Đang tải... (xem toàn văn)
Bài giảng công nghệ protein – enzyme chương 2
1 1 C C á á c phương ph c phương ph á á p thu nh p thu nh ậ ậ n protein n protein C C á á c phương ph c phương ph á á p chi p chi ế ế t r t r ú ú t v t v à à tinh s tinh s ạ ạ ch protein đ ch protein đ ề ề u d u d ự ự a a trên nh trên nh ữ ữ ng t ng t í í nh ch nh ch ấ ấ t h t h ó ó a lý c a lý c ủ ủ a protein như đ a protein như đ ộ ộ t t í í ch ch đi đi ệ ệ n, k n, k í í ch thư ch thư ớ ớ c phân t c phân t ử ử , , đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein c a protein c ầ ầ n n chi chi ế ế t r t r ú ú t. Nhi t. Nhi ề ề u protein còn liên k u protein còn liên k ế ế t v t v ớ ớ i c i c á á c phân t c phân t ử ử sinh sinh h h ọ ọ c kh c kh á á c nên vi c nên vi ệ ệ c chi c chi ế ế t r t r ú ú t c t c á á c protein n c protein n à à y còn ph y còn ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o b o b ả ả n ch n ch ấ ấ t c t c ủ ủ a c a c á á c liên k c liên k ế ế t. t. Mu Mu ố ố n thu nh n thu nh ậ ậ n đư n đư ợ ợ c c c c á á c protein nguyên th c protein nguyên th ể ể t t ứ ứ c l c l à à protein c protein c ó ó t t ấ ấ t c t c ả ả t t í í nh ch nh ch ấ ấ t t t t ự ự nhiên đ nhiên đ ặ ặ c trưng c c trưng c ủ ủ a n a n ó ó , , c c ầ ầ n s n s ử ử d d ụ ụ ng c ng c á á c bi c bi ệ ệ n ph n ph á á p kh p kh á á c nhau. c nhau. 2 2 Nhi Nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ Đ Đ ể ể t t á á ch c ch c á á c protein kh c protein kh á á c nhau d c nhau d ự ự a trên k a trên k ế ế t t t t ủ ủ a c a c ủ ủ a a ch ch ú ú ng, n ng, n gư gư ờ ờ i ta c i ta c ó ó th th ể ể s s ử ử d d ụ ụ ng phương ph ng phương ph á á p bi p bi ế ế n t n t í í nh nh ch ch ọ ọ n l n l ọ ọ c nh c nh ờ ờ t t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a nhi a nhi ệ ệ t. t. M M ộ ộ t đi t đi ề ề u c u c ầ ầ n lưu ý l n lưu ý l à à ch ch ỉ ỉ nên d nên d ù ù ng đ ng đ ố ố i v i v ớ ớ i trư i trư ờ ờ ng h ng h ợ ợ p c p c á á c protein enzyme b c protein enzyme b ề ề n n v v ớ ớ i nhi i nhi ệ ệ t t . D . D ị ị ch protein enzyme đư ch protein enzyme đư ợ ợ c gi c gi ữ ữ ở ở 50 50 - - 70 70 0 0 C C trong th trong th ờ ờ i gian x i gian x á á c đ c đ ị ị nh, s nh, s au đ au đ ó ó protein t protein t ạ ạ p đã b p đã b ị ị bi bi ế ế n n t t í í nh đư nh đư ợ ợ c lo c lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ b b ằ ằ ng c ng c á á ch l ch l ọ ọ c ho c ho ặ ặ c ly tâm. c ly tâm. Như v Như v ậ ậ y, y, d d ị ị ch chi ch chi ế ế t protein thô b t protein thô b ề ề n v n v ớ ớ i nhi i nhi ệ ệ t c t c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c thu c thu nh nh ậ ậ n b n b ằ ằ ng c ng c á á ch cho k ch cho k ế ế t t t t ủ ủ a không thu a không thu ậ ậ n ngh n ngh ị ị ch ph ch ph ầ ầ n n l l ớ ớ n c n c á á c protein t c protein t ạ ạ p. p. 3 3 Nhi Nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ Đ Đ ể ể thu nh thu nh ậ ậ n ch n ch ế ế ph ph ẩ ẩ m protein theo phương m protein theo phương ph ph á á p k p k ế ế t t t t ủ ủ a thu a thu ậ ậ n ngh n ngh ị ị ch b ch b ằ ằ ng c ng c á á c mu c mu ố ố i trung i trung t t í í nh, c nh, c ầ ầ n ti n ti ế ế n h n h à à nh nh ở ở nhi nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ th th ấ ấ p, p, đ đ ố ố i v i v ớ ớ i dung i dung môi h môi h ữ ữ u cơ c u cơ c ầ ầ n ti n ti ế ế n h n h à à nh nh ở ở nhi nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ dư dư ớ ớ i 0 i 0 0 0 C C tr tr á á nh bi nh bi ế ế n t n t í í nh đ nh đ ặ ặ c bi c bi ệ ệ t l t l à à protein enzyme. . protein enzyme. . 4 4 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Protein l Protein l à à c c á á c ch c ch ấ ấ t lư t lư ỡ ỡ ng t ng t í í nh, v nh, v ì ì v v ậ ậ y, trong c y, trong c á á c c dung d dung d ị ị ch acid v ch acid v à à ki ki ề ề m ch m ch ú ú ng s ng s ẽ ẽ b b ị ị phân ly như phân ly như sau: sau: Ki Ki ề ề m m Protein Protein - - COOH COOH Protein Protein - - COO COO - - + H + H + + acid acid acid acid Protein Protein - - NH2 NH2 Protein Protein - - NH3 NH3 + + Ki Ki ề ề m. m. 5 5 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Do c Do c á á c acid amin trong chu c acid amin trong chu ỗ ỗ i polypeptide còn t i polypeptide còn t ồ ồ n t n t ạ ạ i i nhi nhi ề ề u nh u nh ó ó m ch m ch ứ ứ c t c t ự ự do dư do dư ớ ớ i d i d ạ ạ ng c ng c á á c ion h c ion h ó ó a l a l à à nguyên nguyên nhân t nhân t ạ ạ o ra t o ra t í í nh đa đi nh đa đi ệ ệ n c n c ủ ủ a protein. Phân t a protein. Phân t ử ử protein r protein r ấ ấ t t d d à à i nên nh i nên nh ó ó m ion t m ion t ự ự do t do t ậ ậ n c n c ù ù ng c ng c ủ ủ a chu a chu ỗ ỗ i polypeptide i polypeptide không đ không đ á á ng k ng k ể ể , ch , ch ủ ủ y y ế ế u c u c á á c nh c nh ó ó m ch m ch ứ ứ c t c t ự ự do kh do kh á á c c c c ủ ủ a a chu chu ỗ ỗ i bên (R) quy i bên (R) quy ế ế t đ t đ ị ị nh t nh t í í nh ch nh ch ấ ấ t t t t í í ch đi ch đi ệ ệ n c n c ủ ủ a phân t a phân t ử ử protein (nh protein (nh ó ó m cacboxyl c m cacboxyl c ủ ủ a amino acid, OH c a amino acid, OH c ủ ủ a a Tyrosine, Tyrosine, - - NH2 c NH2 c ủ ủ a lysine, guamidin c a lysine, guamidin c ủ ủ a Arginine, a Arginine, inidazol c inidazol c ủ ủ a histidine) a histidine) M M ứ ứ c đ c đ ộ ộ ion h ion h ó ó a c a c ủ ủ a c a c á á c nh c nh ó ó m n m n à à y ph y ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o gi o gi á á tr tr ị ị pH. C pH. C á á c nh c nh ó ó m acid m acid ở ở d d ạ ạ ng anion trong môi trư ng anion trong môi trư ờ ờ ng ki ng ki ề ề m, m, c c á á c nh c nh ó ó m ki m ki ề ề m t m t ồ ồ n t n t ạ ạ i i ở ở d d ạ ạ ng cation trong môi trư ng cation trong môi trư ờ ờ ng ng acid acid 6 6 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) ở ở m m ộ ộ t gi t gi á á tr tr ị ị pH x pH x á á c đ c đ ị ị nh, m nh, m ỗ ỗ i phân t i phân t ử ử protein c protein c ó ó m m ộ ộ t t đi đi ệ ệ n t n t í í ch t ch t ổ ổ ng s ng s ố ố n n à à o đ o đ ấ ấ y m y m à à đ đ ộ ộ l l ớ ớ n c n c ủ ủ a n a n ó ó ph ph ụ ụ thu thu ộ ộ c c v v à à o s o s ố ố lư lư ợ ợ ng c ng c á á c nh c nh ó ó m t m t í í ch đi ch đi ệ ệ n dương v n dương v à à t t í í ch đi ch đi ệ ệ n âm. n âm. K K ế ế t qu t qu ả ả l l à à ở ở gi gi á á tr tr ị ị n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ ion hydro c ion hydro c ố ố đ đ ị ị nh, c nh, c á á c c protein kh protein kh á á c nhau trong h c nhau trong h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p s p s ẽ ẽ c c ó ó t t ổ ổ ng đi ng đi ệ ệ n t n t í í ch ch kh kh á á c nhau. Nhi c nhau. Nhi ề ề u phương ph u phương ph á á p d p d ù ù ng đ ng đ ể ể t t á á ch c ch c á á c h c h ỗ ỗ n n h h ợ ợ p protein đ p protein đ ề ề u d u d ự ự a v a v à à o đ o đ ặ ặ c t c t í í nh n nh n à à y. C y. C á á c phân t c phân t ử ử protein mang đi protein mang đi ệ ệ n t n t í í ch t ch t ổ ổ ng s ng s ố ố ( ( dương ho dương ho ặ ặ c âm) c c âm) c ù ù ng ng d d ấ ấ u đ u đ ẩ ẩ y nhau ra xa nên d y nhau ra xa nên d ễ ễ tan v tan v à à o dung d o dung d ị ị ch. M ch. M ỗ ỗ i m i m ộ ộ t t protein c protein c ó ó m m ộ ộ t gi t gi á á tr tr ị ị pH nh pH nh ấ ấ t đ t đ ị ị nh m nh m à à ở ở đ đ ó ó t t ổ ổ ng s ng s ố ố đi đi ệ ệ n n t t í í ch âm v ch âm v à à đi đi ệ ệ n t n t í í ch dương trong phân t ch dương trong phân t ử ử b b ằ ằ ng không. ng không. Gi Gi á á tr tr ị ị đ đ ó ó g g ọ ọ i l i l à à đi đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n c n c ủ ủ a protein. a protein. 7 7 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Đi Đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n c n c ủ ủ a c a c á á c acid amin trung t c acid amin trung t í í nh c nh c ó ó gi gi á á tr tr ị ị pH t pH t ừ ừ 5 5 ,6 ,6 - - 7 7 ,0; ,0; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh acid nh acid (dicarboxylic) l (dicarboxylic) l à à t t ừ ừ 3 3 ,0 ,0 - - 3 3 ,2; ,2; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh ki nh ki ề ề m (diamino) l m (diamino) l à à t t ừ ừ 9,7 9,7 - - 10,8. 10,8. Ở Ở đi đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n, n, đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein l a protein l à à th th ấ ấ p nh p nh ấ ấ t, protein d t, protein d ễ ễ b b ị ị k k ế ế t t t t ủ ủ a. D a. D ự ự a v a v à à o t o t í í nh ch nh ch ấ ấ t n t n à à y, y, ngư ngư ờ ờ i ta c i ta c ó ó th th ể ể t t á á ch t ch t ừ ừ ng ng ph ph ầ ầ n c n c á á c protein enzyme trong h c protein enzyme trong h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p. p. 8 8 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Đi Đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n c n c ủ ủ a c a c á á c acid amin trung t c acid amin trung t í í nh c nh c ó ó gi gi á á tr tr ị ị pH t pH t ừ ừ 5 5 ,6 ,6 - - 7 7 ,0; ,0; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh acid nh acid (dicarboxylic) l (dicarboxylic) l à à t t ừ ừ 3 3 ,0 ,0 - - 3 3 ,2; ,2; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh ki nh ki ề ề m (diamino) l m (diamino) l à à t t ừ ừ 9,7 9,7 - - 10,8. 10,8. Ở Ở đi đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n, n, đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein l a protein l à à th th ấ ấ p nh p nh ấ ấ t, protein d t, protein d ễ ễ b b ị ị k k ế ế t t t t ủ ủ a. D a. D ự ự a v a v à à o t o t í í nh ch nh ch ấ ấ t n t n à à y, y, ngư ngư ờ ờ i ta c i ta c ó ó th th ể ể t t á á ch t ch t ừ ừ ng ng ph ph ầ ầ n c n c á á c protein enzyme trong h c protein enzyme trong h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p. p. 9 9 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) gi gi ố ố ng như trư ng như trư ờ ờ ng h ng h ợ ợ p t p t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a nhi a nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ trong vi trong vi ệ ệ c c t t á á ch chi ch chi ế ế t protein, c t protein, c ó ó th th ể ể d d ù ù ng phương ph ng phương ph á á p bi p bi ế ế n t n t í í nh nh ch ch ọ ọ n l n l ọ ọ c nh c nh ờ ờ t t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a pH c a pH c ủ ủ a môi trư a môi trư ờ ờ ng. D ng. D ị ị ch ch protein enzyme đư protein enzyme đư ợ ợ c gi c gi ữ ữ ở ở pH 5 trong th pH 5 trong th ờ ờ i gian x i gian x á á c c đ đ ị ị nh. Protein t nh. Protein t ạ ạ p b p b ị ị bi bi ế ế n t n t í í nh c nh c ũ ũ ng đư ng đư ợ ợ c lo c lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ b b ằ ằ ng ng c c á á ch l ch l ọ ọ c ho c ho ặ ặ c ly tâm. V c ly tâm. V í í d d ụ ụ citochrom C c citochrom C c ũ ũ ng tan trong ng tan trong acid trichloracetic trong khi đ acid trichloracetic trong khi đ ó ó acid n acid n à à y l y l à à m k m k ế ế t t t t ủ ủ a ph a ph ầ ầ n n l l ớ ớ n protein. n protein. Như v Như v ậ ậ y c y c á á c protein b c protein b ề ề n v n v ớ ớ i acid c i acid c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c t c t á á ch chi ch chi ế ế t b t b ằ ằ ng c ng c á á ch n ch n à à y. y. 10 10 T T á á c nhân h c nhân h ó ó a h a h ọ ọ c c C C ó ó th th ể ể d d ù ù ng mu ng mu ố ố i trung t i trung t í í nh ho nh ho ặ ặ c c c c á á c dung môi h c dung môi h ữ ữ u cơ u cơ đ đ ể ể t t á á ch chi ch chi ế ế t c t c á á c protein enzyme. c protein enzyme. Phương ph Phương ph á á p n p n à à y y đư đư ợ ợ c ti c ti ế ế n h n h à à nh d nh d ự ự a tr a tr ệ ệ n cơ s n cơ s ở ở : : đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein a protein ph ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o s o s ự ự tương t tương t á á c c c c ủ ủ a c a c á á c nh c nh ó ó m t m t í í ch đi ch đi ệ ệ n n trong phân t trong phân t ử ử protein v protein v ớ ớ i c i c á á c phân t c phân t ử ử nư nư ớ ớ c. S c. S ự ự tương tương t t á á c đ c đ ó ó (còn g (còn g ọ ọ i l i l à à s s ự ự hydrate h hydrate h ó ó a) s a) s ẽ ẽ b b ị ị gi gi ả ả m xu m xu ố ố ng khi ng khi thêm v thêm v à à o dung d o dung d ị ị ch protein enzyme c ch protein enzyme c á á c dung môi h c dung môi h ữ ữ u u cơ ho cơ ho ặ ặ c c c c á á c mu c mu ố ố i trung t i trung t í í nh. nh. Dung môi h Dung môi h ữ ữ u cơ thư u cơ thư ờ ờ ng d ng d ù ù ng l ng l à à etanol, isopropanol, etanol, isopropanol, acetone ho acetone ho ặ ặ c h c h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p c p c á á c lo c lo ạ ạ i rư i rư ợ ợ u u . . [...]... Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dung dịch đệm thích hợp, dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thuộc vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu 21 Tách enzyme Enzyme là... hòa tan của nó lại rất lớn (bảo hòan 767g/l ở 25 0C) nồng độ (NH4)2SO4 cần thiết để kết tủa protein enzyme khác nhau thì khác nhau 12 Tác nhân hóa học Có thể dùng (NH4)2SO4 ở cả 2 dạng: dạng bột và dạng dung dịch bảo hòa Khi dùng bột, người ta cho từng ít một vào dịch chiết protein enzyme Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đến lượng kết tủa ban đầu của protein enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có... Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội bào, bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch 16 Phá vỡ tế bào Protein enzyme có trong tất cả các... 00C và có thể đến -20 0C, như vậy có tác dụng tốt đến độ ổn định của protein enzyme Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy ly tâm lạnh 11 Tác nhân hóa học Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, người ta đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó không làm hại mà làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme Loại muối này... dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào) 17 Phá vỡ tế bào Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt... emzyme, vì phương pháp khá đơn giản 14 Phá vỡ tế bào Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào) 15 Phá vỡ tế bào Các protein enzyme nội bào có thể tồn tại ở dạng hòa tan trong... nhận chúng từ các nguồn sinh học Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh chế chúng 22 Tách enzyme Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều,... sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng Sự tổng hợp một lượng đáng kể enzyme gọi là siêu 34 tổng hợp enzyme Tách enzyme Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: 1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp nổi ) 2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu (phương pháp chìm) 35 Tách enzyme Phương... lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme 32 Tách enzyme Tuy vậy trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung các vi sinh vật muốn được sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn các điều kiện sau: - Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn - Dễ tách enzyme. .. ngắn (từ 16 – 100 giờ) vì vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm 27 Tách enzyme Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Vì vậy chỉ cần một lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất Số liệu tính toán cho biết, trong vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40 lần so với trọng lượng cơ thể chúng Trong khi đó, hệ enzyme của . như sau: sau: Ki Ki ề ề m m Protein Protein - - COOH COOH Protein Protein - - COO COO - - + H + H + + acid acid acid acid Protein Protein - - NH2 NH2 Protein Protein - - NH3 NH3 + + Ki Ki ề ề m trư ờ ờ ng h ng h ợ ợ p c p c á á c protein enzyme b c protein enzyme b ề ề n n v v ớ ớ i nhi i nhi ệ ệ t t . D . D ị ị ch protein enzyme đư ch protein enzyme đư ợ ợ c gi c gi ữ ữ ở ở 50 50. hòan 767g/l ở ở 25 25 0 0 C) C) n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ (NH (NH 4 4 ) ) 2 2 SO SO 4 4 c c ầ ầ n thi n thi ế ế t đ t đ ể ể k k ế ế t t t t ủ ủ a protein a protein enzyme kh enzyme kh á á c nhau