameters and Precursor Supplementation Conditions to Enhance Apigenin Production by a Recombinant Streptomyces albus Strain Fermentation 2021;7(3):161 doi:10.3390/fermentation7030161 114 Duan Y, Chen J, He W, et al Fermentation optimization and disease suppression ability of a Streptomyces ma FS-4 from banana rhizosphere soil BMC microbiology 2020;20(1):1-12 doi:10.1186/s12866-019-1688-z 115 Yang D, Luo J, Huang T, et al Submerged fermentation of Streptomyces uncialis providing a biotechnology platform for uncialamycin biosynthesis, engineering, and production Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 2021;48(3-4):kuab025 doi:10.1093/jimb/kuab025 116 Kurnianto MA, Kusumaningrum HD, Lioe HN Characterization of Streptomyces isolates associated with estuarine fish Chanos chanos and profiling of their antibacterial metabolites-crude-extract International Journal of Microbiology 2020;2020doi:10.1155/2020/8851947 117 Shazia K, Muhammad AG, Kalsoom A Isolation, identification and optimization of fermentation parameters for improved production of antimicrobial compounds from indigenous Streptomyces isolates African Journal of Microbiology Research 2013;7(18):1874-1887 doi:10.5897/AJMR2012.2462 118 Raytapadar S, Paul A Production of an antifungal antibiotic by Streptomyces aburaviensis IDA-28 Microbiological Research 2001;155(4):315-323 doi:10.1016/S0944-5013(01)80010-0 119 Korn-Wendisch F, Kutzner H The family Streptomycetaceae Prokaryotes 1992;(Ed 2):921-995 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn The Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 120 Eftekharivash L, Hamedi J, Gh Z, Bakhtiari R Acidophilic and Acid Tolerant Actinobacteria as New Sources of Antimicrobial Agents against Helicobacter pylori Archives of Razi Institute 2021;76(2):261 doi:10.22092/ari.2019.128039.1401 121 Yun TY, Feng RJ, Zhou DB, et al Optimization of fermentation conditions through response surface methodology for enhanced antibacterial metabolite production by Streptomyces sp 1-14 from cassava rhizosphere PloS one 2018;13(11):e0206497 doi:10.1371/journal.pone.0206497 122 Jiang J, Sun Y-F, Tang X, et al Alkaline pH shock enhanced production of validamycin A in fermentation of Streptomyces hygroscopicus Bioresource technology 2018;249:234-240 doi:10.1016/j.biortech.2017.10.012 123 Santos-Beneit F, Ceniceros A, Nikolaou A, Salas JA, Gutierrez-Merino J Identification of Antimicrobial Compounds in Two Streptomyces sp Strains Isolated From Beehives Frontiers in microbiology 2022;13:742168 doi:10.3389/fmicb.2022.742168 124 Majer J, Chater K Streptomyces albus G produces an antibiotic complex identical to paulomycins A and B Microbiology 1987;133(9):2503-2507 doi:10.1099/00221287-133-9-2503 125 Wayne P Clinical and laboratory standards institute Performance standards for antimicrobial susceptibility testing 29nd ed Clinical and Laboratory Standards Institute; 2011 126 Iniyan AM, Mary TRJ, Joseph F-JRS, Kannan RR, Vincent SGP Cell wall distracting anti-Methicillin-resistant Staphylococcus aureus compound PVI331 from a marine sponge associated Streptomyces Journal of Applied Biomedicine 2016;14(4):273-283 doi:10.1016/j.jab.2016.04.003 127 Brazhnikova M, Ponomarenko V, Kovsharova I, Krugliak E, Proshliakova V Study of bruneomycin formed by Act albus var bruneomycini and its identification with streptonigrin Antibiotiki 1968;13(2):99-102 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 1.1 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần môi trường nuôi cấy vi khuẩn, thủ nghiệm Mơi trường Kí hiệu ISP2 Thành phần nồng độ (g/l) Mục đích Chiết xuất nấm men Nuôi International Chiết xuất mạch nha 10 xạ khuẩn Streptomyces Glucose Tinh bột 10 Môi trường International K2HPO4 nghiên cứu Streptomyces MgSO4 7H2O hình thái xạ Project NaCl khuẩn (NH4)2SO4 CaCO3 FeSO4 7H2O 0,001 MgCl2.4H2O 0,001 ZnSO4.7H2O 0,001 L – asparagin Môi trường International Glycerol 10 nghiên cứu Streptomyces K2HPO4 hình thái xạ Project FeSO4 7H2O 0,01 khuẩn MgCl2.4H2O 0,01 ZnSO4.7H2O 0,01 Glucose 10 Môi trường Chiết xuất mạch nha thu Chiết xuất nấm men chất kháng Pepton vi sinh vật Tinh bột tan 10 Môi trường K2PO4 0,3 thử nghiệm The Project cấy (ISP) môi trường số ISP4 The (ISP) môi trường số ISP5 The (ISP) môi trường số Malt extract – Yeast MYA extract agar Môi trường tinh bột SC Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn nhận Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 1.2 Mơi trường Kí hiệu Thành phần nồng độ (g/l) Mục đích MgCO3 tính chất NaCl 0,5 sinh hố xạ KNO3 khuẩn Agar 15 pH 7.2–7.4 Sucrose 10 Môi trường Sucrose – Yeast Tinh bột thu extract Bột đậu nành 20 chất kháng Yeast extract vi sinh vật Pepton K2HPO4 0,5 NaCl MgSO4.7H2O CaCO3 0,5 Môi trường CuSO4.5H2O 6,4 Thử Pridham FeSO4.7H2O 1,1 nghiệm lên Gottlieb MnCl2.4H2O 7,9 men đường ZnSO4.7H2O 1,5 Agar 18 Nước cất vđ 1000 Chiết xuất nấm men Môi trường Meat extract thử nghiệm Casein tính Glucose 10 sinh hố xạ Soybean meal – Mơi trường Bennett SSY nhận chất khuẩn Môi trường Ure Pepton Mơi trường NaCl thử nghiệm Glucose tính Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn chất Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 1.3 Mơi trường Kí hiệu Thành phần nồng độ (g/l) Mục đích K2HPO4 sinh hố xạ Phenol red 0,012 khuẩn Tryptic soy agar 40 Môi trường Gelatin 16 thử nghiệm pH 6,8-6,9 Mơi trường Gelatin tính chất sinh hoá xạ khuẩn K2HPO4 0,5 Thử Cellulose – đỏ MgSO4.7H2O 0,25 nghiệm khả Congo Cellulose Đỏ Congo 0,2 enzym Gelatin Cellulase Tinh bột tan 20 Môi trường KNO3 thu NaCl 0,5 chất kháng K2HPO4.3H2O 0,5 vi sinh vật FeSO4.7H2O 0,01 Agar 15 Môi trường sinh pH 6,8 – 7.2 Môi trường Gause nhận pH: 7,2-7,4 Môi trường Yi YIM Glucose Môi trường Jiang 310 310 Pepton thu Tinh bột tan 10 chất kháng Chiết xuất nấm men vi sinh vật CaCO3 NH4NO3 pH 7,2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn nhận Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 1.4 Mơi trường Kí hiệu Thành phần nồng độ (g/l) Mục đích Mơi trường YIM Tinh bột tan 20 Môi trường 308 Glucose 10 thu Pepton chất kháng Meat extract vi sinh vật Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn nhận Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL Phụ lục Thuốc thử hóa chất Thuốc thử/ Hóa Thành phần Nồng độ Mục đích chất Thuốc thử Tetramethylphenylenediamin 0,1 g Phản ứng Kovac’s 1% dihydroclorid oxidase Lysosym SDS 20% Natri acetat 3M Nước cất Vđ 10 ml Lysosym 1,25 g dH2O Vđ 25 ml SDS 20 g dH2O Vđ 80 ml CH3COONa.3H2O 40,81 g dH2O 70 ml Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Chiết ADN Chiết ADN Chiết ADN Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL Phụ lục Trình tự 16S rADN xạ khuẩn 4VH4 TGCAAGTCGAACGATGAAGCCGCTTCGGTGGTGGATTAGTGGCGAACGG GTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGA AACGGGGTCTAATACCGGATATGACACGGGATCGCATGGTCTCCGTGTG GAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGT GGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGC GACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGC AGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGC CGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAA GAAGCGCGAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTG GGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGATGTGAAAGCCCGG GGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGCAG GGGAGATTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGA GGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAG GAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC GCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGCGGCATTCCACGTCGTCCGTG CCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGC TAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGT GGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCT Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL Phụ lục Đường kính vịng ức chế vi khuẩn thử nghiệm dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 với môi trường khác VSV thử Đường kính vịng ức chế (mm) K pneumoniae E coli MRSA nghiệm MT Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần Lần 3 ISP2 26,0 26,5 26,3 14,2 14,4 14,2 27,8 28,1 27,9 MYA 22,5 21,9 21,7 9,9 10,3 10,4 26,3 26,2 26,5 SSY 0 0 0 0 Gause 13,6 13,9 13,6 0 15,7 15,9 15,9 YIM308 11,1 11,3 11,6 0 12,8 12 12,7 YIM310 0 0 0 0 Ghi chú: Dịch nuôi cấy xạ khuẩn 4VH4 môi trường khác không cho thấy hoạt tính kháng đối vối E faecalis, P aeruginosa C albicans Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL (a) (b) (c) Phụ lục Vòng ức chế vi khuẩn thử nghiệm dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn với môi trường khác (a) K pneumoniae, (b) MRSA, (c) E coli Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL Phụ lục Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ glucose khác Nồng độ glucose Đường kính vịng ức chế K pneumoniae (mm) (g/l) Lần Lần Lần 1,0 12,2 12,4 12,1 2,0 23,8 23,5 23,7 3,0 27,6 28,0 27,2 4,0 27,8 28,2 28,2 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL Phụ lục Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường có nồng độ chiết xuất mạch nha khác Nồng độ chiết xuất Đường kính vịng ức chế K pneumoniae (mm) mạch nha (g/l) Lần Lần Lần 2,0 0 4,0 26,1 25,7 26,2 6,0 25,6 25,7 26,0 8,0 26,2 25,8 25,8 10,0 26,4 26,1 26,0 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL Phụ lục Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 môi trường có nồng độ chiết xuất nấm men khác Nồng độ chiết xuất Đường kính vịng ức chế K pneumoniae (mm) nấm men (g/l) Lần Lần Lần 1,0 7,0 6,8 6,9 2,0 17,2 16,8 16,7 3,0 26,1 26,4 26,0 4,0 26,2 26,7 26,6 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL (a) (b) (c) Phụ lục Vịng ức chế dịch ni cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 môi trường có nồng độ thành phần khác (a) nồng độ glucose khác (b) nồng độ chiết xuất mạch nha khác (c) nồng độ chiết xuất nấm men khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 10 Phụ lục 10 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 mơi trường ISP2 cải tiến có pH khác pH Đường kính vịng ức chế K pneumoniae (mm) Lần Lần Lần 3 10,1 9,8 9,7 28,1 27,7 28,0 28,4 28,0 27,6 21,6 21,7 21,4 11 9,1 8,9 9,0 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 11 Phụ lục 11 Vịng ức chế K pneumoniae dịch ni cấy lên men xạ khuẩn 4VH4 môi trường ISP2 cải tiến có pH khác Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 12 Phụ lục 12 Đường kính vịng ức chế K pneumoniae dịch ni cấy xạ khuẩn 4VH4 với môi trường ISP2 cải tiến theo thời gian Đường kính vịng ức chế K pneumoniae (mm) Nuôi cấy Thời điểm 10 Xạ khuẩn Lần 18,1 18,7 25,1 26,2 29,1 27,5 27,2 26,9 4VH4 Lần 18,5 18,8 24,8 26,0 27,6 27,3 27,4 27,3 Ghi chú: thời điểm 2-10 tương ứng với thời điểm ngày thứ – ngày thứ 10 Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 13 Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ Ngày thứ 10 Phụ lục 13 Vòng ức chế K pneumoniae dịch nuôi cấy xạ khuẩn 4VH4 với môi trường ISP2 cải tiến theo thời gian Ghi chú: 1: lần 1, 2: lần 2, thời điểm ngày thứ dịch nuôi cấy xạ khuẩn 4VH4 khơng có hoạt tính kháng K pneumoniae Tuân thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL 14 EA - MeOH n-Hexan - EA -MeOH n-Hexan - EA - MeOH EA - MeOH - H2O (4:3) (2:6:2) (1:4:3) (100:17:13) Phụ lục 14 Sắc ký lớp mỏng cao toàn phần DCM triển khai với hệ dung mơi khác Tn thủ Luật sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn tài liệu trích dẫn