NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG I. 3 TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 3 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG 3 1.2. GIỚI THIỆU VỀ PROBIOTICS 4 CHƢƠNG II 10 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 10 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 2.2.1. Cách tiếp cận vấn đề nghiên cứu 12 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật 13 2.2.3. Phƣơng pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh protease mạnh nhất: đƣợc đánh giá qua hoạt tính sinh protease 15 2.2.4. Phƣơng pháp xác định khả năng sinh trƣởng 16 2.2.5. Phƣơng pháp định danh chủng vi khuẩn (theo phƣơng pháp truyền thống) 17 2.2.6. Phƣơng pháp xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 19 2.2.7. Phƣơng pháp nuôi cấy và thu canh trƣờng chứa enzyme của chủng đã phân lập trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 22 2.3. PHƢƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 25 CHƢƠNG III 26 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG 26 3.2. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 28 3.3. ĐẶC ĐIỀM SINH HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP 29 3.3.1. Khả năng lên men các loại đƣờng 29 3.3.2. Khả năng sinh hơi 31 3.3.3. Khả năng chịu muối 32 3.3.4. Khả năng di động 32 3.4. XÁC ĐỊNH MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CHỦNG R2.1.5 PHÂN LẬP ĐƢỢC 33 3.4.1. Thời gian nuôi cấy thích hợp 33 3.4.2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp 35 3.4.3. pH thích hợp 36 3.5. THỬ NGHIỆM NUÔI CẤY CHỦNG R2.1.5 TRÊN MÔI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG CẤP 2 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 3.1. Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc 26 Bảng 3.2. Hoạt tính protease của 5 chủng vi khuẩn cao nhất phân lập đƣợc 27 Bảng 3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn tuyển chọn 28 Bảng 3.4. Khả năng lên men các loại đƣờng của các chủng vi khuẩn phân lập 30 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) 4 Hình 2.1. Cách thức tiếp cận vấn đề nghiên cứu 13 Hình 2.2. Quá trình phân lập vi sinh vật 15 Hình 2.3. Quá trình tuyển chọn vi khuẩn sinh protease 16 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm định danh vi khuẩn theo phƣơng pháp truyền thống 17 Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy tối ƣu 19 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian nuôi cấy tối ƣu 20 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu 21 Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH nuôi cấy tối ƣu 22 Hình 2.9. Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng đã phân lập trên môi trƣờng nhân giống cấp 2 24 Hình 3.1. Hoạt tính protease của các chủng tuyển chọn đƣợc 28 Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc và tế bào chủng R2.1.5 dƣới độ phóng đại X-100 29 Hình 3.3 Một số hình ảnh về khả năng lên men đƣờng của các chủng vi khuẩn đƣợc tuyển chọn 31 Hình 3.4. Khả năng sinh hơi của các chủng vi khuẩn tuyển chọn 31 Hình 3.5. Khả năng chịu muối của các chủng vi khuẩn 32 Hình 3.6. Khả năng di động của các chủng vi khuẩn 33 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh trƣởng và hoạt tính enzyme của chủng R2.1.5 34 Hình 3.8. Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở của nhiệt độ môi trƣờng khác nhau 36 Hình 3.9. Sự thay đổi họat tính sinh enzyme của chủng vi khuẩn R2.1.5 khi nuôi ở các pH môi trƣờng khác nhau 37 Hình 3.10. Canh trƣờng nuôi chứa enzyme protease của chủng R2.1.5 sau 18h nuôi cấy 38 Hình 3.11 Chế phẩm chứa chủng R2.1.5 sau khi đóng gói 38 Hình 3.12. Xác định hoạt độ protease theo phƣơng pháp Gross & Fuld 39 1 GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân MỞ ĐẦU Việt Nam có bờ biển dài trên 3000km và vùng thềm lục địa hàng triệu km 2 là điều kiện thuận lới để phát triển ngành thủy sản. Với truyền thống lao động cần cù sáng tạo của con ngƣời Việt Nam đồng thời với sự định hƣớng đúng đắn của Đảng và Nhà nƣớc, ngành Thủy sản đã phá triển mạnh mẽ vƣơn lên trở thành ngành có kim ngạch xuất khẩu đứng hàng thứ 3 chỉ sau dệt may và dầu khí. Năm 2010, sản lƣợng khai thác thủy sản là 2.450,8 ngàn tấn, kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,94 tỷ USD; sản lƣợng nuôi trồng thủy sản năm 2010 lên 2.706,8 ngàn tấn đã đƣa Việt Nam đứng thứ 6 trong số 10 nhà xuất khẩu thủy sản hàng đầu của thế giới và đứng thứ 5 trong khu vực châu Á sau Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia và Philippines. Để đẩy mạnh phát triển ngành thủy sản và khẳng định chủ quyền biển đảo, Chính phủ đã định hƣớng phải tăng cƣờng khai thác đánh bắt xa bờ và đẩy mạnh phát triển nuôi các loài cá biển có giá trị kinh tế, trong đó có cá chim vây vàng - đối tƣợng nuôi mới, có giá trị kinh tế cao. Tuy vậy muốn phát triển nuôi bền vững các đối tƣợng này cần phải sản xuất thức ăn có chứa các chế phẩm vi sinh vật hữu ích (probiotics) giúp tăng sức đề kháng, tăng khả năng tiêu hóa của cá trong điều kiện nuôi công nghiệp và hạn chế ô nhiễm môi trƣờng. Song hiện tại Việt Nam việc nghiên cứu chƣa nghiên cứu về chế phẩm probiotics dùng cho nuôi thủy sản còn rất hạn chế. Đặc biệt đối với cá chim vây vàng, hiện chƣa có chế phẩm dạng này. Xuất phát từ thực tế trên, em đƣợc Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng”, với mục đích phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có hoạt tính enzyme protease ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất chế phẩm probiotics dùng trong sản xuất thức ăn cho cá chim vây vàng. Nội dung của đề tài: 1) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám trên cá chim vây vàng, 2 GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt tính sinh protease cao, 3) Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh protease của chủng phân lập được Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn có các hạn chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân thành cảm ơn! 3 GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân CHƢƠNG I. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁ CHIM VÂY VÀNG Cá chim trắng vây vàng là loài cá biển có giá trị kinh tế cao, đƣợc nuôi nhiều ở Đài Loan, Trung Quốc, Singapore và tiêu thụ mạnh trên thị trƣờng thế giới. Tuy nhiên ở nƣớc ta, cá chim trắng vây vàng là đối tƣợng khá mới mẻ. Với đƣờng bờ biển dài, diện tích mặt nƣớc biển lớn, ngành nuôi cá biển đang trên đà phát triển mạnh. Đặc biệt, điều kiện biển tự nhiên ở nƣớc ta rất thích hợp với loài cá chim trắng vây vàng. Vì môi trƣờng sống của loại cá này là vùng biển ấm, vị trí rất thích hợp, những vùng vịnh, đầm phá, eo biển, biển nội địa ít sóng gió. Bên cạnh đó, là chất lƣợng nƣớc tốt, độ mặn nƣớc biển tƣơng đối ổn định. Nguồn thức ăn cho cá có tự nhiên, thức ăn tổng hợp đơn giản và giá thành không quá đắt. Cá chim vây vàng còn có một tên gọi khác là cá sòng mũi hếch hay cá chim trứng. Là loài cá ăn tạp, thiên về động vật, cá có thể kiếm thức ăn ở trong cát, cá trƣởng thành có thể bắt những động vật vỏ cứng nhƣ: ngao, cua, ốc. Giai đoạn cá giống thức ăn là động vật phù du và động vật đáy, chủ yếu là luân trùng, nauplius của Artemia. Cá con ăn tôm cá nhỏ, hai mảnh vỏ nhỏ. Thức ăn chính của cá trƣởng thành là các loại tôm cá nhỏ.Trong điều kiện ƣơng nuôi cá dài 2 cm thức ăn là cá tạp xay nhỏ, tôm tép băm nhỏ, thức ăn tổng hợp. Cá trƣởng thành ăn tôm nhỏ và thức ăn công nghiệp hoặc hoàn toàn thức ăn công nghiệp trong nuôi thƣơng phẩm. Sau đây là hệ thống phân loại của cá chim vây vàng: Nghành: Vertebrata Lớp: Osteichthyes Bộ: Perciformes Họ: Carangidae Giống: Trachinotus Loài: Trachinotus blochii Lacepede, 1801 [...]... chứng là 0,8 Sử dụng probiotics có tác dụng trên nhiều mặt và có nhiều triển vọng Tuy nhiên, tại Vi t Nam chƣa có những nghiên cứu đầy đủ về vai trò của vi sinh vật, đặc biệt là chƣa có các nghiên cứu bổ sung chúng vào thành phần thức ăn vi n cho nuôi cá chim vây vàng Do vậy vi c Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng với mục đích sử dụng cho... lọc các phƣơng pháp phân lập tuyển chọn các chủng probiotics có khả năng sinh enzyme protease theo sơ đồ: GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 13 Phân lập • Phân lập vi khuẩn tổng số trên môi trƣờng TSB • Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính protease • Xác định các đặc điểm hình thái • Xác định một số đặc tính sinh lý, sinh hóa Xác định hình thái • Tiến hành định danh chủng có hoạt tính. .. 22 20 G2.1.2 10 21 G2.1.5 12 Bảng 3.2 Hoạt tính protease của 5 chủng vi khuẩn cao nhất phân lập đƣợc STT Kí hiệu chủng Hoạt tính protease (D, mm) 1 G2.1.1 22 2 M2.4.1 23 3 R2.1.5 25 4 G1.2.2 20 5 M1.6.5 20 Nhận xét: Kết quả phân tích ở bảng 3.1 cho thấy trong 21 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease phân lập đƣợc có 5 chủng có hoạt tính cao nhất (Bảng 3.2) Các chủng này đƣợc đem bảo quản và tiến hành... PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG SINH PROTEASE CAO SỐNG BÁM TRÊN CÁ CHIM VÂY VÀNG Tiến hành lấy mẫu nội tạng của cá, các vị trí lấy mẫu đƣợc kí hiệu lần lƣợt nhƣ sau: Gan: G; Máu: M; Ruột: R Từ các mẫu thu đƣợc qua quá trình phân lập và nuôi cấy trên môi trƣờng TSB đã thu đƣợc 40 chủng vi khuẩn Qua sơ bộ tuyển chọn bằng phƣơng pháp đục lỗ thạch trên môi trƣờng chứa cơ chất casein và xác định hoạt tính. .. Trong các chủng vi khuẩn sinh protease cao đã phân lập đƣợc, chủng R2.1.5 có hoạt tính enzyme protease mạnh và ổn định Do đó, chủng R2.1.5 đƣợc chúng tôi sử dụng để nuôi cấy sơ bộ, thu sinh khối và xác định một số đặc tính sinh lý làm cơ sơ cho vi c định danh GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 28 Hình 3.1 Hoạt tính protease của các chủng tuyển chọn đƣợc 3.2 ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA CÁC CHỦNG VI. .. thƣờng có những nhóm vi sinh vật sau: - Các nhóm vi sinh vật cơ bản: Vi khuẩn lactic, Vi khuẩn Bacillus, Vi khuẩn quang dƣỡng khử H2S – vi khuẩn tía lƣu huỳnh, Nấm men (men rƣợu Saccharomyses) - Các nhóm vi sinh vật phụ: Nhóm vi khuẩn nitrat (Nitrosomonas và Nitrobacter), Nhóm xạ khuẩn, Nhóm nấm mốc 1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh... cho cá chim vây vàng là một hƣớng nghiên cứu cần thiết GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 10 CHƢƠNG II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Mẫu phân lập vi sinh Mẫu cá chim vây vàng đƣợc thu tại Trại thực nghiệm nuôi cá chim vây vàng của Khoa Nuôi trồng Thủy sản - Ba Làng - Nha Trang 2.1.2 Môi trƣờng nuôi vi sinh vật, hóa chất và thuốc thử Môi trƣờng phân lập. .. thạch trên môi trƣờng chứa cơ chất casein và xác định hoạt tính enzyme protease bằng phƣơng pháp đo đƣờng kính vòng phân giải đã tuyển chọn đƣợc 23 chủng vi khuẩn có hoạt tính protease Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1, 3.2 và hình 3.1 Bảng 3.1 Hoạt tính protease của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc STT Kí hiệu chủng Hoạt tính protease (D,mm) 1 R1.2.3 17 2 R1.2.7 19 3 M1.6.1 18 4 M1.6.2 18 5 M1.6.3...4 Theo Borut Forlan (2004) cá chim vây vàng sống ở vùng biển hở và đƣợc tìm thấy ở Thái Bình Dƣơng, Đại Tây Dƣơng, Ấn Độ Dƣơng Ở châu Á, cá chim vây vàng phân bố ở miền Nam Nhật Bản, Indonesia, Trung Quốc (Hoàng Hải, Đông Hải, Quảng Đông, Phúc Kiến, Hải Nam), Đài Loan Ở Vi t Nam, cá chim vây vàng đƣợc tìm thấy trên vịnh Bắc Bộ, miền Trung và Nam Bộ Hình 1.1 Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) 1.2... CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP Nuôi cấy vi khuẩn đƣợc tuyển chọn trên môi trƣờng TSB, quan sát hình thái khuẩn lạc của các chủng đƣợc tuyển chọn trên kính hiển vi Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.2 Bảng 3.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của vi khuẩn tuyển chọn STT Tên chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào Khuẩn lạc màu trắng sữa, rìa 1 G2.1.1 răng cƣa không đểu, bề mặt Vi khuẩn gram . chúng vào thành phần thức ăn vi n cho nuôi cá chim vây vàng. Do vậy vi c Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng với mục đích sử dụng. em đƣợc Vi n Nghiên cứu Công nghệ Sinh học giao thực hiện đề tài Nghiên cứu phân lập một số chủng vi khuẩn có hoạt tính protease sống bám trên cá chim vây vàng , với mục đích phân lập, tuyển. Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn sinh protease cao sống bám trên cá chim vây vàng, 2 GVHD: TS Vũ Ngọc Bội SVTH: Nguyễn Thị Bích Lân 2) Xác định một số đặc tính của chủng có hoạt