BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  DIỆP THỊ TỨ QUYỀN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN Ở TỈNH KHÁNH HÒA. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Nha Trang, tháng 07 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  DIỆP THỊ TỨ QUYỀN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA HỖN HỢP CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TRONG MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU PHỔ BIẾN Ở TỈNH KHÁNH HÒA. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm GVHD: TS Nguyễn Duy Nhứt Nha Trang, tháng 07 năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành được đề tài này Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Duy Nhứt đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô trong khoa Chế Biến đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian tôi học tập ở trường. Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang cùng các anh chị làm việc ở Viện đã quan tâm giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập vừa qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè đã tận tình động viên giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Diệp Thị Tứ Quyền ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2 1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH 2 1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp 2 1.1.2. Hoạt tính sinh học của chất chuyển hóa thứ cấp 2 1.1.3. Các chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển 2 1.1.3.1. Acetogenins 2 1.1.3.2. Terpenoids 3 1.1.3.3. Alkaloids 4 1.1.3.4. Phenolics 5 1.1.3.5. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong biển 6 1.2. SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN VIBRIO SPP GÂY BỆNH TRÊN TÔM 10 1.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Vibrio spp 10 1.2.2. Bệnh ở tôm do vi khuẩn Vibrio spp 11 1.3. ỨNG DỤNG CHẤT CHUYỂN HÓA ĐỂ SÀNG LỌC HOẠT TÍNH KHÁNG WSSV. 12 1.4. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT CÁC CHẤT CHUYỂN HÓA THỨ CẤP TỪ RONG BIỂN 13 1.4.1. Acetogenins 13 1.4.2. Terpenoids 13 1.4.3. Alkaloids 13 1.4.4. Phenolics 14 iii 1.5. KẾT LUẬN RÚT RA TỪ TỔNG QUAN 15 CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.3.1. Nghiên cứu điều kiện tối ưu ở công đoạn chiết cồn của quy trình tách chiết 17 2.3.1.1. Qui trình dự kiến tách chiết hỗn hợp chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 17 2.3.1.2. Giải thích quy trình: 18 2.3.1.3. Bố trí thí nghiệm: 19 2.3.2. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. 22 2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. 23 2.3.3.1. Nguyên tắc 23 2.3.3.2. Tiến hành 23 2.3.4. Tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi phân cực khác nhau 24 2.3.5. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách trên các dung môi có độ phân cực khác nhau 26 2.3.6. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cực khác nhau 27 2.3.7. Các máy móc thiết bị dung trong nghiên cứu khoa học 27 CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Kết quả nghiên cứu điều kiện tối ưu của quy trình chiết ethanol 28 3.1.1. Kết quả xác định nồng độ ethanol trong công đoạn chiết ethanol 28 3.1.2. Kết quả xác định nhiệt độ chiết ethanol 29 3.1.3. Kết quả xác định thời gian chiết ethanol 30 iv 3.2. Kết quả xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. 32 3.3. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol từ một số loài rong phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa. 34 3.4. Xác định hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp theo từng phân đoạn tách trên dung môi có độ phân cực khác nhau. 36 3.5. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của một số phân đoạn các chất chuyển hóa thứ cấp đã tách chiết được trên các dung môi phân cưc khác nhau 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 PHỤ LỤC 40 v DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục các loài rong dùng tách chiết chất chuyển hoá thứ cấp 16 Bảng 3.1. Kết quả định lượng chất chuyển hóa thứ cấp từ các loài rong biển 32 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol từ một số loài rong nghiên cứu được pha đến nồng độ 50g/ml bằng ethanol 35 Bảng 3.3. Hàm lượng các chất chuyển hóa thứ cấp trong các phân đoạn được phân lập bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau 36 Bảng 3.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết các dung môi khác nhau từ một số loài rong nghiên cứu 37 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc của acetogenins 2 Hình 1.2. Cấu trúc của terpenoids 3 Hình 1.3. Cấu trúc của halogenate terpenoids 3 Hình 1.4. Cấu trúc của alkaloids 4 Hình 1.5. Cấu trúc của phenolics 5 Hình 1.6. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong đỏ 6 Hình 1.7. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong nâu 7 Hình 1.8. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ rong lục 8 Hình 1.9. Một số chất chuyển hoá thứ cấp từ tảo lam 9 Hình 1.10. Vibrio spp phân lập từ tôm sú bệnh đốm trắng 11 Hình 1.11. Đốm trắng trên vỏ đầu ngực của tôm nhiễm bệnh đốm trắng 11 Hình 2.1. Sơ đồ qui trình dự kiến tách chiết chất chuyển hóa thứ cấp bằng ethanol 18 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ ethanol 19 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ chiết ethanol 20 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian chiết ethanol 21 Hình 2.5. Sơ đồ qui trình tách phân đoạn hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp bằng các dung môi phân cực khác nhau. 25 Hình 3.1. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nồng độ ethanol 28 Hình 3.2. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào nhiệt độ 30 Hình 3.3. Khối lượng chất khô phụ thuộc vào thời gian 31 Hình 3.4. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol 34 Hình 3.5. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn khác nhau 36 vii DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT CHỮ VIẾT TẮT DIẾN GIẢI WSSV White Spot Syndrome Virus LHM Lobster Haemolymph Medium 1 MỞ ĐẦU Trong thảm thực vật đa dạng và vô tận của đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có khả năng tự tái tạo đáng được lưu ý nhất. Rong nâu chứa nhiều các hợp chất thiên nhiên có giá trị dinh dưỡng và dược dụng cao. Đó là các chất dinh dưỡng đường (galactose, manose, xylose, ); 17 axít béo không no; các chất khoáng; keo và các vitamin cần thiết cho cơ thể sống; các polyphenol có khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ bảo vệ cơ thể loại trừ các gốc tự do nguy hiểm; fucoidan fucan có khả năng kích thích hệ miễn dịch, chống viêm nhiễm, ngăn ngừa ung thư, đồng thời làm tăng chỉ số chức năng gan; iốt hữu cơ giúp tuyến giáp hoạt động tối ưu, alginate là chất giải độc tự nhiên và laminaran là chất chống đông tụ máu và ung thư. Nước ta có bờ biển dài hơn 3.200 km trải dài từ Bắc xuống Nam, bao dọc hết phía Đông và phía Nam đất nước với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km 2 , được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú trong đó rong mơ (Sargassaceae) được phát hiện trên 60 loài với sản lượng khai thác ước tính trên 10.000 tấn/năm. Tận dụng triệt để nguồn nguyên liệu phong phú, ngày nay có rất nhiều công trình nghiên cứu về rong biển và đã đưa vào thực tiễn ứng dụng trên người, động vật và thủy hải sản. Tuy nhiên nghiên cứu về hoạt tính sinh học từ rong biển thì không nhiều. Vì vậy, đề tài ”Nghiên cứu tách chiết và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của hỗn hợp các chất chuyển hóa thứ cấp trong một số loài rong nâu phổ biến ở tỉnh Khánh Hòa ” là cần thiết, góp phần mở rộng nguồn nguyên liệu dược liệu, công nghệ sinh học và nông nghiệp. Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên thực hiện Diệp Thị Tứ Quyền [...]... c chit xut) mang uụi in Hm lng alkaloids trong thc vt thay i trong gii hn rt rng Ngy nay ngi ta qui c núi n thc vt cú alkaloids khi hm lng ca chỳng ln hn 100ppm Nhiu alkaloids cú trong thc vt 2 n 3% c bit trong v cõy canh ki na cú hn 10% Alkaloids hũa tan trong dch t bo, ớt thy trng thỏi t do, thụng thng dng mui (malat, xitrat, tactrat ) hoc kt hp vi tanin Trong mt loi thc vt him thy ch cú mt alkaloid,... 3000v/phỳt trong 10 phỳt Phn lng bờn trờn c tỏch ra v tip tc ly tõm 8000v/phỳt 40C trong 30 phỳt, lc qua mng lc 0.45m Cỏc dch cha virus m trng s dng c pha loóng trong LHM (lobster haemolymph medium) Chun b dch chit thụ ca rong Rong c chit hi lu vi ethanol trong 3 gi, 400C sau ú lc, ly tõm, cụ quay chõn khụng n khụ, ethanol tuyt i c a vo chit cỏc cht chuyn húa ra khi mui (NaCl tan 0% trong ethanol)... -1bar em cõn li cc xỏc nh c khi lng cht tan cú trong 20ml dch chit l giỏ tr tng lờn ca khi lng cc, nhõn khi lng ny vi 12.5 ta cú c khi 23 lng cỏc cht chuyn húa th cp cú trong 50g rong bin ca tng loi rong Vi 36 mu rong ta cú c 36 kt qu hm lng cht chuyn húa th cp trong tng loi 2.3.3 Kho sỏt hot tớnh khỏng khun ca cht chuyn húa th cp chit ethanol t mt s loi rong ph bin tnh Khỏnh Hũa Kho sỏt hot tớnh khỏng... thụ t mt s loi rong bin trong cụng b Sng lc hot tớnh khỏng khun ca mt s loi rong bin Khỏnh Ho ó chit cỏc cht chuyn hoỏ th cp bng ethanol 1.5 KT LUN RT RA T TNG QUAN T cỏc nghiờn cu ó cụng b cho thy hot tớnh khỏng vi sinh vt ca cỏc cht chuyn húa th cp t cỏc loi thc vt khỏc nhau c th hin trong dch chit t cỏc dung mụi khỏc nhau, tuy nhiờn i vi rong bin cỏc tỏc gi thng kho sỏt dch chit trong ethanol Nh... lng cht tan cú trong 20ml dch chit l giỏ tr tng lờn ca khi lng cc, nhõn khi lng ny vi 12.5 ta cú c khi lng cỏc cht chuyn húa th cp cú trong 50g rong bin + Xỏc nh nhit chit ethanol B trớ thớ nghim theo s sau: Rong ti Ra sch Chit ethanol cỏc nhit (0C ) RT 30 40 50 Khi lng cht khụ Chn nhit thớch hp Hỡnh 2.3 S b trớ thớ nghim xỏc nh nhit chit ethanol 21 Ly 200g rong ti xay nỏt trn u trong mỏy xay... giun v khỏng virus liu cao Mt s alkaloids t rong bin nh: Hỡnh 1.4 Cu trỳc ca alkaloids 5 1.1.3.4 Phenolics Phenol thng khụng cú dng t do trong thc vt, nhng li thng gp dng phenyl Nhiu phenol dng ete-oxyt trong tinh du nh esragol, safrol, apion, aneton Trong s cỏc diphenol, pyrocatechol l mt sn phm ca s nhit phõn t catechol, gaiacol, ete monometylic ca nú cú trong cỏc sn phm chng ct ca nha Guaiacum officinale,... phng phỏp c l thch 2.3.3.1 Nguyờn tc - Dng c c l thch phi c hp kh trựng 1200C trong 30 phỳt, a petri, bỡnh tam giỏc sy trong t sy - Chun b mụi trng nuụi cy, chng vi khun cn th nghim - Chun b dch chit rong: t 36 loi rong chn 5 loi rong nõu ph bin tnh Khỏnh Hũa v tin hnh theo qui trỡnh 2.1 thu c 5 dch chit rong t 5 loi rong khỏc nhau 2.3.3.2 Tin hnh - Dựng mụi trng TSB nuụi cy vi khun Vibrio - Cho... x 1,4 - 2,6 àm - 36 loi rong bin c thu t thỏng 3 n thỏng 5 nm 2012, c phõn loi v lu tr tiờu bn ti Vin Nghiờn cu v ng Dng Cụng Ngh Nha Trang Danh mc cỏc loi rong c s dng tỏch chit cht chuyn hoỏ th cp c trỡnh by trong bng 2.1 Bng 2.1: Danh mc cỏc loi rong dựng tỏch chit cht chuyn hoỏ th cp STT Tờn loi rong 1 STT 13 Tờn loi rong Ulva lactuca STT 25 Gracilaria fisheri 2 Tờn loi rong Sargassum microcystum... Xỏc nh hm lng cỏc cht chuyn húa th cp t rong bin Khỏnh Hũa bng phng phỏp chit ethanol Xỏc nh hm lng cht chuyn húa th cp t 36 loi rong nghiờn cu theo quy trỡnh nh lng hỡnh 2.1 sau khi ó xỏc nh cỏc iu kin ti u Xỏc nh hm lng bng cỏch cõn khi lng cht khụ sau cụ c ln 2 Tin hnh: Tng loi mt trong 36 loi rong bin ti c xay nỏt trn u trong mỏy xay sinh t, sau dú mi loi rong ly 50g ó xay nỏt trn u cho vo bỡnh... polysaccharide, nờn loi b c cỏc tp cht ny trong kt ta Phn dung dch cha cỏc cht chuyn húa th cp ó sch nhng cũn tan trong ethanol tuyt i vỡ vy ct loi ethanol tuyt i thu c cht chuyn húa th cp tinh sch V khi lng thu c l khi lng ca cht chuyn húa th cp 2.3.1.3 B trớ thớ nghim: Xỏc nh ch chit ethanol + Xỏc nh nng ethanol trong cụng on chit ethanol B trớ thớ nghim theo s sau: Rong ti Ra sch Chit ethanol nng . lượng các chất chuyển hóa thứ cấp từ rong biển Khánh Hòa bằng phương pháp chiết ethanol. 22 2.3.3. Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của chất chuyển hóa thứ cấp chiết ethanol từ một số loài rong phổ. Danh mục các loài rong dùng tách chiết chất chuyển hoá thứ cấp 16 Bảng 3.1. Kết quả định lượng chất chuyển hóa thứ cấp từ các loài rong biển 32 Bảng 3.2: Hoạt tính kháng khuẩn của chất chiết ethanol. QUAN 1.1. CHẤT CHUYỂN HOÁ THỨ CẤP VÀ HOẠT TÍNH 1.1.1. Khái niệm về chất chuyển hóa thứ cấp Các chất chuyển hóa thứ cấp là các hợp chất không cần thiết cho sự tăng trưởng và tái sinh của thực