QUY TRÌNH TẠO DÒNG GEN SERINE PROTEASE THỦY PHÂN FIBRIN Ở ESCHERICHIA COLI SỬ DỤNG BỘ KIT TA CLONING I. GIỚI THIỆU 1. Fibrin Fibrin đóng cục là một trong những nguyên nhân của bệnh tim mạch, gây tắc nghẽn mạch máu cản trở lưu thông máu. Hiện nay một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản đã chiết xuất và tinh sạch được lumbrokinase từ một số loài giun có khả năng thủy phân được fibrin, làm tan các cục máu đông. Có thể sinh tổng hợp enzyme này bằng phương thức tái tổ hợp: tạo dòng đoạn gen mã hóa cho enzyme lumbrokinase (852 bp AF304199.1) ở E. coli. 2. Enzyme lumbrokinase của giun đỏ (Lumbricus rubellus) Enzyme lumbrokinase của giun đỏ Lumbricus rubellus (red earthworm - loài giun đất có màu huyết dụ) là một enzyme thủy phân fibrin. Đoạn DNA mã hóa gen lumbrokinase được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào trình tự gen mã hóa lumbrokinase trên GenBank với mã số AF304199 có kích thước 852 bp được tạo dòng với vector pGEM-T. Một số nhà nghiên cứu Việt Nam đã khai thác lumbrokinase và sử dụng enzyme này từ nguồn nguyên liệu tự nhiên để làm cơ sở cho việc nghiên cứu biểu hiện cũng như sản xuất lumbrokinase. Chúng tôi tiến hành tạo dòng gen mã hóa lumbrokinase từ giun đỏ (Lumbricus rubellus). 3. Vi khuẩn Escherichia coli (E. coli) Vi khuẩn E. coli là vi khuẩn Gram (-), hình que, dài khoảng 2-3 mcg, đường kính 0.5mcg. E. coli hiếu khí, kị khí tùy tiện thường gặp trong đường ruột, phát triển dễ dàng trong các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ tối ưu là 37 0 C. E. coli có 1 NST nằm trong thể nhân, là một chuỗi ADN trần với khoảng 4.10 6 cặp base. E. coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực tạo dòng gene cũng như trong các lĩnh vực ứng dụng khác do có nhiều ưu điểm: - Dễ nuôi, môi trường nuôi cấy, thiết bị, dụng cụ đơn giản, rẻ tiền làm hạ giá thành sản phẩm. - E. coli có tốc độ sinh trưởng và phát triển nhanh. Cấu trúc bộ gene của E. coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên cứu khá đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu và sản xuất khi sử dụng E. coli. 1 - Dòng tể bào E. coli được sử dụng trong sản xuất tương đối an toàn, không có hoạt tính gây bệnh, ít gây hại ở người và động vật. - Trong ứng dụng, dòng E. coli đã được xử lý nên dễ dàng tiếp nhận plasmid tái tổ hợp, nâng cao hiệu suất quá trình nhân lên đoạn gene tái tổ hợp.  Tế bào khả nạp E. coli DH5α: Tế bào cho tần số biến nạp khá cao, giảm nhiễm tạp và có thể cho kết quả dương tính giả - plasmid không chứa DNA. II. QUY TRÌNH TẠO DÒNG GEN SERINE PROTEASE TỪ DNA GIUN ĐỎ 1. Quy trình chung Thu lượng lớn bản sao đoạn DNA Lumbricus rubellus mã hóa cho enzyme lumbrokinase (serine protease gen). Bước 1: Chuẩn bị DNA serine protease gen: - Tách chiết DNA tổng số từ giun đỏ. - Bổ sung enzyme giới hạn cắt DNA tổng số thành các đoạn nhỏ nhưng không cắt trong đoạn serine protease gen. Bước 2 : Tiến hành PCR và chèn vào vector của bộ kit. - Thu sản phẩm đưa vào kit tinh sạch và bất hoạt enzyme. - Điện di, cắt band điện di. Chiều dài gen mã hóa cho enzyme lumbrokinase trên giun đỏ là 852 bp. - DNA sau phản ứng PCR có chứa vị trí cắt của enzyme giới hạn. Dùng enzyme giới hạn cắt tạo đầu bằng. - Sau khi cắt band từ gel điện di, DNA được gắn thêm Adenin vào đầu 3’. - Bổ sung T4 DNA ligase vào hỗn hợp để chèn DNA vào vector pGEM-T, là plasmid vector mạch thẳng đầu 3’ gắn sẵn Thymine. Bước 3: Sau khi nối DNA, vector chứa DNA sẽ được biến nạp vào tế bào E. coli và tiến hành trải khuẩn lạc, quan sát chọn lọc khuẩn lạc xanh/trắng bởi gen LacZ trên vector. Bước 4: Chọn khuẩn lạc trắng để tách chiết DNA và điện di, kiểm tra kết quả tạo dòng serine protease gen. Bước 5: Kiểm tra các tế bào đã chọn bằng cách dùng enzyme cắt giới hạn, phân tích trình tự. 2 Test Kết Quả Biến Nạp Tách Chiết DNA Tổng Số PCR Khuếch Đại DNA Insert DNA  Vector Biến Nạp DNA  E.coli NZY5α Cell Figure 1: Quy trình chuẩn bị DNA và vector cho biến nạp sử dụng T-Vector 2. Quy trình tạo dòng serine protease gen từ DNA Lumbricus rubellus a. Tách chiết thu DNA đưa vào vector  Loại bỏ protein với phenol chloroform: - Giun sau khi rửa sạch, được ngâm trong nước cất 5 - 6 lần, mỗi lần 2 giờ để thải hết chất bẩn. Một gam L. rubelluswas nghiền và khoảng 20 giây trong 10 ml đệm guanidinium thiocyanate (GITC) làm biến tính protein. - Thêm vào 0,5 ml 10% sarkosyl (sarkosyl được sử dụng để ngăn chặn sự khởi đầu phiên mã DNA, Sigma, St Louis, Mỹ). Hỗn hợp được trộn tiếp với 1,0 ml natri acetate 3M (pH 7.0), 10ml dung dịch phenol và 2 ml chloroform / isoamyl alcohol (v/v là 24/1) và sau đó ly tâm trong 20 phút ở 4 o C và 10.000 ×g. Cặn sau ly tâm chứa protein sẽ bị loại bỏ. - Bổ sung thêm RNase, protease loại bỏ các RNA và protein còn sót.  Kết tủa và tách chiết DNA với isopropanol và ethanol: 3 - Thu dịch nổi chuyển sang lọ khác, thêm vào 10 ml isopropanol, và dung dịch được ủ trong 1 giờ để tạo kết tủa. Sau đó ly tâm trong 20 phút ở 4 o C và 10.000×g, loại bỏ dịch nổi thu kết tủa rồi thêm 1 ml ethanol 70% bảo hòa ly tâm trong 20 phút ở 4 o C và 10.000 ×g và sấy khô. - Hòa cặn DNA trong 20ul dung dịch TE, giữ ở nhiệt độ -20 o C. - Cho vào dịch DNA tổng số 5 loại RE (BdiI, BfiI, AsuII, BfrI và BamHI), ủ riêng biệt từng loại nối tiếp nhau, mỗi loại ủ trong 30 phút ở 4 o C để phân cắt DNA thành các đoạn ngắn. Sau khi ủ xong bất hoạt enzyme. Sản phẩm sau phân cắt dùng làm nguyên liệu cho PCR. b. Khuếch đại đoạn DNA serine protease gen • Vector pGEM-T (Promega): - Bộ Kit TA được đặt mua từ hãng Promega, bao gồm vector pGEM-T (#A3600). - Vector pGEM-T 3.000 bp, mang gen Amp r , gen lacZα. Kích DNA chèn tối đa là 1287bp. - Vector được mở vòng sẵn mang 2 đầu T ở vùng MCS, đặc trưng cho việc gắn DNA mang 2 đầu A, rất thuận tiện và thời gian ligation ngắn. Figure 2 : pGEM-T vector (Promega) • Nhân đoạn DNA serine protease gen bằng phản ứng PCR - Chu trình nhiệt phản ứng: 95˚C/5’; 40× (95˚C/30”, 55˚C/1’, 72˚C/1’); 72˚C/10’; 4˚C/∞. - Sử dung enzyme cắt giới hạn SmaI và AluI cắt giới hạn tạo đầu bằng đặc hiệu. - Gắn nucleotide A vào đầu 3’ của DNA đích: DNA được ủ với Taq và ATP trong 30 phút để gắn thêm Adenin vào đầu 3’. bổ sung  Kết quả thiết kế mồi từ phần mềm Primer3 (http://primer3.ut.ee/): OLIGO start len tm gc% any_th 3'_th hairpin seq L_PRIMER 1 20 58.26 50.00 0.00 0.00 0.00  ATGTTACTTCTCGCCCTTGC 4 R_PRIMER 820 20 58.21 61.11 0.47 0.00 0.00  CAGTTTGGGATCCGACGC PRODUCT SIZE: 820, pair any_th compl: 0.00, pair 3'_th compl: 0.00 - Đầu 5’ của mồi được gắn thêm linker để tạo vị trí cắt giới hạn cho enzyme SmaI và AluI: Vị trí cắt của SmaI 5’….CCC ↓ GGG…3’ 3’…GGG ↓ CCC…5’ LEFT PRIMER: 5’- CCCGGG - ATGTTACTTCTCGCCCTTGC -3’ Vị trí cắt của AluI 5’…AG ↓ CT….3’ 3’…TC ↓ GA…5’ RIGHT PRIMER: 5’-TCGA- CAGTTTGGGATCCGACGC-3’ - Như vậy đoạn DNA sau PCR có chứa vị trí cắt giới hạn của SmaI và AluI, có chiều dài 830, bao gồm cả 10 base là 2 vị trí này trên DNA khuếch đại. • Trình tự đoạn gen mã hóa lumbrokinase protein (lk-6) và vị trí mồi PCR: >Gi|23345190|gb|AF304199.1|Lumbricus rubellus lumbrokinase protein (lk-6) gene, complete cds 1 ATGTTACTTCTCGCCCTTGCATCGTTGGTAGCGGTGGGTTTTGCGCAACCACCAGTCTGG >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> 61 TACCCCGGTGGTCAATGCAGTGTCAGCCAGTACTCAGATGCTGGTGACATGGAACTTCCT 121 CCCGGAACAAAAATTGTCGGAGGAATTGAAGCCAGACCATACGAGTTCCCATGGCAGGTG 181 TCCGTCCGAAGGAAGTCTTCCGATTCCCATTTCTGCGGAGGTAGCATCATCAACGATCGT 241 TGGGTTGTCTGCGCTGCTCACTGCATGCAGGGAGAGAGCCCTGCCCTGGTTTCATTGGTC 301 GTCGGTGAGCACGATAGCAGCGCTGCGAGTACAGTACGTCAGACTCATGACGTTGACAGC 361 ATCTTCGTCCACGAGGACTACAACGGAAATACCTTTGAGAACGACGTTTCTGTCATCAAG 421 ACAGTTAACGCCATCGCCATCGACATCAACGATGGGCCAATCTGCGCTCCAGATCCAGCC 481 AACGATTACGTCTACCGTAAGAGCCAGTGCTCCGGATGGGGAACTATCAACTCAGGTGGA 541 GTCTGCTGCCCCAACGTTCTGCGATATGTGACACTGAACGTCACAACCAACGCCTTCTGC 601 GATGATATCTACAGCCCATTATATACAATTACCAGCGACATGATCTGCGCCACGGACAAC 661 ACCGGACAGAACGAGAGAGACTCTTGCCAGGGTGACTCTGGCGGCCCTCTGAGCGTCAAG 721 GATGGCAACGGAATCTTCAGCCTCATTGGTATTGTGTCTTGGGGAATCGGTTGCGCATCT 5 781 GGCTATCCAGGAGTCTACGCCCGCGTCGGATCCCAAACTGGATGGATCACAGACATTATT <<<<<<<<<<<<<<<<<< 841 ACCAACAACTAG KEYS (in order of precedence): >>>>>> LEFT PRIMER <<<<<< RIGHT PRIMER c. Ligation: chuyển DNA serine protease gen vào vector pGEM-T - Tỷ lệ mol tối ưu cho phản ứng nối: DNA / vector là 3:1. Vector pGEM-T (50 ng) là 3 kb (1 ul). Cần 50 ng đoạn 1kb và 25 ng cho đoạn 500bp để có tỷ lệ 3:1. - Phản ứng nối thực hiện ở 20 o C trong 15 phút. Bảng: Hóa chất cho phản ứng nối (sample ligation reactions) Reagent High concentration PCR Low concentration PCR pGEM-T (50 ng) 1 ul 1 ul PCR product 2 ul (= 100 ng) 8 ul (= 100 ng) ligation buffer 5 ul (2X) 1.2 ul (10 X) T4 DNA ligase 1 ul 1 ul H2O 1 ul 0.8 ul Total 10 ul 12 l d. Biến nạp vector tái tổ hợp mang sản phẩm PCR vào tế bào khả biến E. coli - Hỗn hợp phản ứng gắn của các sản phẩm PCR và vector pGEM-T (Promega) được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt ở 42 o C trong 45 giây và làm lạnh nhanh trong đá 3 phút. - Sau đó tế bào khả biến được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường chọn lọc LB + 1,5% agar + Km (50 g/ml) + 1 M IPTG + X-gal (20 g/ml) ở 37 o C qua đêm. - Chọn khuẩn lạc đơn màu trắng để nuôi cấy lắc trên môi trường LB lỏng + Km (50 g/ml) ở 37 o C, 220 vòng/phút trong khoảng 15 giờ, thu sinh khối tế bào để tách chiết DNA plasmid tái tổ hợp. e. Kiểm tra khả năng tạo biến nạp Để khẳng định tổ hợp được tách ra có phải là plasmid tái tổ hợp mang gen, plasmid tái tổ hợp thu được được cắt bằng enzyme giới hạn BfaI rồi đem điện di. - Enzyme BfaI cắt plasmid ở hai vị trí một trên DNA ngoại lai và một trên vector tạo hai đoạn có độ dài rất chênh lệch là 857bp và 290bp. 6 - Để có thể kết luận đoạn gen đã tách từ giun đỏ là gen mã hóa lumbrokinase thì cần có kết quả giải trình tự nucleotide bằng các phương pháp như Sanger. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Mihara H, Sumi H, Yoneta T, Mizumoto H, Ikeda R, Seiki M and Maruyama M, A novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus, Japanese Journal of Physiology 41, (1991), 461-472. [2].Promega's pGEM-T kit (#A3600) (protocol từ hãng Promega) TA cloning protocol, xem tại: http://hcgs.unh.edu/protocol/basic/Cltaclone.html [3]. Võ Thị Hạnh, Lê Thị Bích Phượng, Trần Thanh Phong, Lê Thị Hương, Trương Thị Hồng Vân, Huỳnh thị Kim Hối, Sử dụng trùn quế Perionyx excavatus để sản xuất chếphẩm sinh học dùng trong nông nghiệp, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Hà nội, 15-17/10/2008, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2008), 174-176. [4]. Sugimoto M and Nakajima, Molecular cloning, sequencing, and expression of cDNA encoding serine protease with fibrinolytic activity from earthworm, Biosci. Biotechnol. Biochem., 65 (7), (2001), 1575-1580. [5]. Cho IH, Choi ES, Lim GH, Lee HH, Purification and charaterization of six fibrinolytic serine-protease from earthworm Lumbricus rubellus, J. Biochem Mol Biol, 37 (2), (2004a), 199-205. [6]. Lại Thị Bích Thủy, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Tách chiết enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin từ một số loài giun quế Perionyx excavatus, Nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống định hướng Y dược học, Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học toàn quốc, Hà nội, 2004, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2004), 173-176. [7]. Nguyễn Đức Bách, Luyện Quốc Hải, Ngô Thị Hoài Thu, Lê Quang Huấn, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Đặng Diễm Hồng, Nguyễn Văn Đồng , Tách dòng gen mã hoá cho enzyme lumbrokinase từ loài Giun quế của Việt Nam (Perionyx excavatus), Báo cáo khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, (2003), 590-593. [8]. Lại Thị Bích Thủy, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Thị Ngọc Dao, Hoạt tính thủy phân fibrin của enzyme tách từ một số loài giun đất Việt Nam, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ hai trong nghiên cứu cơ bản trong Sinh học, Nông nghiệp, Y học, Huế, 25-27/7/2003, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2003), 531-533. [9]. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phan Thị Ánh Hồng, Chiết tách và tinh sạch enzyme thủy phân fibrin từ trùn quế Perionyx excavatus, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử 7 phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Hà nội 15-17/10/2008, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2008a), 661-665. [10]. Phan Thị Bích Trâm, Dương Thị Hương Giang, Hà Thanh Toàn, Phan Thị Ánh Hồng, Khảo sát đặc điểm các serine-protease từ trùn quế Perionyx excavatus, Hội nghị Khoa học toàn quốc lần thứ IV Hóa sinh và Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghiệp thực phẩm, Hà Nội 15-17/10/2008, Nxb. Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, (2008b), 123-127. [11]. Wang F, Wang C, Li M, Gui L, Zhang J and Chang W, Purification, charaterization and crystallization, 2003. [12]. Cho IH, Choi ES, Lim GH, Lee HH, Molecular cloning, sequencing, and expression of a fibrinolytic serine-protease gene from the earthworm Lumbricus rubellus, J.Biochem Mol Biol, 37 (5), (2004b), 574-581. [13]. Ge T, Sun ZJ, Fu SH and Liang GD, Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris, Protein Expression and Purification 42, (2005), 20-28. [14]. Liu J, Wang X, Xu L, Zhang J, Liang D, Chang W, cDNA cloning and expression of earthworm fibrinolytic enzyme component A, Chinese Science Bulletin, Vol.48 No.1, (2003), 68-71. [15]. Sambrook and Russell, Molecular Cloning a laboratory manual, CSHL Press, Vol 1, 2, 3, 2001. 8 . QUY TRÌNH TẠO DÒNG GEN SERINE PROTEASE THỦY PHÂN FIBRIN Ở ESCHERICHIA COLI SỬ DỤNG BỘ KIT TA CLONING I. GIỚI THIỆU 1. Fibrin Fibrin đóng cục là một trong những. Insert DNA  Vector Biến Nạp DNA  E .coli NZY5α Cell Figure 1: Quy trình chuẩn bị DNA và vector cho biến nạp sử dụng T-Vector 2. Quy trình tạo dòng serine protease gen từ DNA Lumbricus rubellus a TRÌNH TẠO DÒNG GEN SERINE PROTEASE TỪ DNA GIUN ĐỎ 1. Quy trình chung Thu lượng lớn bản sao đoạn DNA Lumbricus rubellus mã hóa cho enzyme lumbrokinase (serine protease gen) . Bước 1: Chuẩn bị DNA serine