Bài thuyết trình Môn: Kỹ thuật gen Khoa Công nghệ Sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội GVHD: TS.Nguyễn Huy Hoàng Nguyễn Anh Tiến Nhóm 9 Lớp 10.01 Trần Thủy Tiên Trịnh Công Sơn Nguyễn Thị Lương Trần Thị Hạnh Nguyễn Hà Nhung Trần Thị Hằng Đề tài Ảnh hưởng đối kháng và ức chế của B.subtilis đối với nấm gây bệnh trên thực vật B. C U T O VI KHU N Ấ Ạ Ẩ A. Khái quát vi khu n B.subtilisẩ C. TÍNH Đ IKHÁNG C A CHÚNGỐ Ủ D. NGUYÊN Li U VÀ PH NG PHÁPỆ ƯƠ E. K T QuẾ Ả F. TH O LU NẢ Ậ Mục lục A/ Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis  Lịch sử : • 1872 Bacillus subtilis được Ferdinand Cohn- một cộng sự của Robert Koch mô tả và đặt tên • 1949 – 1957: Henrry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis. • 1959 : Công trình nghiên cứu của Work cho thấy B. subtilis có hệ thống men tương đối hoàn chỉnh có khả năng thủy phân glucid, lipid, protid  Phân bố: + Phần lớn chúng tồn tại trong đất, thảm mùn thực vật. Thông thường đất trồng trọt chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. + Tồn tại trong dạ dày, ruột, do chúng chịu được pH thấp.  Phân loại: B. subtilis thuộc : Ngành (phylum): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (order) Eubacteriales Họ family) Bacillaceae Giống (genus): Bacillus Loài Bacillus subtilis B/ Đặc điểm của B.subtilis 1.Vi khuẩn gram (+), không sinh bệnh 2. Hình que và là vi khuẩn sinh nội bào tử hiếu khí. VK có khả năng di động 3. Kích thước 0,5 - 0,8 µm x 1,5 - 3 µm 4. pH = 7,0 - 7,4. Nhiệt độ tối ưu 37 o C H. Vk bắt màu Gram+ (tím) H. VK B.subtilis và bào tử 01 02 03 Là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất về hình thái khuẩn lạc của VK Gram (+) Trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc phát triển theo dạng tròn, hoặc vết nhăn màu nâu rìa răng cưa không đều, có tâm sẫm màu, màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm Sau 1 - 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu. Khuẩn lạc B.subtilis trên điã thạch Kl sau 48h Kl sau 96h  Loại vi khuẩn này kháng lại các nấm sinh bệnh bằng cách Cạnh tranh với mầm gây bệnh (nơi ở, dinh dưỡng) Thay đổi chuyển hóa, tiết ra enzyme thủy phân ngoại bào Kích thích miễn dịch của cơ thể vật chủ. Trung hòa độc tố nấm.  Đặc điểm kháng sinh : B.subtilis sản sinh kháng sinh có bản chất lipopeptide. Khối lượng phân tử nhỏ hơn 2000 Dalton. Tổng hợp không ribosome.( non-ribosome) Kháng sinh Tính chất Tác động Surfactin, nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid - Kết hợp với iturin thì trở thành hợp chất diệt nấm. - Làm thủng vách tế bào của các tác nhân gây bệnh và bào tử của chúng. ITURIN - Bản chất là lipopeptit dk chiết từ môi trường nuôi cấy B.subtillis - Tác động lên màng tb chất, làm tan màng và tạo những lỗ thủng trên đó để làm mất tính thẩm thấu chọn lọc của màng. AGASTATiN Bản chất lipopeptide - Có khả năng diệt nấm như surfactin và iturin Subtilin - Chịu nhiệt rất cao, không mất hoạt tính khi hấp autoclave ở pH 2 -cách gắn với màng nguyên sinh chất làm ảnh hưởng đến hệ thống vận chuyển các chất có trọng lượng phân tử nhỏ và hệ thống trao đổi proton. Sublancin - bacteriocin rất bền, - Đối kháng mạnh với vi khuẩn gram dương kể cả tế bào sinh dưỡng lẫn bào tử C/ Kháng sinh do B.subtilis tổng hợp tác động của các chủng B.subtilis • B.subtilis RB14 kháng nấm Rihzotomia, là tác nhân gây úng thối trên cây cà chua con. Phần trăm cây bị bệnh khi thiếu B.subtilis RB14 là 85.2%. Khi có RB14 tỉ lệ cây bệnh giảm lần lượt 16.7%, 27.8%, 11.1%. • Trên canh trường NB và TSB, B.subtilis cho thấy ảnh hưởng kháng lại nhất với Peronophythora litchi. • B.subtilis YM 10-20 ngăn ngừa sự nảy mầm của bào tử Penicillin roqueforti. Hiệu suất nảy mầm của Penicillin roqueforti sau 8h ủ không có mặt B.subtilis YM10-20 là 84%. Ở các tỷ lệ dịch 10, 25, 50% YM10-20, làm giảm tỷ lệ lần lượt từ 7%, 1% và 0%. • B.subtilis 6051 bảo vệ rễ cây Arabidopsis khỏi sự nhiễm vi khuẩn Pseudomonas syringae tomato DC 3000 trong điều kiện ống nghiệm và trong đất màu. • Đáng chú ý hơn cả là Bacillus spp.3 và B.subtilis CEI sản sinh ra dịch ngoại bào có hoạt tính kháng nấm cao nhất, lần lượt là 78 và 60%. B.subtilis CEI cho thấy khả năng ngăn cản sự phát trển của F.verticillioides và sản phẩm fumonisin trong điều kiện in vitro. • Bacillus dòng PY-1 đc phát hiện tính chất hóa sinh, t/c vật lý nhờ phân tích trình tự 16S rDNA biểu hiện khả năng kháng nhiều loại nấm bệnh thông thường trong đk invitro. [...]... effect (ảnh hưởng đối kháng)  Chủng B1 có ảnh hưởng lớn tới R.solani trên dâu tây (R2), khoai tây(R3) và Helminthosporum , nhưng ít tác động đến F.oxysporum  Chủng B8, B7,B11 có tác dụng đối kháng không mấy khác biệt, và là các chủng ảnh hưởng nhiều nhất, tiếp theo là B1 và B4 trong ức chế nấm F.oxysporum phát triển • Khi nuôi trong bình lắc có chứa một môi trường với chủng thuần khiết của mỗi B... không quá khác biệt và chúng đều là các chủng hiệu lực nhất sau đó đến B1,B3,B8,B13 trong ảnh hưởng ức chế Alternaria spp trên cây cà chua +Chủng B.subtilis B7 có hiệu quả làm giảm tỷ lệ và nguy cơ mắc các bệnh nghiêm trọng khi nhiễm nấm Fusarium và R.solani, và kích thích sự phát triển của cây cà chua +Khối lượng tươi của thân và lá của cây cà chua ở lô thí nghiệm cao hơn so với đối chứng Chiều cao... quanh rễ cây và sản xuất iturin Sự tích hợp của RB14-C và flutolanil giảm số lượng của flutolanil, với cùng hiệu quả làm giảm sự xuất hiện bệnh Ngiên cứu chế phẩm sinh học từ vi khuẩn có tác dụng diệt nấm • Tế bào của các chủng vi khuẩn đối kháng Burkholderia, Pseudomonas và Bacillus tác dụng tích cực đến sinh trưởng của rau diếp và cà chua Ko ảnh hưởng tốc độ nảy mầm và sự phát triển của rễ, lá (... lá/cây ở lô xử lí với dịch ngoại bào cao hơn so với đối chứng Fig 4 Cà chua nhiễm Fusarium Fig 5 Cà chua nhiễm R.solani Thảo luận Các nghiên cứu về B.subtilis đem đến nhiều ý tưởng và ứng dụng vk này trong đời sống  Sử dụng chế phẩm có nguồn gốc từ vi khuẩn đối kháng để diệt nấm gây hại trên cây trồng VD1996, Asaka và Shoda cho rằng B.subtilis RB14 có tác dụngức chế chống lại sự chết rạp cây cà chua... rằng B.subtilis B2 có thể ngăn chặn các tác nhân gây bệnh truyền qua rễ của thực vật B B2 subtilis có thể được sử dụng để sản xuất một loại thực phẩm có nguồn gốc từ DNJ như là một thực phẩm chức năng cho bệnh nhân tiểu đường Các nghiên cứu ứng dụng liên quan vi khuẩn B.subtilis  B.subtilis B2: - Ức chế mạnh mẽ tới α-glucosidase Bản chất kháng sinh 1-deoxynojirimycin (DNJ) là một đường imino với trọng... có hiệu lực đối kháng trên R.solani tách từ dâu tây(R2) B8, B7, B10, B14, B11, B4, B13 và B1 ức chế theo thứ tự giảm dần sự phát triển của nấm R.solanni thu được từ khoai tây(R3) - Dịch thu được từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều ảnh hưởng ức chế hơn trên Helminthosporium spp so với B1, B5, B8, B13 - Dịch thu được từ B7, B14, B10, B4, B3 cho nhiều hiệu quả hơn trên Helminthosporium spp so với B1, B5,... nhà lưới) • Trong điều kiện in vitro trên môi trường thạch, dịch ngoại bào của chủng vi khuẩn đối kháng này diệt 70-90% nấm F oxysporum, và diệt 75-81% nấm R solani A R.solani hại rau diếp B Rau diếp nhiễm nấm R solani được xử với dịch ngoại bòa chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc C Rau diếp nhiễm nấm R.solani được xử với tế bào chủng vi khuẩn đối kháng chọn lọc Tài liệu tham khảo: • Asian Network for... màng, than hoạt tính, sắc ký CM-Sepharose, và chuẩn bị sắc ký lớp mỏng (TLC), khối phổ (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) B.Subtilis RB14 RB14 Bacillus subtilis, cho thấy hoạt động kháng sinh chống lại các phytopathogens bằng cách sản xuất các kháng sinh iturin A và surfactin Iturin A, một lipopeptide,có đặc tính kháng nấm mạnh mẽ và độc tính với động vật có vú thấp • • • Bacillus subtilis RB14-C... được đổ 200µl dịch ngoại bào Các nấm được thí nghiệm đều được đặt tại vị trí trung tâm ở mỗi đĩa Các đĩa được nuôi trong vòng 3-7 ngày ở 30°C Đo vùng ức chế - Lấy kết quả : đo mật độ quang học ở 550nm, thu số lượng, khối lượng các chất kháng nấm Phân tích số liệu dựa hệ thống SAS 2/ Antagonistic effect of B.subtilis isolate B7 (in vivo) Nấm chuẩn bị là F.oxysporum và R.solani Bình nuôi để không rung... trong dung dịch muối (0,85%NaCl, pH 7), sau đó được đem ly tâm lần nữa ở cùng điều kiện Thực hiện đo khối lượng tươi và khối lượng khô của các mầm và rễ cây ở cùng thời gian Dữ liệu thu được đem phân tích theo hệ thống SAS 3/ Phương pháp phân tích HPLC (Phân tách các hợp chất kháng nấm từ B.subtilis) • Khuẩn lạc của B.subtilis được nuôi ở mỗi môi trường dinh dưỡng, để qua đêm • Nhiệt độ 30oC Lắc 200rpm . Nhung Trần Thị Hằng Đề tài Ảnh hưởng đối kháng và ức chế của B. subtilis đối với nấm gây b nh trên thực vật B. C U T O VI KHU N Ấ Ạ Ẩ A. Khái quát vi khu n B. subtilis C. TÍNH Đ IKHÁNG C A CHÚNGỐ. effect - Chủng B8 , B1 0, B1 4, B7 , B4 , B1 , B1 1 và B1 3 có hiệu lực đối kháng trên R.solani tách từ dâu tây(R2). B8 , B7 , B1 0, B1 4, B1 1, B4 , B1 3 và B1 ức chế theo thứ tự giảm dần sự phát triển của nấm R.solanni. so với B1 , B5 , B8 , B1 3. - Dịch ngoại b o các chủng B7 , B1 0, B4 , B1 4 không quá khác biệt và chúng đều là các chủng hiệu lực nhất sau đó đến B1 ,B3 ,B8 ,B1 3 trong ảnh hưởng ức chế Alternaria spp trên