BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI ThS. HỒ THỊ THANH THỦY Nha Trang 2011 BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số sinh viên : 4913044007 Lớp : 49SH Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội ThS. Hồ Thị Thanh Thủy Nha Trang - 2011 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành Đồ án này Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, ThS. Hồ Thị Thanh Thủy - Phó Giám đốc Công ty CPCN Việt Á và TS. Lê Huyền Ái Thúy - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Mở TP. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng. Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Công ty CPCN Việt Á đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án này. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Người thực hiện NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT i DANH MỤC CÁC BẢNG ii DANH MỤC CÁC HÌNH iii ĐẶT VẤN ĐỀ 1 PHẦN I. TỔNG QUAN 3 1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY 4 1.1. Sơ lược về ăn chay 4 1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước 4 2. TỔNG QUAN VỀ HỆ GEN TY THỂ 5 2.1. Cấu trúc hệ gen ty thể 5 2.2. Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật 8 3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG THỰC PHẨM 10 3.1. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein 10 3.1.1. Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di 11 3.1.2. Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 11 3.2. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA 12 3.2.1. Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization) 12 3.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 13 3.2.3. Phương pháp Real time PCR 15 PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17 1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18 1.1. Vật liệu- hóa chất 18 1.1.1. Mẫu thực phẩm 18 1.1.2. Mồi 18 1.1.3. Hóa chất. 18 1.2. Dụng cụ thiết bị 19 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Phương pháp xử lý mẫu 20 2.2. Phương pháp tách chiết DNA 20 2.2.1. Nguyên tắc 20 2.2.2. Tiến hành 21 2.3 .Tiến hành phản ứng PCR 21 2.3.1. Thành phần 21 2.3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng 21 2.3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 22 2.4. Điện di trên gel agarose 23 2.4.1. Nguyên tắc 23 2.4.2. Pha hóa chất 23 2.4.3. Tiến hành 23 2.5. Phương pháp thiết kế mồi. 23 2.5.1. Tiêu chuẩn thiết kế mồi 23 2.5.2. Các phần mềm sử dụng 24 2.5.3. Phương pháp tiến hành 24 2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lí thuyết 25 2.7. Phương pháp đánh giá mồi trên thực nghiệm 25 2.7.1. Phương pháp đánh giá khả năng hoạt động của mồi 25 2.7.2. Phương pháp khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi 25 2.7.3. Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi 25 2.7.4. Phương pháp khảo sát độ nhạy của phản ứng 26 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27 1. THIẾT KẾ MỒI 28 2. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỒI TRÊN LÝ THUYẾT 28 2.1. Khảo sát kích thước, %GC, nhiệt độ nóng chảy (T m ). 28 2.2. Khảo sát cấu trúc thứ cấp của mồi 29 2.3. Khảo sát tính đặc hiệu và sự nhân bản chọn lọc của mồi theo lý thuyết 31 3. KHẢO SÁT MỒI TRÊN THỰC NGHIỆM 35 3.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi 35 3.2. Kết quả giải trình tự 36 3.3. Khảo sát nhiệt độ lai 39 3.4. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40 3.5. Khảo sát độ nhạy của quy trình 41 4. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU THỰC PHẨM CHAY 42 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 1 KẾT LUẬN 45 2 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 i CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleotide triphotphat bp base pair BLAST Basic Local Alignment Search Tool EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid ELISA Enzyme Link Immuno Sorbent Assay FDA Food and Drug Administration IDT Intergrated DNA Technologies IEF Isoelectric Focusing mtDNA mitochondrial DNA PCR Polymerase Chain Reaction PAGE Polyacrylamide gel SDS Sodium Dodecyl Sulphate RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism rRNA ribosome ribonucleic acid tRNA transport ribonucleic acid ii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Ribosome của các loài 9 Bảng 3.1: Trình tự mồi thiết kế 28 Bảng 3.2: Kết quả khảo sát kích thước, %GC, Tm của mồi 28 Bảng 3.3: Năng lượng tự do ΔG của các cấu trúc thứ cấp 29 Bảng 3.4a: Kết quả BLAST mồi xuôi trên NCBI 33 Bảng 3.4b: Kết quả BLAST mồi ngược trên NCBI 34 Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR từ chứng dương 36 Bảng 3.6: Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với sản phẩm PCR trên GeneBank bằng phầm mềm BLAST 38 Bảng 3.7: Thống kê kết quả khảo sát 29 mẫu thực phẩm chay trên thị trường 43 iii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1: Cấu trúc của ty thể 6 Hình 1.2: Cấu trúc hệ gene ty thể 8 Hình 1.3. Nguyên tắc trong phản ứng PCR 15 Hình 3.1: Cấu trúc selt-dimer của hai mồi (a, b: cấu trúc của mồi xuôi, c: cấu trúc của mồi ngược) 30 Hình 3.2: Dạng cấu trúc hetero-dimer 30 Hình 3.3: Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi bằng Annhyb 31 Hình 3.4a: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi xuôi trên ClustalX 32 Hình 3.4b: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi ngược trên ClustalX 32 Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát sự hoạt động của mồi 35 Hình 3.6: Kết quả giải trình tự mẫu chứng dương DNA thịt heo 37 Hình 3.7: Kết quả kiểm tra độ tương đồng của sản phẩm PCR trên ClustalX 38 Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát nhiệt độ lai 39 Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ nhạy của quy trình 41 Hình 3.11: Kết quả ứng dụng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay 42 Sơ đồ : Quy trình tiến hành thí nghiệm 22 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Thế giới ẩm thực là vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt phải kể đến là thực phẩm dành cho những người ăn chay. Khoa học cũng đã chứng minh, ăn chay là một hình thức ăn uống có lợi cho sức khỏe như giúp giảm cân, giảm huyết áp, giảm bệnh động mạch vành tim, giảm nguy cơ bị sỏi thận, bị ung thư, giảm triệu chứng bệnh về xương và khớp… Do đó, xu hướng ăn chay ngày càng được nhiều người tiêu dùng có xu thế sử dụng. Trên thị trường thực phẩm chay, hàng hoá rất đa dạng từ thực phẩm khô đến hàng đóng hộp, ăn liền, chế biến sẵn với giá thành cao hơn nhiều so với những sản phẩm mặn thông thường. Thế nhưng, mức độ đáp ứng “đúng” tiêu chí của một loại thực phẩm ăn chay theo nghĩa: nguyên liệu dùng để sản xuất phải có nguồn gốc từ thực vật. Hiện tại, chỉ có một vài cơ sở lớn, chuyên sản xuất và kinh doanh thực phẩm chay như Âu Lạc, Kim Chi có ghi rõ đầy đủ thành phần nguyên liệu trên sản phẩm, trong khi đó sản phẩm của các cơ sở chế biến nhỏ, lẻ lại chưa được kiểm soát và rất thiếu thông tin về thành phần nguyên liệu [30] . Một số nghiên cứu mới đây cho thấy những thành phần hương liệu mà các nhà sản xuất đưa vào sản xuất thực phẩm chay có chứa thịt hoặc nước xương hầm thịt vì vậy khiến cho những người ăn chay vô tình phá giới và làm cho thực phẩm ăn chay chưa đúng với tên gọi của nó. Vấn đề đặt ra là làm sao để xác định được thành phần của sản phẩm chay có chứa thịt động vật hay hay không là một yêu cầu bức thiết. Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, một số nhà khoa học đã đưa ra một số phương pháp để nhận biết các loại thịt và xác định nguồn gốc của thịt nhưng vẫn chưa được các cấp quản lý thực phẩm quan tâm nhiều. Các phương pháp phát hiện thịt chủ yếu là dựa vào phát hiện trình tự gen ty thể để phát hiện loài. Bởi DNA ty thể có nhiều ưu điểm thích hợp làm đối tượng nghiên cứu như: DNA ty thể có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ; Số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào; trong khi tách chiết, DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân do có cấu trúc dạng vòng, khó bị phá vỡ và dễ dàng tách chiết hơn [2] . Đặc biệt, gen 16S ty thể là trình tự có những vùng [...]... có thể dựa vào đặc điểm này để xây dựng quy trình phát hiện DNA của động vật khi chúng có mặt trong thực phẩm chay Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể Mục đích của đồ án: đánh giá chính xác và nhận biết nhanh chóng sự có mặt của thịt trong các sản phẩm chay Nội dung: 1) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR. .. sát khả năng hoạt động của mồi khi thực hiện phản ứng PCR 4) Thử nghiệm phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phản ứng PCR gen 16S ty thể Về phương diện khoa học, đây là quy trình mới có thể nhận biết được sự có mặt của DNA các loài động vật nói chung Về mặt thực tiễn, phương pháp sẽ giúp cơ quan quản lý chất lượng thực phẩm kiểm soát được các mặt hàng thực phẩm chay trên thị trường, giúp người tiêu... địa phương với hình dáng và mùi vị rất giống với món mặn[32] Vấn đề thực phẩm chay bị nhiễm thịt đang được nhiều người quan tâm nên việc tìm ra phương pháp để phát hiện thịt trong thực phẩm chay là rất cần thiết 2 GIỚI THIỆU VỀ HỆ GEN TY THỂ 2.1 Cấu trúc của hệ gen ty thể[ 2,4,6,7,12,13,16]  Đặc điểm cấu trúc ty thể Ty thể được Altmann mô tả lần đầu vào năm 1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi của ty. .. nhiên phương pháp này cũng có một số hạn chế là kỹ thuật phức tạp, giá thành cao và độ nhạy thấp hợn so với phương pháp PCR 3.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)[5][18] Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Trong phương pháp PCR để xác định các loại thịt khác nhau trong thực phẩm, DNA đích làm khuôn để nhân bản có thể là đoạn DNA thuộc gen cytochrome b, gen 12S rRNA, gen 16S rRNA... hàng gần gũi 3 PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG THỰC PHẨM 3.1 Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein Có nhiều phương pháp dựa trên phân tích protein đã được ứng dụng để xác định các loại thịt và các thành phần từ động vật trong thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, điện di SDS, các phương pháp miễn dịch, ELISA, phân tích hóa học Tuy nhiên, phần lớn các phương pháp này chỉ... 25S 5S,(4.5S), 23S (5S), 26S 17S 16S 18S 80S 55S 5S, 5.8S, 28S 16S 18S 12S  Cơ sở sử dụng gen 16S trong phát hiện thịt động vật Trong hệ gen ty thể động vật chứa hai gen rRNA là 12S và 16S rRNA Gen 16S rRNA mã hóa cho phân tử rRNA trong tiểu phần lớn của ribosome ty thể, được sử dụng trong một số nghiên cứu phát hiện các loài động vật khác nhau như Gregory C 10 Booton, Jennifer R Carmichael, (2003);... thịt bò chay, thịt heo chay, sườn non chay, bóng cá chay, tôm chay, cánh gà chay, đùi gà chay, cá thu chay, mực chay Giá thành của các sản phẩm chay giả mặn thường cao hơn so với các sản phẩm mặn Theo khảo sát thị trường giá một số loại như sau: tôm chay 120.000đ/kg, mực chay cắt lát 50.000đ/kg, cá viên chay 30.000đ/kg, Sườn non chay: 65.000 đồng/kg, Chả lụa chay: 13.000 đồng/cây 400gr, Chà bông chay. .. tan của chúng trong dung dịch, kết quả là không xảy ra phản ứng kháng nguyên-kháng thể Vì vậy, phương pháp này không có hiệu quả cao trong phân tích các mẫu đã qua quá trình chế biến ở nhiệt độ cao Ngoài ra, phương pháp này còn giới hạn về thời gian và chỉ phát hiện được một đối tượng trong một lần thực hiện phản ứng 3.2 Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA 3.2.1 Phương pháp lai phân tử... khi sử dụng các sản phẩm chay 3 PHẦN I TỔNG QUAN 4 1 TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY 1.1 Giới thiệu về thực phẩm chay Thực phẩm chay là thực phẩm không chứa các thành phần động vật và những chất có nguồn gốc động vật Thực phẩm chay giả mặn là những thực phẩm được chế biến chủ yếu từ tinh bột được tạo hình mô phỏng thành các món ăn mặn như tôm, mực, thịt heo, bò, cá Thuật ngữ “ăn chay được biết đến ở... đường thấp hơn người ăn mặn khoảng 25%[28] Hơn nữa, ăn chay được xem như một biện pháp bảo vệ môi trường Do đó, nhu cầu về thực phẩm chay trên thị trường hiện nay là rất lớn 1.2 Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước Cơ quan tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm (FDA) tại Đài Bắc đã khám phá ra rằng 15 loại trong 21 loại thực phẩm chay giả thịt lấy từ các khu chợ có chứa DNA động vật, chiếm . chúng có mặt trong thực phẩm chay. Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài Xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể . Mục đích của. HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG. HỌC NHA TRANG NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN 16S TY THỂ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH CÔNG