Đang tải... (xem toàn văn)
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ DỰ ÁN HỢP TÁC VIỆT NAM – HÀ LAN BÀI GIẢNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người biên soạn: TS. Trần Thị Lệ Huế, 08/2009 5 BÀI I CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP I. Khái niệm 1. Ý nghĩa của tạo dòng DNA Trước đây khoảng hơn một trăm năm Gregor Mendel đã đưa ra những định luật cho phép giải thích sự di truyền những đặc điểm sinh học. Cơ sở của những định luật này là mỗi một đặc điểm di truyền của sinh vật được điều khiển bởi 1 yếu tố, được gọi là gene, tồn tại ở đâu đó trong tế bào. Sự khám phá lại những định luật này của Mendel vào năm 1900 là sự khai sinh của di truyền học, ngành khoa học này có mục đich là hiểu bản chất của gene và giải thích những tác động của nó. Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các gene từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gene người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn. Công nghệ DNA tái tổ hợp (thường được gọi là công nghệ di truyền) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA. 2. Tạo dòng DNA là gì? Về nguyên tắc một thí nghiệm tạo dòng DNA gồm những bước cơ bản sau đây: 1. Tinh sạch DNA 2. Cắt phân tử DNA 3. Xác định độ lớn của các đoạn DNA 4. Đưa các đoạn DNA vào vectơ tạo DNA tái tổ hợp 5. Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ 6. Xác định những tế bào chủ chứa phân tử tái tổ hợp DNA 3. Tại sao sự tạo dòng DNA quan trọng như vậy ? Ý nghĩa của tạo dòng đối với nghiên cứu và công nghệ sinh học Từ hình 1.1 ta nhận thấy việc tạo dòng gene là một quá trình tương đối đơn giản. Tại sao phương pháp này trong sinh học lại có ý nghĩa lớn như vậy ? Câu trả lời là: Trước hết việc tạo dòng gene là tách một gene ra khỏi tất cả những gene khác ở dạng tinh khiết, mà những gene này thường tồn tại với nhau trong một tế bào. Sẽ hiểu chính xác hơn khi quan sát thí nghiệm tạo dòng ở hình 1.2. Đoạn DNA được tạo dòng có thể thuộc một hỗn hợp gồm nhiều đoạn khác nhau, mà mỗi đoạn mang một gene hoặc một phần của gene. Hỗn hợp này có thể là toàn bộ hệ gene của một sinh vật (ví dụ hệ gene của người). Sau đó mỗi một đoạn được đưa vào một phân tử vector phù hợp và tạo nên một tập hợp các phân tử DNA tái tổ hợp, trong đó một phân tử mang gene cần tìm. Thông thường mỗi tế bào chủ chỉ tiếp nhận một phân tử DNA tái tổ hợp duy nhất. Như vậy, khi một gene nào đó được tách ra từ nhiều gene khác thì người ta có thể nghiên cứu đặc điểm của nó chính xác hơn. Quyết định sự thành công của thí nghiệm tạo dòng là liệu người ta có phân biệt được dòng quan tâm từ nhiều dòng khác nhau không? Ví dụ khi quan sát hệ 6 gene của vi khuẩn E.coli có khoảng 2000 gene, có thể tìm ra một gene trong điều kiện có nhiều dòng không (Hình 1.3)? Kỹ thuật gene đã mở ra một loạt cơ hội mà trước đây không thể có được. Vấn đề cơ bản là các gene có kích thước quá nhỏ và có hàng ngàn gene ở trong mỗi tế bào. Thậm chí khi quan sát trên kính hiển vi mạnh nhất, thì DNA xuất hiện như là một sợi dây bé xíu, không thể thấy các nucleotide và không có một dấu hiệu nào để nhận biết chỗ bắt đầu và kết thúc của một gene. Hình 1.1. Các bước cơ bản của tạo dòng DNA 1. Thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp Vector Đ o ạn DNA ngoại lai Phân t ử DNA tái tổ hợp 2. Đưa vào tế bào chủ Vi khuẩn 3. Nhân phân tử DNA tái tổ hợp Vi khu ẩn chứa phân tử DNA tái tổ hợp 4. Nhân tế bào chủ 5. Xu ất hiện một d òng qua nhiều lần phân chia tế bào Các dòng vi khu ẩn phát triển trên môi trường agar 7 Hình 1.2. Bằng việc tạo dòng người ta tạo ra dạng đồng nhất chứa các đoạn DNA khác nhau Vector Các đoạn DNA Các phân tử DNA tái tổ hợp M ỗi phân tử chứa một đ o ạn DNA khác nhau Đưa vào vi khuẩn Nuôi trên môi trường agar M ỗi một d òng ch ứa một phân tử DNA tá i t ổ hợp khác nhau với nhiều bản sao 8 Để minh họa vấn đề này chúng ta hãy xem xét một ví dụ đặc trưng về di truyền phân tử như sau: Giả thiết chúng ta muốn phân lập một gene của người và đưa nó vào vi khuẩn để sản xuất một lượng lớn các protein người. Vấn đề đầu tiên là phải tìm được gene mong muốn. Geneome đơn bội của người chứa khoảng 3,3 tỷ cặp base. Giả sử gene mà chúng ta muốn phân lập dài 3.000 bp. Như vậy gene đích của chúng ta chỉ chiếm một phần triệu của geneome, vì thế để tìm kiếm gene trong một hệ gene đồ sộ là khó khăn hơn nhiều so với việc tìm kiếm một cây kim trong một đống cỏ khô. Và nếu chúng ta có thể định vị gene, thì tách nó ra khỏi geneome như thế nào? Không có forcep đủ nhỏ để gắp một đoạn DNA, và cũng không có một cái kéo cơ học nào đủ nhỏ để cắt ra khỏi hệ gene một đoạn gene riêng biệt. Hình 1.3. Vấn đề khó khăn khi chọn lọc M ột đ o ạn rất nhỏ từ geneome của E. coli Gene mu ốn tạo dòng Nh ững đ o ạn DNA với những gene khác nhau, trong đó có trpA mà người ta muốn tạo dòng Làm th ế n ào mà ng ư ời ta t ìm ra được 1 gene hoặc xác định nó? 9 Công nghệ DNA tái tổ hợp đã biến đổi sâu sắc phương thức nghiên cứu gene. Trước đây thông tin về cấu trúc và tổ chức của gene thu được bằng cách kiểm tra biểu hiện kiểu hình, ngày nay những kỹ thuật mới đã tạo ra khả năng tự đọc các trình tự nucleotide. Trước đây các nhà di truyền phải chờ đợi sự xuất hiện các đột biên ngẫu nhiên hoặc cảm ứng để phân tích hiệu quả của sự sai khác di truyền, ngày nay họ có thể tạo ra đột biến ở các điểm nhất định một cách chính xác và xem chúng thay đổi kiểu hình như thế nào. Công nghệ DNA tái tổ hợp đã cung cấp thông tin mới về cấu trúc và chức năng của gene và đã thay đổi nhiều khái niệm cơ bản của di truyền học. Ví dụ: trong khi mã di truyền được xem là rất phổ biến, thì bây giờ chúng ta còn biết rằng các mã không phổ biến cũng tồn tại trong DNA ty thể. Trước đây chúng ta cho rằng tổ chức gene eukaryote giống với prokaryote, nhưng bây giờ đã chứng minh được nhiều gene eukaryote bị gián đoạn bởi các intron. Ngày nay, chúng ta đã biết đầy đủ hơn về các quá trình tái bản, phiên mã, dịch mã, biến đổi RNA (RNA processing) và điều hòa gene thông qua việc sử dụng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Các kỹ thuật này cũng được dùng trong nhiều trong nhiều lĩnh vực khác, như hóa sinh học, vi sinh vật học, sinh học phát triển, sinh học thần kinh, tiến hóa và sinh thái học. Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng để tạo ra nhiều sản phẩm thương mại: thuốc, hormone, enzyme và các giống cây trồng, vật nuôi. Một nền công nghiệp hoàn toàn mới, công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới. Trong y học, kỹ thuật DNA tái tổ hợp được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn đoán các bệnh di truyền và nhiễm trùng, sản xuất thuốc và điều trị các rối loạn di truyền. Nếu chúng ta thành công trong việc định vị và phân lập gene mong muốn, thì bước tiếp theo là đưa nó vào tế bào vi khuẩn. Các đoạn DNA mạch thẳng sẽ bị thoái biến nhanh bởi vi khuẩn và để tồn tại và tái bản được gene phải được chèn vào trong một dạng ổn định. Khi biến nạp DNA tái tổ hợp thành công vào vi khuẩn còn phải đảm bảo rằng gene được phiên mã và dịch mã. Sự biểu hiện của gene là một quá trình phức tạp đòi hỏi một số trình tự DNA khác nằm ở ngoài gene. Tất cả những trình tự này phải hiện diện trong các hướng, ở các vị trí thích hợp của chúng để sản xuất protein. Phản ứng chuỗi polymerase 10 Hình 1.4. Bằng phản ứng chuỗi polymerase người ta có hàng triệu bản sao từ một gene Cuối cùng, các phương pháp được sử dụng để chuyển gene có hiệu quả rất thấp, trong hàng triệu tế bào chỉ có một số tế bào được biến nạp thành công và biểu hiện gene. Vì vậy, chúng ta có phương pháp để phát hiện được tế bào mang DNA tái tổ hợp mong muốn. Trong toàn bộ nghiên cứu sinh học chỉ có rất ít lĩnh vực không bị tác động bởi tạo dòng DNA, PCR và kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Đã từ lâu con người đã sử dụng vi sinh vật như vi khuẩn để sản xuất các hợp chất có ích, ví dụ thuốc kháng sinh penicillin, được tạo thành từ loài nấm có tên là Penicillium và streptomycin, một sản phẩm của vi khuẩn Streptomyces griseus. Tạo dòng DNA đã đưa lại cho sinh học một cuộc cách mạng, vì chúng mở ra một khả năng sản xuất protein của động vật có vú trong tế bào vi khuẩn. Các gene tạo dòng có một đặc điểm quan trọng là có thể biểu hiện trong một loài sinh vật không có quan hệ họ hàng gì với loài của nó. Như vậy, người ta có thể tạo dòng gene động vật trong vi khuẩn (Hình 1.5). Điều này có ý nghĩa rất lớn, người ta có thể tách các gene điều khiển tổng hợp chất kích thích và hocmon từ một cơ thể tồn tại trong tự nhiên. Sự tách chiết một chất từ sinh vật nguyên thuỷ thường đắt và khó khăn, nhưng khi đưa gene tương ứng vào vi khuẩn hoặc sinh vật khác thì sẽ thu được sản phẩm dễ dàng và với khối lượng lớn. Với phương pháp này người ta đã thành công trong nhiều trường hợp, cho đến nay có ý nghĩa nhất là sản xuất insulin bằng công nghệ gene. T ế b ào đ ộng vật Gene mã hóa cho m ột protein đ ộng vật Vector cùng v ới gene động Nhi ễm sắc thể Vi khu ẩn biến đ ổi gene mRNA 11 Hình 1.5. Phương pháp để sản xuất một protein động vật trong vi khuẩn Những nghiên cứu về y học và nông nghiệp nhờ tạo dòng DNA đã có những bước tiến quan trọng. Nhờ tạo dòng DNA mà người ta đã phát triển những chất tiêm phòng để bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tật. Nhiều bệnh di truyền ngày nay có thể chẩn đoán ở giai đoạn bào thai và những nghiên cứu xác định được bệnh ở giai đoạn sớm nhất, như ung thư vú và những bệnh hiểm nghèo, có hy vọng chữa trị được. II. Các enzyme tác động lên DNA Khả năng thay đổi DNA trong ống nghiệm là dựa trên những nghiên cứu về sự tổng hợp và biến đổi DNA trong tế bào sống. Người ta đã phát hiện những enzyme có trong tế bào có thể cắt và nối DNA và đã phân lập được những enzyme này. Với chúng ngày nay người ta có thể tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp. Đặc điểm của những enzyme này và việc sử dụng chúng vào thí nghiệm tạo dòng sẽ đề cập chi tiết sau đây. Ch ỗ cắt Ch ỗ cắt Liên kết hydro Nucleotide Liên kết phosphodiester a. M ột exonuclease Ch ỗ cắt b. M ột endonuclease 12 Hình 1.6. Các phản ứng do hai loại nuclease xúc tác a. Exonuclease tách các nucleotide từ các đầu cuối phân tử DNA b. Endonuclease cắt liên kết phosphodiester từ bên trong Khi đã có DNA tinh khiết, bước tiếp theo của thí nghiệm tạo dòng là thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp. Vector tạo dòng cũng như DNA phải được cắt ở những vị trí xác định và bằng cách xác định để nối lại với nhau. Cắt và nối là hai ví dụ về phương pháp thay đổi DNA. Trong những năm qua một loạt các phương pháp được phát triển để biến đổi các phân tử DNA không những chỉ cắt, nối mà có thể làm ngắn, nối dài, gắn vào hoặc tách những nhóm hoá học xác định nào đó. Tất cả những biến đổi này có thể thực hiện được trong ống nghiệm, và tạo nên nền tảng không chỉ đối với tạo dòng mà còn đối với những nghiên cứu cơ bản về hoá sinh DNA, cấu trúc của gene và điều khiển sự biểu hiện gene. Trong tế bào những enzyme này tham gia vào các quá trình sống, như tái sinh, sao chép, phân giải (ví dụ DNA của virus), sửa chữa DNA đột biến và kết hợp các phân tử DNA khác nhau. Nhiều loại enzyme này được tách từ dịch tế bào và chúng có thể thực hiện chức năng trong điều kiện nhân tạo. Các phản ứng enzyme thường rất đơn giản, nhưng đòi hỏi enzyme phải ở dạng tinh khiết. Enzyme được chia làm 5 nhóm lớn dựa trên phản ứng mà enzyme xúc tác. 1. Nuclease là những enzyme cắt, làm ngắn, phân giải các phân tử nucleic acid 2. Ligase nối các phân tử nucleic acid 3. Polymerase sản sinh các bản sao của phân tử nucleic acid 4. Các enzyme biến đổi bằng cách tách hoặc gắn những nhóm hoá học 5. Topoisomerase: làm xuất hiện hoặc mất cấu trúc xoắn của DNA dạng vòng. Trước khi đi vào các nhóm enzyme cụ thể cần phải nêu lên hai điểm: Thứ nhất phần lớn các enzyme được xếp vào một nhóm, tuy nhiên một số enzyme có thể thuộc vào hai hay nhiều nhóm. Vi dụ các polymerase, chúng vừa có thể tạo nên phân tử DNA mới và vừa có hoạt tính của nuclease là phân giải DNA. Thứ hai là cần chú ý rằng, bên cạnh những enzyme làm thay đổi DNA, người ta cũng biết nhiều enzyme tương tự tác dụng lên RNA. Ví dụ enzyme ribonuclease, sử dụng để phân giải RNA trong dịch tế bào khi muốn thu nhận DNA tinh sạch. Ở đây trước hết đề cập đến enzyme tác động lên DNA. 1. Nuclease Cũng theo tiêu chuẩn này người ta phân biệt các endonuclease. Endonuclease S1 (từ nấm Aspergillus oryzae) chỉ tác động lên từng sợi đơn (Hình 1.8a), trong khi đó deoxyribonuclease I (DNase I, từ dạ cỏ bò), cắt cả sợi đơn và sợi kép (Hình 1.8b). DNase I tác động lên DNA ở các liên kết phosphodiester bên trong. Khi xử lý với enzyme càng lâu thì xuất hiện một hỗn hợp các mononucleotide và các oligonucleotide rất ngắn. 13 Hình 1.7. Các loại exonuclease khác nhau xúc tác cho các phản ứng a. Bal31 tách các nucleotide từ hai đầu của DNA sợi kép b. Exonuclease III tách nucleotide chỉ đầu cuối 3’ Ngược lại, có một nhóm đặc enzyme biệt hơn, được gọi là enzyme hạn chế (restriction endonuclease), cắt DNA sợi kép chỉ ở một số vị trí xác định (Hình 1.8c). Những enzyme này sẽ được mô tả chi tiết ở phần sau. a. Bal 31 b. Exonuclease III [...]... loại enzyme hạn chế khác nhau Loại I và III có ý nghĩa rất giới hạn đối với công nghệ sinh học Ngược lại loại II là những enzyme cắt rất quan trọng đối với tạo dòng DNA 2 Enzyme hạn chế loại II cắt DNA ở những trình tự hoàn toàn xác định Enzyme hạn chế loại II đặc biệt đã trở thành một công cụ rất hữu ích đối với các nhà sinh học phân tử Những enzyme này gắn vào DNA ở bất kỳ vị trí nào và di chuyển dọc... DNA khác nhau hoặc hai đầu của một phân tử Phản ứng hoá học ở sự sửa chữa các chỗ đứt cũng giống phản ứng nối, chỉ khác là ở phản ứng nối hai liên kết phosphotdiester giữa hai sợi được tạo nên (Hình 1.25a) 2 Các đầu dính tăng hiệu quả phản ứng gắn Ở hình 1.25a hai đoạn DNA đầu bằng được nối lại với nhau Tuy nhiên phản ứng này đạt hiệu quả rất thấp Để phản ứng nối các đầu bằng có hiệu quả thì nồng độ DNA... được lấp đầy (Hình 1.10c) Ứng dụng quan trọng nhất là đoạn Klenow là xác định trình tự DNA Một loại DNA-polymerase thứ ba là reverse transcriptase, enzyme tham gia vào sự tái sinh của nhiều virus Đặc tính duy nhất của nó là sử dụng RNA làm khuôn (Hình 1.10d) Khả năng tổng hợp nên sợi DNA bổ sung từ RNA khuôn của enzyme có ý nghĩa trung tâm trong kỹ thuật tạo dòng cDNA a Phản ứng cơ bản Sợi khuôn Đoạn... chúng cùng cắt trong một phản ứng Ngược lại, thì cho hai phản ứng xảy ra kế tiếp nhau để có điều kiện phù hợp với từng loại enzyme Qua việc so sánh kết quả của phản ứng cắt đơn và đôi người ta có thể xác định được nhiều hay tất cả vị trí các điểm cắt (Hình 1.23) Trong những trường hợp còn chưa rõ ràng thì để phản ứng cắt xảy ra từng phần, nghĩa là chọn điều kiện phản ứng để chỉ một phần các vị trí... nối các đoạn DNA lại với nhau (Hình 1.24) Enzyme xúc tác cho phản ứng này là DNAligase Gene tạo dòng Vector DNA-ligase Gene Phân tử DNA tái tổ hợp Hình 1.24 Nối kết (ligation): Bước cuối cùng khi thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp 1 Tác dụng của DNA-ligase Trong các tế bào sống đều có mặt DNA-ligase, nhưng enzyme được sử dụng trong công nghệ gene có nguồn gốc từ vi khuẩn E coli nhiễm phage T4 36 Trong... enzyme có khả năng thay đổi hình dạng của DNA vòng, đồng hoá trị (DNA plasmid), bằng cách làm mất hoặc xuất hiện xoắn ở mức cao hơn Đối với nghiên cứu sự tái sinh DNA thì những enzyme này quan trọng, nhưng với công nghệ gene cho đến nay chưa có ứng dụng thực sự nào III Enzym hạn chế: Restriction endonuclease Khi tạo dòng điều cần thiết là cắt các phân tử DNA chính xác và luôn luôn cùng cách Vector phải... chuyển chậm nhất đến điện cực dương Nếu có nhiều đoạn DNA có độ lớn khác nhau (ví dụ sau phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế thành công) , thì xuất hiện trong gel rất nhiều vạch Vậy làm thế nào để biết được độ lớn của các vạch? Mối quan hệ toán học giữa vận tốc di chuyển và khối lượng phân tử được biểu diễn theo công thức sau: D = a - b (log M) Ở đây D là khoảng cách di chuyển của DNA, M là khối lượng phân... hoặc RNA khuôn mẫu (template) (Hình 1.10a) Phần lớn các polymerase chỉ hoạt động khi trong khuôn có một đoạn sợi kép, đoạn này được gọi là primer (mồi) bắt đầu cho phản ứng tổng hợp Có ba loại DNA-polymerase được sử dụng trong công nghệ gene: DNA-polymerase I, được tách ra từ E coli Enzyme này gắn vào một đoạn đơn ngắn là điểm đứt trên 1 sợi DNA trong DNA sợi đôi (nick) của phân tử DNA sợi kép và tổng... ở đây là nối các đoạn DNA có đầu bằng nhưng phản ứng xảy ra rất hiệu quả, vì có thể tạo ra một lượng lớn các oligonucleotide tổng hợp, nghĩa là phản ứng nối được thực hiện ở nồng độ DNA cao a Một linker điển hình b Sử dụng linker Phân tử DNA đầu bằng Linker DNA-ligase Linker gắn vào BamHI Đầu đính (BamHI) Linker được cắt ra 38 Hình 1.26 Linker và sử dụng linker a Cấu trúc của một linker điển hình b... hạn giúp cho việc lựa chọn enzyme phù hợp cho phản ứng cắt mong muốn Để thiết kế bản đồ phải tiến hành cắt phân tử DNA bằng một loạt các enzyme Bằng điện di người ta biết được số lượng và độ lớn của các đoạn được tạo ra khi sử dụng các enzyme cắt riêng lẻ (Hình 1.23) Thêm vào những phát hiện này người ta cần một loạt các cắt đôi, nghĩa là đồng thời sử dụng hai loại enzyme Nếu hai loại enzyme này có cùng . được dùng trong nhiều trong nhiều lĩnh vực khác, như hóa sinh học, vi sinh vật học, sinh học phát triển, sinh học thần kinh, tiến hóa và sinh thái học. Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng. mới, công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới. Trong y học, kỹ thuật DNA tái tổ hợp được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn. kích thích và hocmon từ một cơ thể tồn tại trong tự nhiên. Sự tách chiết một chất từ sinh vật nguyên thuỷ thường đắt và khó khăn, nhưng khi đưa gene tương ứng vào vi khuẩn hoặc sinh vật khác