BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS) CỦA BACILLUS CÁC DÒNG KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN NGỌC HÂN MSSV: 3112462 LỚP: CNSH K37 Cần Thơ, tháng 5/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC TUYỂN CHỌN VÀ TỐI ƯU HÓA KHẢ NĂNG ĐÔNG TỤ TRONG NƯỚC THẢI CHĂN NUÔI HEO (SAU BIOGAS) CỦA BACILLUS CÁC DÒNG KG.05, ST.02, VL.01, VL.05 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN Gs. Ts CAO NGỌC ĐIỆP TRẦN NGỌC HÂN MSSV: 3112462 LỚP: CNSH K37 Cần Thơ, tháng 5/2014 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) (ký tên) Cao Ngọc Điệp Trần Ngọc Hân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã tận tình giảng dạy tôi trong thời gian học tập vừa qua. Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp_người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành tốt luận văn. Xin cảm ơn Cô Nguyễn Thị Liên_cố vấn học tập, người đã luôn ủng hộ, giúp đỡ và động viên tôi khi vừa bước chân vào giảng đường đại học. Chân thành cám ơn anh Hồ Thanh Tâm, anh Trần Hoài Phong và chị Giang_cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh Môi trường, các anh chị cán bộ phòng thí nghiệm của Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ, tận tình chỉ dạy, dìu dắt và giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 37, các anh chị, các em trong Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ về kiến thức cũng như tinh thần để tôi hoàn thành luận văn. Cuối cùng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã khích lệ và luôn ủng hộ tôi để tôi vững tin hoàn thành tốt khóa học của mình. Kính chúc quý Thầy Cô luôn dồi dào sức khỏe để tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp trồng người. Xin chân thành cám ơn! Cần Thơ, ngày 05 tháng 5 năm 2014 Trần Ngọc Hân MỤC LỤC DANH SÁCH HÌNH i DANH SÁCH BẢNG i DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT iii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu của đề tài 1 CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3 2.1. Tính chất nước thải chăn nuôi heo 3 2.1.1. Nước thải chăn nuôi heo trước khi qua xử lý biogas 3 2.1.2. Nước thải chăn nuôi heo sau biogas 3 2.2. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus 4 2.3. Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải 6 2.3.1. Bùn hoạt tính 6 2.3.2. Màng sinh học 6 Hình 2. Hệ vi sinh vật trong màng sinh học 7 2.4. Sự đông tụ 8 2.4.1. Khái niệm 8 2.4.3. Cơ chế của sự đông tụ 10 Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào và các thành phần cấu tạo tham gia vào các liên kết giữa các tế bào vi khuẩn với nhau 10 Lipopolysaccharides (LPSs) là thành phần cấu trúc bề mặt quan trọng của vi khuẩn Gram âm, nằm giữa các protein và phospholipid chiếm gần 75% diện tích bề mặt ngoài tế bào vi khuẩn. Một LPS gồm có ba thành phần: lipid A, oligosaccharides và O-kháng nguyên. Thường cấu trúc O-Kháng nguyên không đồng nhất trong các LPSs giúp tế bào vi khuẩn có thể thích nghi trong các trường hợp môi trường có biến động. Cấu trúc của LPS bị biến đổi sẽ ảnh hưởng đến khả năng đông tụ của các dòng vi khuẩn thông qua làm thay đổi tính kỵ nước của bề mặt tế bào (Sutherland, 2001). Để làm rõ hơn vấn đề này, một nghiên cứu của Kimchhayarasy et al. (2009) được tiến hành. Ông gây đột biến dòng A. johnsonii S35 có bề mặt gồ ghề hiệu suất đông tụ 88% bằng cách cấy chuyển nhiều lần; kết quả kiểm tra hiệu suất đông tụ chỉ còn 20% gần như mất khả năng đông tụ, và đặc điểm bề mặt tế bào vi khuẩn được quan sát có sự thay đổi từ lồi lõm thành bề mặt tế bào tương đối nhẵn hơn 10 Sự kết dính của hai tế bào thông qua sự liên kết của một dạng protein loại lectin trên tế bào này với một oligosaccharide trên tế bào kia. Sự đông tụ ngừng lại nếu protein lectin bị biến tính do nhiệt độ hoặc các enzyme protease; hoặc sự xuất hiện của đường (lactose, galactose, hoặc các đường đơn khác), chúng liên kết với protein lectin khóa hoạt động của protein này (Kolenbrander and Anderson, 1989; Kinder and Holt, 1993; Shaniztki et al, 1997). Để làm rõ vai trò liên kết protein lectin-oligosaccharide, các tế bào vi khuẩn có khả năng đông tụ được xử lý với actinase E để phân hủy protein lectin, và xử lý với periodate để cắt cầu nối carbon trên oligosaccharide, kết quả đã làm ngăn cản quá trình đông tụ. (Malik et al., 2003). 11 2.4.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự đông tụ 11 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 13 3.2. Phương tiện nghiên cứu 13 3.2.1. Vật liệu 13 3.2.2. Dụng cụ và thiết bị 13 3.2.3. Hóa chất 13 3.3. Phương pháp nghiên cứu 14 3.3.1. Phương pháp nhân sinh khối vi khuẩn 14 3.3.2. Phương pháp tính hiệu suất đông tụ 14 3.4. Tiến hành thí nghiệm 14 3.4.1. Thí nghiệm 1: xác định cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất 14 Mục đích: chọn được cặp dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao nhất, xác định thời gian tối ưu nhất để sự đông tụ đạt được hiệu suất đông tụ cao 15 3.4.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ 16 Mục đích: xác định giá trị pH tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn ở thời điểm tối ưu đạt được cao nhất 16 3.4.3. Thí nghiêm 3: khảo sát ảnh hưởng của các cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+ đến hiệu suất đông tụ 17 3.4.4. Khảo sát tính tương quan của yếu tố pH và cation hiệu suất đông tụ 19 Mục đích: tìm điều kiện tối ưu nhất cho sự đông tụ của cặp dòng vi khuẩn được chọn, khi khảo sát mối tương quan của hai yếu tố pH và cation. 19 3.5. Phương pháp phân tích số liệu 19 4.1. Cặp dòng vi khuẩn và thời gian cho hiệu suất đông tụ cao nhất 20 Bốn dòng vi khuẩn KG.05, VL.05, VL.01, ST.02 được tổ hợp thành 6 cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.05, KG.05-VL.01, KG.05-ST.02, VL.01-VL.05, VL.05-ST.02, VL.01-ST.02 để kiểm tra thời gian đông tụ tốt nhất của các cặp dòng vi khuẩn. đồng thời dựa vào thí nghiệm này có thể chọn được cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn được ghi nhận tại năm móc thời gian 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ, 9 giờ, 12 giờ (bảng 4 ) 20 Bảng 4. Hiệu suất đông tụ ở những thời điểm khác nhau của các cặp dòng vi khuẩn. 21 Từ kết quả thống kê, có thể kết luận rằng các cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ khác biệt có ý nghĩa ở mức tin cậy 99%. Cụ thể là, trung bình hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 tại các thời điểm là 58.82% khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê và cao nhất so với các cặp dòng vi khuẩn còn lại 21 Hiệu suất đông tụ ở các móc thời gian khác biệt có ý nghĩa ở mức 1%. Trong đó, tại móc thời gian 6 giờ, trung bình hiệu suất đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn cao nhất là 75.27% và khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các móc thời gian còn lại 21 4.3. Ảnh hưởng của các cation 24 Cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, thời gian cho tổ hợp hai dòng vi khuẩn là 6 giờ, và pH=7 được chọn qua 2 thí nghiệm trên để tiến hành thực hiện kiểm tra ảnh hưởng của 4 loại : cation Ca2+, Mg2+, K+, Na+, mỗi loại khảo sát ở 6 nồng độ: 10mM, 20nM, 30mM, 40mM, 50mM, 60mM của các loại muối tương ứng: CaCl2, MgCl2, KCl, NaCl 24 Bảng 6. Ảnh hưởng của các cation ở các nồng độ khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 24 Từ kết quả phân tích có thể nhận định, các loại cation (loại muối) ảnh hưởng khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01 có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức tin cậy 99%. Trong đó, sự hiện diện của Mg2+ cho hiệu suất đông tụ cao nhất (53.47%) so với các loại cation còn lại và hiệu suất đông tụ thấp nhất là 44.69% dưới sự tác động của cation K+. 24 Nồng độ của các loại muối cũng có những tác động khác nhau đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01, sự khác biệt này có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong tất cả các trung bình của từng nồng độ tính trên cả 4 loại muối, nồng độ cho hiệu suất đông tụ cao nhất (65.32%) là 30mM, thấp nhất (36.48%) ở nồng độ 60mM. 25 Qua phân tích ANOVA có thể nhận định, các nồng loại muối khác nhau sẽ có một nồng độ tối ưu cho hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn KG.05-VL.01. Cụ thể là, 2 muối cation hóa trị II: CaCl2 và MgCl2 có hiệu suất đông tụ cao nhất, khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99%, (tương ứng là 57.07%; 62.95%) ở nồng độ 20mM so với các nồng độ muối còn lại; 2 muối có cation hóa trị I: KCl và NaCl có hiệu suất đông tụ cao nhất (tường ứng là 69.64%; 71.63%) khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nồng độ muối còn lại. Ở các nồng độ muối ban đầu thấp 10mM (và 20mM đối với cation hóa trị I) hiệu suất đông tụ chưa tối ưu nhất, cho đến khi tăng nồng độ muối đến giá trị phù hợp đối với từng muối. Và tiếp tục, nồng độ các muối được nâng lên 40mM, 50mM, 60mM hiệu suất đông tụ có những biến động theo chiều hướng giảm (hình), và thấp nhất là ở nồng độ muối 60mM. Nguyên nhân là do, sự thay đổi nồng độ hay điện tích ion trong môi trường sẽ làm thay đổi cấu trúc bề mặt tế bào dẫn đến sự đông tụ bị ảnh hưởng. Hơn nữa liên kết giữa các dòng vi khuẩn là nhờ liên kết lectin-olygosaccharide, protein lectin chiệu sự tác động của điện tích trong môi trường nên nồng độ muối cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn. 25 26 Kết quả này là phù hợp với nghiên cứu của Min et al., (2010) khi khảo sát các yếu tố hóa, lý ảnh hưởng đến sự đông tụ của 2 dòng vi khuẩn Sphingomonas natatoria 2.1gfp và Micrococcus luteus 2.13 trong bùn hoạt tính của nước thải sinh hoạt. Tế bào vi khuẩn được pha loãng trong các dung dịch có nồng độ khác nhau của các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 và NaCl, KCl, sự đông tụ bị hạn chế khi nồng độ muối NaCl, KCl (cation hóa trị 1) ở 90 mM, trong khi đó nồng độ các muối CaCl2, MgCl2, MgSO4 (cation hóa trị 2) chỉ cần 40 mM. 26 Muối cation hóa trị I: NaCl và KCl, cation cation hóa trị II: CaCl2, MgCl2 tương ứng có hiệu suất đông tụ cao nhất ở nồng độ 30mM, 20mM khác biệt có ý nghĩa với mức tin cậy 99% so với các nồng độ còn lại. Nhưng khi so sánh giữa chúng với nhau thì sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên, mỗi dòng vi khuẩn sẽ phù hợp với một loại ion ở nồng độ nhất định để hoạt động tối ưu nhất (Theo Lương Đức Phẩm, 2009), trong khi đó, môi trường nước thải chăn nuôi heo tồn tại rất nhiều các loại ion hóa trị I, II. Vì thế, thí nghiệm tiếp được thực hiện để tìm ra loại cation có nồng độ tối ưu được 26 26 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1.Vi khuẩn bacillus sau khi nhuộm Gram 4 Hình 2. Hệ vi sinh vật trong màng sinh học 6 Hình 3. Sự đông tụ giưa các dòng vi khuẩn 7 Hình 4. Hoạt động liên kết của protein Lectin trên bề mặt tế bào vi khuẩn đông tụ 9 DANH SÁCH BẢNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học i Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ Bảng 1. Thành phần và tính chất nước thải chăn nuôi heo 2 Bảng 2. Giá trị giới hạn các thông số chất lượng nước thải công nghiệp 3 Bảng 3. Thành phần môi trường Polypepton lỏng nhân sinh khối vi khuẩn đông tụ 8 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ii Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH TỪ VIẾT TẮT BOD Biochemical Oxygen Demand_Nhu cầu oxy hóa sinh học COD Chemical Oxygen Demand_Nhu cầu oxy hóa học LPS Lipopolysaccharides OD 660 OD 0 OD S QCVN Quy chuẩn Việt Nam TSS Total Suspended Solids_ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học iii [...]... đến, trong đó quần thể vi khuẩn có khả năng đông tụ (Aggregation) lại có tỉ lệ cao, chúng cũng tham gia vào quá trình lắng động, kết dính các vật chất có kích thước nhỏ, khó xử lý vì thế giữ vai trò quan trọng trong quá trình hình thành màng sinh học, bùn sinh học Đề tài Tuyển chọn và tối ưu hóa khả năng đông tụ trong nước thải chăn nuôi heo (sau biogas) của vi khuẩn Bacillus các dòng KG.05, ST.02, VL.01,. .. VL.01, VL.05 được thực hiện để xác định các điều kiện tối ưu cho sự đông tụ của dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất, tạo tiền đề cho những nghiên cứu kế tiếp để xử lý nước thải chăn nuôi heo một cách có hiệu quả 1.2 Mục tiêu của đề tài Chọn cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất từ Bacillus các dòng KG.05, VL.01, VL.05, ST.02 được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau biogas, và xác... học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ Mục đích: chọn được cặp dòng vi khuẩn có khả năng đông tụ cao nhất, xác định thời gian tối ưu nhất để sự đông tụ đạt được hiệu suất đông tụ cao Từ các dòng vi khuẩn: KG.05, ST.02 , VL.01, VL.05 có khả năng tự đông tụ cao đã được xác định qua các thí nghiệm của Hồ Thanh Tâm và Cao Ngọc Điệp (2013), chúng được tổ hợp theo từng cặp để kiểm tra khả năng đông tụ theo... OD660 + Từ các số đo OD660 tính hiệu suất đông tụ theo công thức (*)  Chọn cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất và thời gian tối ưu cho sự đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn đó 3.4.2 Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của pH đến hiệu suất đông tụ Mục đích: xác định giá trị pH tối ưu nhất để hiệu suất đông tụ của cặp dòng vi khuẩn ở thời điểm tối ưu đạt được cao nhất Qua thí nghiệm 1, cặp dòng vi... tương quan của hai yếu tố pH và cation Từ các thí nghiệm trên, cặp dòng vi khuẩn có hiệu suất đông tụ cao nhất; giá trị pH tối ưu nhất và 2 giá trị gần tối ưu cho sự đông tụ được chọn; trong cặp cation cho hiệu suất đông tụ cao nhất, đối với mỗi loại cation chọn nồng độ tối ưu nhất và 2 nồng độ gần tối, để tiến hành thí nghiệm khảo sát tính tương quan của các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất đông tụ Bố trí... Vi khuẩn đông tụ trong các hệ thống xử lý nước thải bùn hoạt tính và 6 6 màng sinh học 50 50 0 0 Trong thí nghiệm của Malik (2003) có 52 dòng vi khuẩn được phân lậplầ bùn hoạt từ lầ n n tính trong đó các dòng vi khuẩn có khả năng kết tụ chiếm 31%, 11% là các dòng vi khuẩn Blastomonas natatoria Kimchhayarasy et al (2009) đ bị lắng tụ còn lại 58% là các dòng vi khuẩn không có khả năng kết tụ Trong nhiều... tăng trưởng Môi trường sống chủ yếu của Bacillus là đất, nước và bùn (Green et al., 1999) 2.3 Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải Phương pháp sinh học trong xử lý nước thải là phương pháp sử dụng khả năng sống và hoạt động của vi sinh vật để khoáng hóa các chất hữu cơ có trong nước thải thành các chất vô cơ, các chất khí đơn giản và nước Các vi sinh vật tồn tại trong môi trường thực hiện quá trình... mất đi trong trong quá trình phát triển Rickard et al (2000) theo dõi sự đông tụ của các cặp dòng vi khuẩn tổ hợp từ các dòng B natatoria 2.1; B natatoria 2,6; B natatoria2,3; M luteus 2.13 Kết quả là thời gian đầu, sự đông tụ của các cặp vi khuẩn không đáng kể hoặc không diễn ra, đến một thời điểm hiệu suất đông tụ tăng đến một giá trị tối đa, tùy thuộc vào từng cặp dòng vi khuẩn, sự đông tụ của các. .. này được tiếp diễn và tạo thành màng sinh học đa chủng vi sinh vật Min và Rickard (2009) đã chứng minh rằng sự đông tụ tăng cường độ bám dính giữa các màng sinh học nước ngọt phù du, vi khuẩn và nó có khả năng đóng góp vào sự phát triển của màng sinh học trong môi trường tĩnh hay chảy 2.4.3 Cơ chế của sự đông tụ Quá trình đông tụ chủ yếu phụ thuộc vào tính kỵ nước của bề mặt tế bào và các thành phần cấu... cặp muối, 2 dòng vi khuẩn được tổ hợp thành 1 cặp và chứa trong bình tam giác 150 ml, mỗi dòng vi khuẩn sử dụng 20 ml - Các chỉ số OD được kiểm tra tương tự như các thí nghiệm trên  Cặp muối cho hiệu suất đông tụ cao nhất được chọn 3.4.4 Khảo sát tính tương quan của yếu tố pH và cation hiệu suất đông tụ Mục đích: tìm điều kiện tối ưu nhất cho sự đông tụ của cặp dòng vi khuẩn được chọn, khi khảo sát mối . trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn các bạn lớp Công nghệ Sinh học khóa 37, các anh chị, các em trong Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ về kiến thức cũng như tinh thần. nghệ Sinh học 1 Luận văn tốt nghiêp Đại học Khóa 37_2014 Trường Đại học Cần Thơ 1.3. Nội dung nghiên cứu Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học 2 Luận văn tốt nghiêp Đại. động vật… (Nguyễn Văn Phước, 2009). Trong quá trình hình thành bùn hoạt tính các vi sinh vật có trong bùn sử dụng các chất dinh dưỡng, chất hữu cơ có trong nước thải làm nguồn thức ăn để tổng