BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG VŨ THỊ XUÂN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nha Trang, tháng 07 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG ========== VŨ THỊ XUÂN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN TỪ TU HÀI (Lutraria philippinarum) ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN DUY Nha Trang, tháng 07 năm 2012 i LỜI CẢM ƠN Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập tại trường. Tôi xin dành lời cảm ơn sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Văn Duy, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, đã định hướng, dìu dắt và tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ án tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đề tài. Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè, những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và thực hiện đồ án vừa qua. Nha Trang, tháng 7 năm 2012 Sinh viên Vũ Thị Xuân ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 3 1.1.Tình hình dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản 3 1.1.1.Tình hình dịch bệnh 3 1.1.2.Các biện pháp phòng trừ 7 1.2.Tình hình nuôi trồng và đặc điểm sinh học của tu hài 8 1.2.1.Tình hình nuôi tu hài 9 1.2.2.Đặc điểm sinh học 9 1.3.Tổng quan về bacteriocin 11 1.3.1.Đặc điểm chung của bacteriocin 11 1.3.2.Phân loại bacteriocin 12 1.3.2.1.Bacterioin của vi khuẩn Gram âm 14 1.3.2.2.Bacteriocin của vi khuẩn Gram dƣơng 15 1.3.2.3.Bacteriocin của cổ khuẩn 16 1.3.3.Di truyền bacteriocin 16 1.3.4.Sinh tổng hợp bacteriocin 19 1.4.Tình hình nghiên cứu về vi khuẩn biển sinh bacteriocin 20 1.5.Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin biển 23 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 2.1. Vật liệu 26 2.1.1. Mẫu tu hài 26 2.1.2. Chủng vi sinh vật chỉ thị 26 2.1.3. Môi trƣờng và hóa chất chuyên dụng 27 iii 2.1.4. Thiết bị chuyên dụng 27 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 28 2.2.1. Phân lập vi khuẩn biển 28 2.2.2. Xác định đặc điểm hình thái 29 2.2.2.1. Hình thái khuẩn lạc 29 2.2.2.2. Nhuộm Gram 30 2.2.3. Xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn 32 2.2.3.1. Thu dịch chiết tế bào 32 2.2.3.2. Khảo sát sơ bộ khả năng sinh chất kháng khuẩn 32 2.2.4. Xác định hoạt tính sinh bacteriocin 33 2.2.5. Định danh vi khuẩn 34 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 3.1. Phân lập tổng số vi khuẩn hiếu khí từ tu hài 36 3.2. Sàng lọc vi khuẩn có hoạt tính kháng khuẩn 37 3.3. Tuyển chọn chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 38 3.4. Một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin 42 3.4.1. Hình thái khuẩn lạc 42 3.4.2. Nhuộm Gram 45 3.5. Định danh vi khuẩn 47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Bacteriocin của vi khuẩn và cổ khuẩn 13 Bảng 2.1. Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển 26 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn biển từ tu hài 37 Bảng 3.2. Hoạt tính kháng một số vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển 37 Bảng 3.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tế bào hai chủng X1.4 và X1.5 tƣơng ứng bằng đƣờng kính vòng kháng khuẩn đối với chủng chỉ thị B1.1 41 v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Tu hài Lutraria philippinarum 10 Hình 1.2.Tổ chức di truyền của bacteriocin 17 Hình 1.3. Số lƣợng bài báo nghiên cứu về bacteriocin trong mỗi thời kỳ 10 năm từ 1950-2010 đƣợc trích dẫn trên Pubmed. 20 Hình 2.1. Mẫu tu hài đƣợc dùng để phân lập vi khuẩn biển 26 Hình 2.2. Trình tự pha loãng mẫu phân lập 29 Hình 2.3. Phƣơng pháp cố định phiến vết 30 Hình 2.4. Phƣơng pháp nhuộm Gram 31 Hình 2.5. Minh họa vùng kháng khuẩn của bacteriocin trên đĩa thạch 33 Hình 3.1. Vi khuẩn biển phân lập từ tu hài ở nồng độ pha loãng 10 -7 sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 0 C 36 Hình 3.2. Hoạt tính kháng vi khuẩn chỉ thị B1.1 của các chủng vi khuẩn biển 38 Hình 3.3. Khả năng kháng của dịch chiết tế bào của chủng X1.5 và X1.4 trƣớc và sau khi trung hòa pH 39 Hình 3.4. Xác định bản chất protein của chất kháng khuẩn trong dịch chiết tế bào cuả chủng X1.5 và X1.4 40 Hình 3.5. Kiểm tra độ bền nhiệt của dịch bacteriocin thô cuả chủng X1.5 và X1.4 42 Hình 3.6. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.4 cấy ria và điểm 43 Hình 3.7. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.5 cấy ria và điểm 43 Hình 3.8. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.9 cấy ria và điểm 44 Hình 3.9. Hình thái khuẩn lạc chủng X1.11 cấy ria và điểm 44 Hình 3.10. Tế bào của chủng chủng X1.4 sau khi nhuộm Gram 45 Hình 3.11. Tế bào của chủng chủng X1.5 sau khi nhuộm Gram 46 Hình 3.12. Tế bào của chủng chủng X1.9 sau khi nhuộm Gram 46 Hình 3.13. Tế bào của chủng chủng X1.11 sau khi nhuộm Gram 47 Hình 3.14. Trình tự đoạn gen 16S rDNA của chủng X1.5 48 vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Viết đầy đủ 1 BLIS Bacteriocin-Like Inhibitory Substance 2 CFU Colony Forming Unit (Đơn vị hình thành khuẩn lạc) 3 FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations 4 IHHNV Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis 5 IHN Infectious Hematopoietic Necrosis 6 NCBI National Center for Bioinformatic Information 7 OD Optical Density (Mật độ quang) 8 RSIV Red Seabream Iridovirus 9 TSA Trypticase Soy Agar 10 TSB Trypticase Soy Broth 11 TSV Taura Sydrome in Penaeus Vannamei 12 VHS Viral Haemorrhagis Septicamia 13 VNN Viral Nervous Necrosis 14 WSSV White Spot Syndrome Virus 15 YHV Yellow Head Disease 1 LỜI MỞ ĐẦU Việt Nam có bờ biển dài hơn 3.260 km, với diện tích vùng biển rộng hơn 1 triệu km 2 , gấp 3 lần diện tích đất liền. Nuôi trồng thủy sản hiện là một trong những lĩnh vực sản xuất thực phẩm phát triển mạnh nhất ở nƣớc ta. Hoạt động nuôi trồng thủy sản đang tạo ra nguồn thu nhập chính cho ngƣ dân các vùng ven biển nƣớc ta nhờ có điều kiện tự nhiên phù hợp cho nuôi trồng một số loài hải sản chủ lực và nhờ có nguồn thu lớn từ xuất khẩu. Tuy nhiên, dịch bệnh thƣờng xuyên xảy ra đã gây thiệt hại kinh tế hàng triệu đô la Mỹ mỗi năm. Trong số các tác nhân gây bệnh thì vi khuẩn điển hình là các loài Vibrio, đƣợc coi là một trong những nguyên nhân chính. Hơn nữa, cùng với hiện tƣợng biến đổi khí hậu toàn cầu, những quan ngại đối các vi khuẩn gây bệnh ngày càng tăng lên, bởi vì ở nhiệt độ cao hơn thì khả năng gây bệnh và truyền nhiễm cũng tăng theo. Để giải quyết vấn đề này, ngƣ dân thƣờng xuyên sử dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006). Tuy nhiên chất kháng sinh dƣờng nhƣ đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do việc lạm dụng quá mức. Việc sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thƣờng và gây ra hiện tƣợng mất cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong sản phẩm thủy sản có hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Vì vậy, các giải pháp thay thế thân thiện với con ngƣời và môi trƣờng đang đƣợc quan tâm nghiên cứu và ứng dụng nhƣ sử dụng vaccine. Nhƣng việc sử dụng vaccine thƣờng tốn chi phí sản xuất, chi phí nhân công và gây stress mạnh cho động vật nuôi (Corripio-Myar et al, 2007; Smith, 2007). Hơn nữa vẫn chƣa có vaccine ngừa bệnh cho tôm và nhuyễn thể (Subasinghe, 2009). Vấn đề đặt ra là cần tìm một chất kháng sinh thế hệ mới có hiệu quả tốt trong phòng và trị bệnh, an toàn, thân thiện với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng. Những nghiên cứu gần đây cho thấy bacteriocin là chất kháng sinh thế hệ mới đáp ứng đủ các yêu cầu mong muốn do bản chất là protein an toàn và thân thiện với môi trƣờng, phổ kháng khuẩn hẹp giúp hạn chế sự kháng thuốc của vi khuẩn. Tuy nhiên 2 các nghiên cứu gần đây mới chỉ tập trung nghiên cứu về bacteriocin của vi khuẩn lactic nhằm ứng dụng bảo quản thực phẩm. Hệ vi sinh vật biển đa dạng và phong phú là tiềm năng lớn cho các nghiên cứu các hoạt chất sinh học đặc biệt là các hợp chất kháng khuẩn. Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật biển sản xuất bacteriocin hoặc các hợp chất tƣơng tự bacteriocin (Bacteriocin-Like Inhibitory Substances, BLIS) đặc biệt là các vi sinh vật biển sống bám trên động vật biển lại rất ít. Cho đến nay, những nghiên cứu nhƣ vậy vẫn hoàn toàn bỏ ngỏ ở Việt Nam. Vì những lý do trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (Lutraria philippinarum)” với các nội dung chính: - Phân lập vi khuẩn biển từ tu hài - Sàng lọc vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn - Xác định hoạt tính bacteriocin của các chủng phân lập [...]... về vi khuẩn biển sinh bacteriocin Hệ vi sinh vật biển đa dạng và phong phú là tiềm năng lớn cho các nghiên cứu sản sinh các hoạt chất sinh học đặc biệt là các hợp chất kháng khuẩn đó là yếu tố cần thiết cho cuộc chiến sinh tồn trong thế giới hiển vi của vi sinh vật Tuy nhiên, các nghiên cứu về vi sinh vật biển sản xuất bacteriocin hoặc các hợp chất tƣơng tự bacteriocin (BLIS) đặc biệt là các vi sinh. .. bacteriocin là các bacteriocin có nguồn gốc từ biển (Nguồn: Desriac et al, 2010) Bacteriocin đầu tiên đƣợc phát hiện từ vi sinh vật biển là từ vi khuẩn Vibrio harveyi (trƣớc đây là Beneckea harveyi) McCall và Sizemore (1979) đã tuyển chọn đƣợc 795 chủng Vibrio spp phân lập từ đảo Galveston, Texas có khả năng sản sinh bacteriocin (McCall &Sizemore, 1979) Nghiên cứu này thể hiện rằng khoảng 5% của vi khuẩn Vibrio... thực hiện đề tài để phân lập vi khuẩn biển (Bảng 2.1) Bảng 2.1 Thu mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển Sô thứ tự Ngày phân lập Số lƣợng mẫu (con) 1 16/2/2012 3 2 20/3/2012 3 3 24/4/2012 3 2.1.2 Chủng vi sinh vật chỉ thị Giống vi sinh vật đƣợc sử dụng bao gồm: vi khuẩn gây bệnh cho động vật thủy sản đƣợc dùng làm chỉ thị cho hoạt tính kháng khuẩn (Vibrio sp V1.1 ; Vibrio sp V3.3) và vi khuẩn gây thối dùng... nhƣ một số bacteriocin phân lập từ vi khuẩn Gram dƣơng và cổ khuẩn (Carraturo et al, 2006) Cuối cùng, hầu hết các BLIS từ vi khuẩn biển đƣợc sản xuất tĩnh trong giai đoạn tăng trƣởng, tƣơng tự nhƣ bacteriocin từ vi khuẩn Gram dƣơng (Pinto et al, 2009; Tahiri et al, 2004) 1.5 Tiềm năng ứng dụng của bacteriocin biển Vi c sử dụng bacteriocin biển trong các ứng dụng probiotic, chất bảo quản, và, sôi nổi... mô tả xác định bacteriocin hoặc BLIS, mà chỉ đƣa ra các phân loại ban đầu 22 Bacteriocin biển tƣơng đối đa dạng Carnobacterium là vi khuẩn Gram dƣơng sinh axit lactic phân lập từ các sinh vật biển (nhƣ cá và các loài bọt biển) , từ môi trƣờng lạnh và ôn đới, cũng nhƣ từ môi trƣờng trên mặt đất bao gồm cả đất mùa đông, lớp băng vĩnh cửu và phân ngựa (Leisner et al, 2007) C divergens và C maltaromaticum... U149, và carnobacteriocin B2 là một số của các bacteriocin phân lập từ loài Carnobacterium biển (Tahiri et al, 2004; Yamazaki et al, 2005) Các Những bacteriocin có các đặc tính tƣơng tự với các bacteriocin loại II của các vi khuẩn Gram dƣơng Nhiều BLIS đã đƣợc xác định từ các loài sinh vật biển thuộc Vibrio, Aeromonas, Carnobacterium, Lactococcus, Streptomyces, Pseudoalteromonas, Enterococcus, và chi... thấy bacteriocins mới và thú vị, có thể đóng một vai trò quan trọng trong tác dụng kháng khuẩn và bảo quản sinh học trong ngành thủy sản 26 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1 Mẫu tu hài Mẫu tu hài (Lutraria philippinarum) nghiên cứu đƣợc thu mua từ vịnh Cam Ranh – Khánh Hòa (Hình 2.1) Hình 2.1 Mẫu tu hài đƣợc dùng để phân lập vi khuẩn biển Mẫu tu hài đƣợc thu mua ba lần... chi Pediococcus (Carraturo et al, 2006; Messi et al, 2003; Shehane & Sizemore, 2002; Zai et al, 2009) Những loài này rất quan trọng trong ngành công nghiệp hải sản và sức khỏe con ngƣời Bacteriocin và BLIS phân lập từ vi sinh vật biển rất đa dạng Tuy nhiên, chúng có đặc điểm chung với bacteriocin từ vi khuẩn và cổ khuẩn Chúng có thể là các peptide nhỏ (5-10 kDa) nhƣ microcin của vi khuẩn Gram âm, microhalocin... xuyên sử dụng các chất kháng sinh để điều trị các bệnh do vi khuẩn (Cabello, 2006) Tuy nhiên chất kháng sinh dƣờng nhƣ đã mất hiệu quả trong nuôi trồng thủy sản do vi c lạm dụng quá mức Vi c sử dụng các chất kháng sinh không chỉ làm tăng khả năng kháng bệnh của vi khuẩn, phá vỡ hệ vi sinh bình thƣờng và gây ra hiện tƣợng mất cân bằng vi sinh (microdysbiosis) mà còn làm tích lũy các gốc kháng sinh trong... năng của các bacteriocin đƣợc sản sinh bởi vi khuẩn Gram âm, Gram dƣơng và cổ khuẩn đƣợc xem xét ở 17 mức độ di truyền Nói chung, đầy đủ các chức bacteriocin sản xuất bởi các vi khuẩn Gram âm đƣợc mã hóa thông qua ba gen liên kết chặt chẽ là gen độc tố, miễn dịch và các gen phân giải (Hình 1.2A) Tuy nhiên, có sự khác biệt đáng kể trong di truyền học của colicin, bacteriocin giống colicin, bacteriocin . tuyển chọn các chủng vi khuẩn biển sinh bacteriocin từ tu hài (Lutraria philippinarum) với các nội dung chính: - Phân lập vi khuẩn biển từ tu hài - Sàng lọc vi khuẩn có khả năng kháng khuẩn -. mẫu Tu hài phân lập vi khuẩn biển 26 Bảng 3.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn biển từ tu hài 37 Bảng 3.2. Hoạt tính kháng một số vi khuẩn chỉ thị của các chủng vi khuẩn biển 37 Bảng 3.3 VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG VŨ THỊ XUÂN PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN BIỂN SINH BACTERIOCIN TỪ TU HÀI