Đang tải... (xem toàn văn)
Bài giảng Các phương pháp nuôi cấy tế bào: Bài 4 - ThS. Nguyễn Thành Luân
4/01/2013 1 BÀI 4 CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHI TRUYỀN THỐNG Lớp phân tích vi sinh GV: ThS. Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật (Nhắc lại) Sự hiện diện của vi sinh vật có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp Trực tiếp như đếm trên kính hiển vi Gián tiếp thông qua: Phương pháp đo độ đục Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường xác định Định lượng một cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (MPN). 4/01/2013 2 Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Ƣu điểm: Quy trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vi sinh vật chứa trong mẫu. • Nhƣợc điểm: - Không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết - Dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu - Khó đạt được độ chính xác cao - Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Phƣơng pháp đếm trực tiếp • Buồng đếm hồng cầu • Buồng đếm Breed • Kính hiển vi huỳnh quang THIẾT BỊ GÌ?? 4/01/2013 3 Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc •Trong phương pháp này cần thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp cho độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp •Số lượng khuẩn lạc tối ưu là trong khoảng từ 25 – 250 khuẩn lạc/đĩa. Phƣơng pháp đếm khuẩn lạc •Phương pháp này dễ sai số nên cần thực hiện lặp lại trên ít nhất ba đĩa. •Ƣu điểm: Độ nhạy cao, cho phép định lượng vi sinh vật ở mật độ thấp trong mẫu 4/01/2013 4 Phƣơng pháp MPN (Most Probable Number) Là phương pháp định lượng vi sinh vật theo xác suất lớn nhất hiện diện trong 1 đơn vị thể tích mẫu Là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại Thông thường là lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp. Số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của phương pháp này càng lớn. Phƣơng pháp đo độ đục • Là phương pháp gián tiếp xác định mật độ vi sinh vật. • Định lượng mật độ tế bào thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở các bước sóng từ 550 – 610 nm. • Phương pháp xác định mật độ tế bào theo độ đục có thể được dùng để so sánh mức độ tăng trưởng của hai hay nhiều chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng 4/01/2013 5 CÁC THỬ NGHIỆM SINH HÓA • Phân lập khuẩn lạc thuần khiết là cần thiết cho định danh VSV • Việc định danh dựa chủ yếu vào đặc điểm kiểu hình đặc biệt là các phản ứng sinh hóa. • Có 3 cách sử dụng các thử nghiệm sinh hóa để định danh VSV: • Cách truyền thống • Sử dụng các bộ KIT • Sử dụng các thiết bị tự động 4/01/2013 6 Thử nghiệm khả năng lên men • Mục đích: thử nghiệm khả năng sữ dụng các nguồn CH của các VSV • Nguyên tắc: VSV sử dụng CH tao acid giảm pH môi trường • Các loại carbohydrate • Monocarbonhydrate: glucose, xylose, rhamnose … • Dicarbonhydrate: sucrose, lactose … • Polycarbonhydrate: tinh bột, cellulose • Các loại đường khử: đường mono chứa chức –CHO • Các loại đường rượu: chứa chức -OH 4/01/2013 7 Phenol Red Carbohydrate Broth Trypticase 10g NaCl 5g Cao thịt 1g Phenol red (7,2ml của dung dịch phenol red 0,25%) 0,018g Carbohydrate * 1 g Hấp ở 115 o C trong 15 phút Thử nghiệm khả năng lên men • Môi trường: Phenolred broth base bổ sung 0,5-1% đường cần thử nghiệm • VSV sử dụng được nguồn đường trong môi trường sẽ làm giảm pH thay đổi màu chất chỉ thị phenolred • Phản ứng (+): môi trường chuyển vàng • Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ 4/01/2013 8 Thử nghiệm Citrate • Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật sử dụng nguồn citrat như là nguồn cacbon duy nhất. • Cở sở sinh hóa: • VSV sử dụng citrate, sinh ra CO 2 làm kiềm hóa MT • VSV sử dụng muối ammonium là nguồn đạm duy nhất tạo ra NH 3 làm kiềm hóa MT Thử nghiệm Citrate Môi trường Simmon citrate agar Ammonium dihydrogen phosphate 1.0g Dipotassium hydrogen phosphate 1.0g NaCl 5g Sodium citrate 2g MgSO 4 0,2g Bromothymol blue 0,08g Agar 13g 4/01/2013 9 Thử nghiệm Citrate • Chú ý - Cấy lượng sinh khối vừa đủ - Có đối chứng trắng (BLANK) đi kèm Đối chứng trắng Pứ âm tính Pứ dương tính Thử nghiệm Urease • Mục đích: phát hiện VSV có mang enzym urease • Cơ sở sinh hoá: (NH 2 ) 2 CO + H 2 O 2 NH 3 + CO 2 tăng pH môi trường đỏ phenol (vàng – đỏ) • Môi trường sử dụng: • Urea Broth (Rustigian – Stuart) • Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) 4/01/2013 10 Môi trƣờng Urea Broth Urea 20g Cao nấm mem 0,1g Na 2 HPO 4 9,5g K 2 HPO 4 9,1g Phenol red 0,01g Nước cất 1 lít •Thực hiện • Chuẩn bị môi trường • Cấy VSV vào 5ml môi trường • ủ 37 o C/24 giờ • Quan sát Thử nghiệm Urease [...]... pyruvate acetoin + 2 CO2 17 4/ 01/2013 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Môi trường sử dụng: MR-VP • Phương pháp tiến hành: • Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP • Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37oC • Bổ sung thuốc thử vào môi trường, lắc nhẹ • Đọc kết quả sau 20 phút và chậm nhất là 4 giờ Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Kiểm tra thuốc thử bằng đối chứng (+) : Enterobacter cloacea (-) : E coli • Đọc kết... Ủ 37oC/ 24 giờ Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H2S Thử nghiệm KIA/TSI ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15 4/ 01/2013 Thử nghiệm MR (Methyl red) • Mục đích: xác định vi sinh vật sản xuất và duy trì các acid bền trong quá trình lên men glucose • Cơ sở sinh hóa: • Chất chỉ thị pH: methyl red dưới 4, 4 5,0 – 5,8 trên 6,0 • MR (+) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid • MR (-) – càng... Phát hiện các VSV có khả năng sinh indol các VSV có hệ emzym tryptophanase 37oC / 24h Thuốc thử Kovac’s Chủng VSV MT canh trypton Pứ dương tính Pứ âm tính Thử nghiệm khả năng sinh Indol • Là phản ứng giúp phân biệt • E coli (+) với Klebsiella (-) • Proteus mirabilis (-) với Proteus khác (+) • Bacillus alvei (+) với Bacillus khác (-) … • Đối chứng (+) Proteus rettgeri (-) Serratia marcescens 13 4/ 01/2013... (0,1%): N,N,N’,N’-tetramethyl-p- phenylenediamine • Bảo quản lạnh trong tối • Thời hạn bảo quản: 2 tuần • Đối chứng (+): Serratia marcescens (-) : Proteus rettgeri 33 4/ 01/2013 Thử nghiệm oxydase • Thực hiện: • Lấy VSV từ Nitrient Agar đặt lên giấy thấm • Nhỏ thuốc thử TMPD • Quan sát sau 30 giây Phản ứng (+): sinh khối chuyển màu xanh Phản ứng (-) : sinh khối vẫn màu trắng Thử nghiệm oxydase 34 4/01/2013... hiện các vi sinh vật có hệ enzyme - galactosidase – enzyme cảm ứng • Cơ sở sinh hóa: ONPG o-nitrophenol Không màu Màu vàng Thử nghiệm ONPG ủ qua đêm 37oC Lactose agar Màu vàng Chủng VSV 2ml ONPG broth Pứ (+) Pứ (-) 35 4/ 01/2013 Thử nghiệm khả năng tan huyết • Mục tiêu: phát hiện các vi sinh vật có khả năng làm tan hồng cầu • Máu sử dụng: cừu, bê non, thỏ … • Cơ sở sinh hoá: • Các heamolysine là các. .. số acid amin Cấu trúc của phân tử Amino acid 24 4/01/2013 Ba thử nghiệm quan trọng • Lysine decarboxylase (LDC) • Ornithine decarboxylase (ODC) • Arginine decarboxylase (ADC) / Arginine dehydrolase (ADH) Các enzyme trên là các enzyme cảm ứng, chỉ được tạo ra khi trong môi trường nuôi cấy có cơ chất tương ứng Thử nghiệm decarboxylase • Cơ sở sinh hoá • Các sp tạo ra làm tăng pH môi trường đổi màu... đĩa) Cấy vsv lên môi trường Ủ (37oC, 24 – 48 h) 11 4/ 01/2013 Thử nghiệm khả năng sinh H2S • Đọc kết quả: Xuất hiện màu đen trong môi trường Không xuất hiện màu đen trong môi trường (+) (-) ĐC (+) Thử nghiệm khả năng sinh H2S Pancreatic digest of casein (casitone) 20.0 g Peptic digest of animal tissue (beef extract) 6.1 g Ferrous ammonium sulfate 0.2 g Sodium thiosulfate 0.2 g Agar 3.5 g (-) (+) (+) 12 4/ 01/2013... hoá: • Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý • catalase H2O2 (hydrogen peroxide) H2O + O2 (bọt khí) 22 4/ 01/2013 Thử nghiệm catalase • Thực hiện • VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn) • Đặt VSV lên lam kính sạch • Nhỏ H2O2 30% • Quan sát sau 1-2 giây • Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện • Phản ứng (-) : không có bọt khí xuất hiện Thử nghiệm catalase 23 4/ 01/2013 Thử nghiệm catalase... thời gian nuôi cấy – môi trường càng acid • MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37oC Thử nghiệm MR (Methyl red) Môi trường: Glucose Phosphate (MR-VP broth) ủ 2 – 5 ngày 37oC Chủng VSV MR-VP broth Pứ âm tính Pứ dương tính ĐC 16 4/ 01/2013 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Mục đích: Phát hiện vsv tạo sản... NO3 + bụi kẽm màu hồng 31 4/ 01/2013 Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) • Phương pháp tiến hành: • Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường chứa nitrate • Bổ sung chất thử để kiểm tra sự hiện diện của nitrite • Phản ứng định tính nitrite (-) bổ sung lượng kẽm nhỏ để định tính nitrate Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) 32 4/ 01/2013 Thử nghiệm oxydase • Mục tiêu: phát hiện VSV có hệ enzym oxydase . 4/ 01/2013 1 BÀI 4 CÁC QUI TRÌNH KIỂM TRA VI SINH VẬT TRUYỀN THỐNG VÀ PHI TRUYỀN THỐNG Lớp phân tích vi sinh GV: ThS. Nguyễn Thành Luân luannt@cntp.edu.vn Phƣơng pháp định. gian nuôi cấy – môi trường càng acid • MR (-) – càng kéo dài thời gian nuôi cấy – các chất có tính acid bị chuyển hóa – môi trường dần trung tính Thời gian ủ 2 – 5 ngày ở 37 o C dưới 4, 4. acetoin + 2 CO 2 4/ 01/2013 18 Thử nghiệm VP (Voges – Proskauer) • Môi trường sử dụng: MR-VP • Phương pháp tiến hành: • Cấy vi sinh vật trong môi trường MR-VP • Ủ 24 – 48 giờ, nhiệt độ 37 o C