TP HỒ CHÍ MINH, 1/2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG CBHD: ThS. TRẦN THỊ TƯỞNG AN KS. QUÁCH ĐỨC TÍNH SVTH: NGUYỄN HỮU DOÃN MSSV: 60600311 BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN LỜI CẢM ƠN Trong khoảng 4 tháng làm luận văn, tôi xin chân thành cảm ơn sâu sắc đến: Phó Giáo Sư, Tiến Sĩ Nguyễn Thúy Hương – Bộ môn Công nghệ Sinh học, Đại học Bách Khoa Tp HCM đã nhiệt tình giúp đỡ các vấn đề liên quan và tặng giống vi sinh vật dùng trong đề tài. Thạc Sĩ Trần Thị Tưởng An đã ân cần hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ trong suốt quá trình làm luận văn. Kỹ Sư Quách Đức Tính đã tặng giống và hướng dẫn tận tình trong quá trình thực hiện đề tài này. Các cán bộ phòng thí nghiệm 102, 108 và 117B2 đã tạo điều kiện cho tôi có thể sử dụng các thiết bị và dụng cụ phục vụ cho đề tài. Cha mẹ và người thân đã giúp đỡ về mặt tinh thần và kinh tế để tôi có thể an tâm hoàn thành luận văn. Các bạn sinh viên lớp HC06BSH – Đại học Bách Khoa Tp HCM đã cùng giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Và cuối cùng là gửi đến các quý thầy cô trong hội đồng phản biện đã giành thời gian đọc và nhận xét luận văn này. Tp HCM, ngày 10 tháng 01 năm 2011 Sinh viên thực hiện Nguyễn Hữu Doãn TÓM TẮT Bacteriocin là một loại protein do vi khuẩn lên men tạo ra. Với mục tiêu tìm hiểu thêm về tổ hợp vi khuẩn lactic trong hạt kefir và khả năng sinh bacteriocin của chủng LAB nên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập hệ vi khuẩn lactic có hoạt tính bacteriocin trong hạt kefir và ứng dụng”. Quá trình thí nghiệm chúng tôi đã thực hiện những nội dung và đạt kết quả như sau: Nội dung đề tài: 1. Phân lập hệ vi khuẩn lactic từ hạt kefir có nguồn gốc từ bộ môn Công nghệ sinh học – Đại học Bách Khoa Tp HCM, thử khả năng sinh hoạt tính bacteriocin, định danh chủng mục tiêu bằng bộ kit API 50 CHL. 2. Lên men thu nhận bacteriocin. 3. Ứng dụng bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế. Kết quả đề tài: 1. Kết quả phân lập hệ vi khuẩn lactic từ hạt kefir: Phân lập được bảy chủng vi khuẩn. Có sáu chủng Gram dương (đều là vi khuẩn lactic) và một chủng Gram âm. 2. Thử khả năng sinh hoạt tính bacteriocin: có tất cả sáu chủng sinh hoạt tính bacteriocin. 3. Kết quả khảo sát hoạt tính bacteriocin: Hoạt tính bacteriocin thô của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) là 457 AU/ml. 4. Khảo sát bảo quản cá Diêu Hồng: So với mẫu đối chứng (không tác nhân bảo quản) thì mẫu bảo quản bằng dịch bacteriocin thô kết hợp với dịch chitosan 1% bảo quản tối đa ba ngày. i MỤC LỤC MỤC LỤC i CÁC TỪ VIẾT TẮT iii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v DANH MỤC SƠ ĐỒ vi MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 1.1. Kefir 2 1.1.1. Nguồn gốc và sự hình thành 2 1.1.2. Cấu tạo hạt kefir 2 1.1.3. Hệ vi sinh vật trong hạt kefir 4 1.2. Vi khuẩn lactic 6 1.2.1. Khái niệm 6 1.2.2. Phân loại 6 1.2.3. Đặc điểm chung. 7 1.3. Bacteriocin 8 1.3.1. Giới thiệu chung 8 1.3.2. Phân loại 9 1.3.3. Tính chất 11 1.3.4. Hoạt động của bacteriocin 12 1.3.5. Tính kháng khuẩn và phương pháp xác định tính kháng khuẩn. 14 1.3.6. Một số loài vi khuẩn khác sinh bacteriocin 15 1.3.7. Ứng dụng của bacteriocin 16 1.4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất bacteriocin 17 1.4.1. Các nghiên cứu trong nước 17 1.4.2. Các nghiên cứu nước ngoài 20 1.5. Cá Diêu Hồng 22 1.5.1. Giới thiệu sơ lược 22 1.5.2. Tình hình nuôi ở Việt Nam 22 1.5.3. Hệ vi sinh vật cá 23 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 25 2.1. Vật liệu 25 ii 2.1.1. Giống vi sinh vật 25 2.1.2. Môi trường nuôi cấy 25 2.1.3. Hóa chất 25 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ 25 2.2. Nội dung đề tài 25 2.3. Phương pháp thí nghiệm 26 2.3.1. Phân lập hệ LAB trong hạt kefir 26 2.3.2. Quan sát đặc điểm đại thể và vi thể 27 2.3.3. Thử khả năng sinh acid lactic 28 2.3.4. Khảo sát đặc điểm sinh lý 28 2.3.5. Các thử nghiệm sinh hóa 28 2.3.6. Khảo sát khả năng sinh bacteriocin 29 2.3.7. Xác định hoạt tính bacteriocin 30 2.3.8. Định danh vi khuẩn bằng bộ kit định danh API 50 CHL 30 2.3.9. Thăm dò việc sử dụng bacteriocin thô để bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 31 2.4. Phương pháp phân tích 32 2.4.1. Phương pháp đánh giá cảm quản 32 2.4.2. Phương pháp phân tích tổng số vi khuẩn hiếu khí 34 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ & THẢO LUẬN 35 3.1. Hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir 35 3.1.1. Đặc điểm đại thể và vi thể 35 3.1.2. Khảo sát khả năng sinh acid lactic 38 3.1.3. Đặc điểm sinh lý 39 3.1.4. Đặc điểm sinh hóa 40 3.1.5. Kiểm tra hoạt tính bacteriocin 42 3.1.6. Định danh vi khuẩn lactic bằng bộ kit API 50 CHL 45 3.2. Ứng dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu 45 3.2.1. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin 45 3.2.2. Sử dụng bacteriocin để bảo quản cá diêu hồng 46 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 53 4.1. Kết luận 53 4.2. Kiến nghị 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 PHỤ LỤC 57 iii CÁC TỪ VIẾT TẮT ATP : adenosine triphosphate CFU : colony forming unit – Đơn vị hình thành một khuẩn lạc DNA : deoxy nucleotide acid ĐC: đối chứng LAB : lactic acid bacteria - Vi khuẩn sinh acid lactic rRNA : ribosome ribonucleotide acid TSVKHK : tổng số vi khuẩn hiếu khí iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng trong 100g kefir. 3 Bảng 1.2. Tóm tắt hệ vi sinh vật phân lập trong hạt kefir. 5 Bảng 1.3. Một số đặc điểm phân loại LAB theo Orla-Jensen (1919). 7 Bảng 1.4. Bacteriocin của một số chủng vi khuẩn 15 Bảng 2.1. Các mẫu khảo sát phương pháp bảo quản cá 32 Bảng 2.2. Bảng đánh giá chất lượng cảm quan bảo quản cá sơ chế 33 Bảng 3.1. Đặc điểm đại thể và vi thể của hệ vi khuẩn lactic phân lập từ hạt kefir. 35 Bảng 3.2. Đặc điểm sinh lý của hệ vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 39 Bảng 3.3. Kết quả thử khả năng sinh catalase của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 40 Bảng 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ hạt kefir. 40 Bảng 3.5. Khả năng kháng khuẩn của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) 45 Bảng 3.6. Các phương pháp bảo quản cá sơ chế tối thiểu 47 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hạt kefir. 3 Hình 1.3. Hạt kefir dưới kính hiển vi điện tử. 4 Hình 3.1. Đặc điểm đại thể của hệ vi khuẩn phân lập từ hạt kefir. 36 Hình 3.2. Đặc điểm vi thể của hệ vi khuẩn phân lập từ hạt kefir 37 Hình 3.3. Khả năng sinh acid làm tan CaCO 3 trên môi trường carbonate agar của 6 chủng phân lập. 38 Hình 3.4. Khả năng sinh acid lactic làm đổi màu thuốc thử unphenmen của sáu chủng phân lập 39 Hình 3.5. Khả năng lên men đường lactose của sáu chủng vi khuẩn. 41 Hình 3.6. Khả năng lên men đường sucrose của sáu chủng vi khuẩn. 41 Hình 3.7. Khả năng lên men đường sorbitol của sáu chủng vi khuẩn. 41 Hình 3.8. Khả năng lên men đường glucose của sáu chủng vi khuẩn. 42 Hình 3.9. Khả năng tạo vùng kháng khuẩn của các chủng phân lập 44 Hình 3.10. Kết quả bộ kit định danh chủng L2 phân lập từ hạt kefir 45 Hình 3.11. Khả năng kháng khuẩn của dịch bacteriocin của chủng Lactobacillus acidophilus (L2) đối với E. coli 46 Hình 3.12. Bảo quản cá diêu hồng sơ chế tối thiểu bằng dịch bacteriocin thô 48 Hình 3.13. Biểu đồ so sánh điểm chung đánh giá cho các mẫu khảo sát 49 Hình 3.14. Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ nhất49 Hình 3.15. Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ hai 50 Hình 3.16. Biểu đồ tổng số vi khuẩn hiếu khí của các mẫu khảo sát trong ngày thứ ba . 51 Hình 3.17. Biểu đồ phần trăm độ hao hụt khối lượng của các mẫu khảo sát 51 [...]... nhận và ứng dụng rộng rãi trong vi c bảo quản Vi c tìm ra những loại bacteriocin mới để có thể ứng dụng đã làm tốn rất nhiều công sức của các nhà khoa học Trong khi đó, kefir với tổ hợp các vi sinh vật sống cộng sinh với nhau mà chúng ta có thể xét đến đó là tổ hợp LAB có trong hạt kefir có hoạt tính bacteriocin mạnh Do đó, nhiệm vụ của luận văn được giao: “ PHÂN LẬP HỆ VI KHUẨN LACTIC CÓ HOẠT TÍNH BACTERIOCIN. .. colicin, do vi khuẩn E.coli tổng hợp Bacteriocin của vi khuẩn Gram âm có khả năng kháng khuẩn yếu hơn bacteriocin của vi khuẩn Gram dương Bacteriocin của vi khuẩn Gram dương: các bacteriocin này cũng nhiều như ở vi khuẩn Gram âm Tuy nhiên chúng khác vi khuẩn Gram âm ở hai điểm sau: vi c tạo bacteriocin không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật chủ và sự sinh tổng hợp bacteriocin của vi khuẩn Gram... bacteriolytic có trọng lượng phân tử thấp, có những đặc tính giống bacteriocin và rất khó để phân biệt Tóm lại có nhiều yếu tố có tính kháng khuẩn không có bản chất bacteriocin Như bacteriophage là một loại virus cũng có khả năng diệt vi khuẩn hay antibiotic là một loại kháng sinh cũng có khả năng diệt vi khuẩn Vì vậy tính kháng khuẩn do nhiều nguyên nhân gây nên và một trong những nguyên nhân tạo nên tính. .. để tiến tới sử dụng chúng trong bảo quản cá Giò nguyên liệu tươi Vi khuẩn lactic được phân lập và tuyển chọn trên môi trường MRS và cho thử hoạt tính đối kháng với vi khuẩn đích Salmonella typhimurium Kết quả cho thấy đề tài đã phân lập được 45 chủng vi khuẩn lactic trong đó có 12 chủng kháng mạnh nhất với Salmonella Các chủng đều là vi khuẩn Gram dương, phản ứng âm tính với oxidase và catalase Kết... bacteriocin, trong đó có LAB được quan tâm nhiều nhất do bacteriocin của LAB có phổ kháng khuẩn rộng và có tiềm năng được dùng làm chất bảo quản thực phẩm và ứng dụng trong dược phẩm [1] 1.3.2 Phân loại Có một lượng lớn những bacteriocin được sản xuất từ LAB và được phân loại theo những đặc tính hóa sinh và di truyền học của chúng Sơ đồ 1.1 Phân loại bacteriocin của vi khuẩn Gram dương theo Cotter và cộng sự Bacteriocin. .. 20 phút tại 121ºC Đặc tính chịu nhiệt có thể liên quan đến cấu trúc phân tử của bacteriocin 1.3.4 Hoạt động của bacteriocin 1.3.4.1 Phạm vi hoạt động của bacteriocin Xem xét phạm vi kháng khuẩn, giống vi sinh vật sinh ra, khối lượng phân tử, tính ổn định, tính chất hóa sinh, và kiểu hoạt động của bacteriocin Hầu hết các bacteriocin được sinh tổng hợp bởi vi khuẩn gram âm có hoạt tính ức chế các loài... TÍNH BACTERIOCIN TRONG HẠT KEFIR VÀ ỨNG DỤNG ” Luận văn gồm ba phần chính: + Phân lập hệ vi khuẩn lactic trong hạt kefir, khảo sát khả năng sinh bacteriocin, định danh chủng mục tiêu + Lên men thu nhận bacteriocin + Ứng dụng bảo quản cá Diêu Hồng sơ chế 1 Chương 1 Tổng quan tài liệu CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Kefir 1.1.1 Nguồn gốc và sự hình thành Kefir là một sản phẩm truyền thống có nguồn gốc cách... trọng cho vi c nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic sinh bacteriocin trong bảo quản thực phẩm 1.4.2 Các nghiên cứu nước ngoài Hiên nay vi c nghiên cứu, ứng dụng bacteriocin do vi khuẩn lactic sinh tổng hợp nên đang là một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm Và cũng đã có những công trình nghiên cứu và ứng dụng thành công, góp phần vào vi c nâng cao chất lượng cuộc sống của nhân loại Bacteriocin. .. Bacteriocin là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh, nhờ khả năng này mà vi c ứng dụng của vi khuẩn lactic đa dạng và phong phú hơn Năm 1999, các tác giả Raf Callewaert và Luc De Vuyst đã nghiên cứu vi c sinh tổng hợp bacteriocin của Lactobacillus amylovorus DCE 471 và có ứng dụng cải tiến và làm ổn định các sản phẩm lên men Vi c sinh tổng hợp thu nhận bacteriocin bị ức chế bởi... phát triển của các vi khuẩn đường ruột có hại Điểm đặc biệt nữa của chúng là có khả năng sống được trong điều kiện môi trường acid cao, khả năng chịu mặn lớn Bacteriocin được ứng dụng nhiều trong thực phẩm Bacteriocin được ứng dụng trong giai đoạn đầu của vi c ủ bột làm bánh mì, trong lên men xúc xích (kháng Listeria) và trong sản xuất phomai (kháng Listeria và Clostridium) Ứng dụng bảo quản thịt: . thành 2 1. 1.2. Cấu tạo hạt kefir 2 1. 1.3. Hệ vi sinh vật trong hạt kefir 4 1. 2. Vi khuẩn lactic 6 1. 2 .1. Khái niệm 6 1. 2.2. Phân loại 6 1. 2.3. Đặc điểm chung. 7 1. 3. Bacteriocin 8 1. 3 .1. Giới. Isoleucine 0. 21 E 0 .11 Threonine 0 .17 D 0.08 Lysine 0.27 B6 0.05 Valine 0.22 B2 0 .17 Vitamin C 1 A 0.06 B1 0.04 Carotene 0.02 B12 0.05 [22] Chương 1. Tổng quan tài liệu 4 1. 1.3. Hệ vi. bacteriocin 15 1. 3.7. Ứng dụng của bacteriocin 16 1. 4. Các nghiên cứu trong và ngoài nước về sản xuất bacteriocin 17 1. 4 .1. Các nghiên cứu trong nước 17 1. 4.2. Các nghiên cứu nước ngoài 20 1. 5.