ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ Câu 1: Interferon (IFN) Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất bởi các tế bào của hệ thống miễn dịch ở hầu hết các động vật nhằm chống lại các tác nhân ngoại lai như virus, vi khuẩn, kí sinh trùng và các tế bào ung thư. IFN thuộc một lớp lớn của glycoprotein được biết đến dưới cái tên cytokine (chất hoạt hóa tế bào). 1. Các tính chất của IFN IFN là những protein hoặc dẫn xuất của protein có chút ít gluxit có trọng lượng phân tử từ 2,5x10^4 đến 2,5x10^6 Dal với hằng số lắng 4,77s. IFN tương đối bền với nhiệt (60-75 0 C đun trong 60 phút hoặc 100 0 C đun trong 5 phút mới phân hủy), bảo quản trong nhiều tháng ở 4 0 C. IFN bền với pH thấp (không mất hoạt tính ở pH2) IFN có tính kháng nguyên yếu tạo thành sau 1-2h tế bào bị kích thích, tồn tại trong máu từ vài ngày đến vài tuần. Đặc tính quan trọng là không có tính đặc hiệu với Virus (IFN được sinh ra do 1 loại VR có thể kìm hãm sự nhân lên của những VR khác) nhưng có tính đặc hiệu với tế bào, nghĩa là IFN sinh ra ở tế bào A chỉ bảo vệ được tế bào A mà không bảo vệ được các tế bào khác. Gen mã hóa IFN nằm sẵn trong tế bào và bị ức chế, khi VR tác động nó sẽ giải ức chế gen này (Sơ đồ) 2. Các loại IFN và nguồn tế bào sinh ra nó Tính chất IFN alpha (IFN bạch cầu) IFN beta (IFN nguyên bào sợi) IFN gama (IFN miễn dịch, hay IFN của yếu tố hoạt hóa đại thực bào) Nguồn gốc Bạch cầu (bao gồm Lympho B và T, đại thực bào), biểu mô (tế bào màng trong, nguyên bào xương…) Nguyên bào sợi Tế bào T hoạt hóa và tế bào hủy diệt NK. Ngoài ra còn có T hỗ trợ 1 (T helper 1) và tế bào bạch cầu mới ở vị trí nhiễm trùng. Tác nhân c/ư Virus, tế bào ung thư Virus, tế bào ung thư Đáp ứng MD đặc hiệu và phản ứng viêm. Cơ chế t/đ Kích thích sản xuất AVP (antivaral protein-pr kháng VR) Kích thích sản xuất AVP Kích thích hoạt động đại thực bào, bạch cầu trung tính. Ngoài ra còn có IFN omega được các tế bào bạch cầu sản sinh ra ngay tại nơi nhiễm trùng và tại khối u. 3. Sơ đồ cơ chế tác động chống Virus của IFN a. Kháng Virus: Phần lớn RNA và DNA virus đều nhạy cảm với IFN nhưng cơ chế và cường độ tác động thay đổi tùy loại virus. Sau khi nhiễm virus, tế bào bị cảm ứng và sản sinh ra IFN, IFN không có tác dụng bảo vệ tế bào mẹ mà chỉ bảo vệ các tế bào bên cạnh, ở các tế bào này virus vẫn hấp phụ lên vách tế bào và xâm nhập vào bên trong tế bào, nhưng đến giai đoạn sao chép thông tin của virus thì IFN có tác dụng ức chế, kìm hãm sự tổng hợp mARN của virus, mARN của virus không được tổng hợp thì sự chuyển hóa axit nucleic và protein của virus cũng không tiến hành được, do đó không có hạt virus mới được giải phóng ra. Nguyên nhân là khi IFN ngấm vào tế bào đã gây cảm ứng để hoạt hóa một đoạn gen của tế bào này nhằm tổng hợp ra một chất gọi là protein kháng virus (AVP: antivaral protein), chính protein kháng virus này là nhân tố cản trở sự nhân lên của virus, cụ thể là cản trở phiên dịch thông tin từ mARN. Sự xuất hiện của 1 trong các protein này (2’5’ oligo A synthase) dẫn đến sự hoạt hoá thứ hai của chúng (một ribonuclease) có thể phá huỷ mARN và sự xuất hiện của protein thứ 3 (một protein kinase) dẫn đến sự ức chế bước đầu tiên của quá trình tổng hợp protein. Điều này ức chế quá trình tổng hợp protein của virus nhưng cũng làm ức chế tổng hợp protein của tế bào chủ. Vì vậy, các protein này chỉ được tạo ra và hoạt hoá khi cần. Interferon đã kích hoạt sự tổng hợp dạng không hoạt động của các protein này trong tế bào đích. Double- stranded ARN là nhân tố hoạt hoá các protein này. Nó trực tiếp hoạt hoá 2’5’ oligo A synthase và protein kinase R và hoạt hoá gián tiếp ribonuclease L. b. Kháng ung thư IFN kích thích hệ miễn dịch của cơ thể chống lại khối ung thư, cơ chế hiện nay vẫn chưa được hiểu rõ đầy đủ. Tuy nhiên, có thể theo các cơ chế sau: - Trì hoãn hoặc dừng sự phân chia của các tế bào ung thư - Giảm khả năng tự bảo vệ của các tế bào ung thư đối với hệ miễn dịch của cơ thể. - Tăng cường khả năng miễn dịch của cơ thể. 4. Sản xuất IFN Bước 1: Tách tế bào tủy xương ARNm anpha Bước 2: Phiên mã ngược để tạo ra ADN Bước 3: Đưa gen này vào plasmid PBR322, biến nạp vào E.coli. Bước 4: Tách chiết IFN anpha từ E.coli bằng phương pháp nghiền cơ học. Bước 5: Kết tủa bằng polyethylenimine, sau đó kết tủa bằng (NH 4 ) 2 SO 4 Bước 6: Thẩm tích (tách các thành phần trong chất lỏng). Bước 7: Sắc kí bằng miễn dịch hấp phụ (immuno adsocption) (các kháng nguyên đơn dòng) Bước 8: Sắc kí bằng thay đổi cation. 5. Ứng dụng của IFN a. Đối với con người - IFN anpha và beta đã được ứng dụng trong điều trị một số bệnh do VR gây ra cho con người, chẳng hạn như: viêm gan C cấp và mãn, viêm gan B mãn (2 loại viêm gan này sử dụng IFN kết hợp với tri-3-vinyl để điều trị), HIV (sử dụng IFN phối hợp AZT chống HIV ngay từ giai đoạn đầu), ung thư vòm họng, ung thư não, ung thư cổ tử cung… - Do tác dụng chống tăng sinh, IFN được sử dụng để điều trị các bệnh u hắc tố (melanoma) và u bướu thịt Kasopi (Kasopi’s sarcoma)… b. Trong thú y - Dùng làm tá dược trong vaccine: tăng hiệu quả và giảm liều dùng vaccine, kết hợp vaccine trong điều trị lở mồm long móng ở gia súc. - Chẩn đoán bệnh lao ở bò, lao và phong hủi ở người. - Cho vào thuốc nhỏ mũi chống VR gây bệnh đường hô hấp (BHV) ở trâu bò. - Tăng sức đề kháng đối với các bệnh truyền nhiễm do Salmonella, E.coli… - Ứng dụng hiệu quả trong điều trị bệnh: cúm, Gumboro, Marek, viêm gan B do VR ở gia cầm. Câu 2: Quá trình sinh tổng hợp Ribosome có nhân bé tham gia Hạch nhân hay nhân con (nucleolus) là 1 cấu trúc có dạng hình cầu nằm trong nhân nơi rARN được phiên mã và các tiểu phần được tổ hợp để hình thành ra Rib. Nhân con có đặc tính nhuộm màu kiềm (do có sự tập trung cao độ chất ribonucleoprotein), đây là thành phần có cấu trúc đông đặc nhất của tế bào, có sự liên hệ di truyền với NST và có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp rARN. Ở vào cuối kì đầu của NP, nhân con hòa tan vào trong nhân và biến mất đến đầu kì cuối nó lại xuất hiện ở dạng các thể dính với NST và gian kì tiếp theo nhân con trong các tế bào con có sự liên hệ di truyền với NST. Cấu tạo 1 nhân con gồm: một số búi ADN từ nhiều NST, mỗi NST chứa 1 nhóm gen rARN (người ta gọi mỗi một nhóm gen này là tác nhân tạo nhân con trong đó các gen rARN được phiên mã nhờ ARN pol I). Sự bắt đầu quá trình bọc gói rARN có thể quan sát thấy được dưới KHV điện tử của những gen này, đầu 5’ được bao bọc bới hạt giàu pr mà không thể thấy xuất hiện trên phiên mã của mỗi loại gen khác. Thành phần sinh hóa trong nhân con bao gồm: - ADN hạch nhân _ trung tâm tổ chức hạch nhân của NST chịu trách nhiệm tổng hợp rARN - rARN: rARN 45S, 35S, 28S…là các rARN đang trong quá trình chín để tạo thành rARN của Ribosome (rARN 28S, 18S và 5,8S…) - Protein hạch nhân: histon, pr Rib - Enzym: ARN- polimerase (tổng hợp nên các rARN), enzym chịu trách nhiệm xử lý quá trình chín của các rARN (chế biến rARN 45S thành các rARN chín) Chức năng của nhân con: người ta theo dõi chức năng của nhân nhờ 1 bộ ba đánh dấu ARN chứa H3-uridine. Sau khi nuôi trong một thời gian trên môi trường bằng cách sử dụng tách ly phân đoạn tế bào để tách rARN và NST của nó. Do đó cũng tách thêm được nhân con có nguyên tử đánh dấu H3-uridine. Nhân con có vai trò tổng hợp rARN, đóng gói và tích lũy Rib, ngoài ra nó còn điều chỉnh sự vận chuyển các mARN từ nhân ra tế bào chất và có vai trò điều chỉnh quá trình phân bào. Protein Rib được tổng hợp trong tế bào chất sau đó được chuyển vào nhân và hạch nhân. Các pr này liên kết với rARN để tạo nên các tiền Rib trong hạch nhân. Các dạng tiền Rib trong hạch nhân là các đơn vị nhỏ 40S và 60S. + 40S: pr kết hợp rARN 18S + 60S: pr kết hợp rARN 28S; 5,8S và 5S. Các đơn vị nhỏ này sẽ qua lỗ màng nhân ra ngoài tế bào chất để tạo thành Rib khi tế bào cần đến.  Quá trình tổng hợp Rib: 5 bước - Người ta chứng minh rằng đoạn rARN 45S tiếp xúc với 1 tổ hợp phức tạp chứa một số pr khác nhau được vận chuyển từ tế bào chất mà ở đó nhiều loại pr được tổng hợp nên, phần lớn trong số 80 chuỗi polypeptit khác nhau đi vào cấu tạo Rib, trong đó pr kết hợp rARN 5S để chỉ huy quá trình tổng hợp rARN. - Nhân con cũng chứa pr khác, liên kết với ARN và các hạt ribonucleoprotein trong đó có các phân tử snRNUP3_ những phân tử hỗ trợ xúc tác hình thành kết nối 2 tiểu phần thành Rib. - 1 thành phần đặc biệt được đánh dấu là nucleomine_ 1pr gắn với ARN đã được nghiên cứu, phân tử này dường như chỉ bao lấy các phân tử ARN phiên mã. Những phân tử pr này được nhuộm màu cùng màu với pr của nhân con. - Trong quá trình thành thục, phân tử rARN 45S bỏ bớt 1 pr thừa và phân chia tiếp tục để hình thành 2 tiểu phần lớn và bé của Rib. Trong 30 phút đánh dấu nguyên tử phóng xạ, thành phần bé đầu tiên thành thục chứa ARN 18S ra ngoài nhân đi vào trong tế bào chất. - Sự tổ hợp tiểu phần lớn Rib chứa rARN 28S; 5,8S và 5S mất 1 giờ. Giai đoạn cuối của sự thành thục Rib chỉ diễn ra khi các tiểu phần qua lỗ màng nhân vào trong tế bào chất. . ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP SINH HỌC PHÂN TỬ Câu 1: Interferon (IFN) Interferon là một nhóm các protein tự nhiên được sản xuất. như chỉ bao lấy các phân tử ARN phiên mã. Những phân tử pr này được nhuộm màu cùng màu với pr của nhân con. - Trong quá trình thành thục, phân tử rARN 45S bỏ bớt 1 pr thừa và phân chia tiếp tục. các phân tử snRNUP3_ những phân tử hỗ trợ xúc tác hình thành kết nối 2 tiểu phần thành Rib. - 1 thành phần đặc biệt được đánh dấu là nucleomine_ 1pr gắn với ARN đã được nghiên cứu, phân tử này