BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ DỨA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC CHÂU MSSV: 0811110006 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme Bromelain từ vỏ dứa” là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu sử dụng trong khóa luận la trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng. Nội dung khóa luận thực hiện trên cơ sở lý thuyết, kiến thức và co tham khảo thêm một số tài liệu, sách báo và tập chí theo danh mục của khóa luận. Sinh viên thực hiệ n Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu dề tài 2 1.2.1. Mục tiêu tổng quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme 3 2.2. Enzyme protease 4 2.2.1.Giới thiệu sơ lược các enzyme protease 5 2.2.1.1. Protease động vật 5 2.2.1.2 Protease thực vật 5 2.2.1.3. Protease vi sinh vật 6 2.2.2. Ứng dụng enzyme protease 9 2.3. Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 11 2.3.1. Giới thiệu enzyme bromelain 11 2.3.2. Tính chất vật lí của enzyme bromelain 11 2.3.3. Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12 2.3.3.1. Cấu tạo hoá học 12 2.3.3.2. Cấu trúc không gian của bromelain 12 2.3.4. Hoạt tính của enzyme bromelain 13 2.3.4.1. Cơ chế tác động 13 2.3.4.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain 14 2.3.5. Ứng dụng của enzyme Bromelain 15 2.3.5.1. Trong công nghiệp thực phẩm 15 2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 16 2.3.6.1. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước 16 2.3.6.2. Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain ngoài nước 17 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iii CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1. Vật liệu và hóa chất 18 3.1.1. Nguyên liệu 18 3.1.2. Hóa chất 18 3.1.3. Thiết bị 18 3.2. Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain 19 3.2.1. Thuyết minh quy trình 20 3.2.2. khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 96 0 , muối Ammonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 và aceton (CH 3 COCH 3 ) 20 3.2.2.1 Nguyên tắc 20 3.2.2.2. Tủa enzyme bằng cồn 96 0 20 3.2.2.3. Tủa enzyme bằng muối Ammonium sulfate (NH 4 ) 2 SO 4 21 3.2.2.4. Tủa enzyme bằng aceton (CH 3 COCH 3 ) 21 3.2.3. Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme 22 3.2.3.1. Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 22 3.3. Enzyme cố định 28 3.3.1. Định nghĩa enzyme cố định 28 3.3.2. Tính chất ưu và nhược điểm của enzyme cố định 29 3.2.2.1. Ưu điểm 29 3.3.2.2. Nhược điểm 29 3.3.3. Một số phương pháp cố định enzyme 30 3.3.3.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) 30 3.3.3.2. Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption) 30 3.3.3.4. Phương pháp khâu mạch (cross – linking) 32 3.3.4. Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 33 3.3.4.1. Đặc điểm, tính chất của Natrialginate 33 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iv 3.3.4.2. Tạo dung dịch Natrialginate 3% 33 3.3.4.3. Tiến hành cố định 33 3.3.4.4. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định 33 3.3.5. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hóa đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate 34 3.3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH 34 3.3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 34 3.3.5.3. Khảo sát độ bền nhiệt 35 3.3.5.4. Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate .35 3.3.6. Tinh sạch enzyme bromelain bằng sắc ký lọc gel 35 3.3.6.1. Nguyên tắc 36 3.3.6.2. Thiết bị và hóa chất 36 3.3.6.3. Các bước tiến hành 36 3.3.6.4. Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme Bromelain và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 38 3.3.7. Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 39 3.3.7.1. Nguyên tắc 39 3.3.7.2. Thiết bị và hóa chất 39 3.3.7.3. Phương pháp 41 3.3.7.4. Xác định trọng lượng phân tử của enzyme Bromelain 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1. Kết luận 44 4.2. Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11 Bảng 2.2. Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản 15 Bảng 3.1. Tỷ lệ bằng cồn 96 o đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 20 Bảng 3.2. Nồng độ tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 21 Bảng 3.3. Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa 22 Bảng 3.4. Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin 24 Bảng 3.5. Bảng số liệu dựng đường chuẩn tyrosine 26 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc gian của enzyme protease 4 Hình 2.2. Nguồn enzyme protease từ thực vật 6 Hình 2.3. Vi khuẩn Clostridium 7 Hình 2.4. Vi khuẩn Bacillus 7 Hình 2.5. Nấm mốc 8 Hình 2.6. Xạ khuẩn 8 Hình 3.1. Thiết bị lọc gel áp suất thấp 35 Hình 3.2. Loại muối trước khi chạy sắc ký 38 Tìm hi ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Hầu như mọi phản ứng hóa học trong cơ thể sống đều cần phải có vai trò xúc tác của enzyme – chất xúc tác sinh học. Chính vì vậy, những nghiên cứu về enzyme đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học ở các lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm ra được những công dụng khác nhau của mỗi enzyme. Nghiên cứu về công nghệ enzyme đã được tiến hành bởi nhiều tác giả như sử dụng phủ tạng của lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase. Đã có những thử nghiệm công nghệ như sản xuất amino acid từ nhộng tằm bằng protease, bột protein thịt bằng enzyme bromelain từ vỏ dứa…. Nghiên cứu enzyme còn có ý nghĩa thực tiễn rất quan trọng, đối với một số bệnh, đặc biệ t là bệnh mang tính di truyền, có thể do thiếu hay mất hẳn một hoặc số enzyme trong các mô, các điều kiện không bình thường cũng có thể xuất hiện do hoạt tính dư thừa của một số enzyme đặc hiệu. Do đó xác định hoạt tính của một số enzyme trong huyết tương, hồng cầu hoặc trong các mô là rất quan trọng trong việc chẩn đoán bệnh. Enzyme đã trở thành các công cụ thực tế quan trọng không những trong y học mà cả trong công nghệ hóa học, trong chế biến thực phẩm…Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nghiên liệu rất phong phú ( dứa, đu đủ,… ). Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ sử dụng một phần của quả dứa, phần còn lại là phụ phẩm. Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ cây dứa. Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao. Từ những lợi ích của enzyme bromelain mang lại, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học K ỹ Thuật Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tôi xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa”. Tìm hi ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 2 1.2. Mục tiêu dề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa. Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể Thu nhận dịch enzyme bromelain từ vỏ dứa. Khảo sát các tác nhân tủa enzyme bằng cồn 96 0 , muối Ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) và aceton ( CH 3 COCH 3 ). Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate. Tinh sạch enzyme bromelain. Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di. Tìm hi ểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu sơ luợc về enzyme Enzyme là các chất xúc tác của hệ thống sinh học. Chúng có khả năng xúc tác đặc biệt, thường là mạnh hơn nhiều so với các chất xúc tác tổng hợp. Tác dụng xúc tác của chúng mang tính đặc hiệu đối với cơ chất, làm tăng đáng kể tốc độ các phản ứng hóa học xảy ra trong môi trường nước trong các điều kiện nhiệt độ và pH thích hợ p. Enzyme là một trong các chìa khóa để hiểu biết quá trình hoạt động sống của tế bào. Hoạt động trong những trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định trong các con đường trao đổi chất mà nhờ đó các chất dinh dưỡng bị phân hủy, năng lượng hóa học được lưu dữ và biến đổi, các đại phân tử sinh học được tạo ra từ các chất tiền thân đơ n giản. Một số enzyme tham gia trong quá trình trao đổi chất là những enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm đối với các tín hiệu trao đổi chất khác nhau bằng cách thay đổi hoạt tính xúc tác của chúng một cách thích hợp. Thông qua hoạt động của enzyme điều hòa các hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với nhau để tạo ra mối quan hệ hài hòa giữa các hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc duy trì sự sống. Enzyme có trong mọi c ơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào. Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học ( biocatalisateur ) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do c ần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (37 0 C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…). Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu. Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất. [...]... Sử dụng nhiều enzyme protease để sản xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa, nấu cao động vật, chữa bệnh nghẽn mạch máu, tiêu viêm vết thương SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 10 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ... Cho enzyme vào lọ nhỏ, bảo quản ở nhiệt độ 50C 3.2.2.4 Tủa enzyme bằng aceton (CH3COCH3) Cho dịch lọc vỏ dứa tủa bằng aceton đã được làm lạnh trước theo các tỷ lệ khác nhau SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 21 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Bảng 3.3 Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ vỏ dứa Dịch enzyme từ vỏ( ml) 40 40 40 40 40 40 Aceton lạnh (ml) 40 80 120 160 200 240 Dịch enzyme. . .Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản: − Nguồn động vật − Nguồn thực vật − Nguồn vi sinh. .. hoạt tính enzyme bromelain tính hoạt tính riêng enzyme bromelain HTR = Số đơn vị hoạt tính/ mg protein enzyme (ml/mg) SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 27 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 3.3 Enzyme cố định 3.3.1 Định nghĩa enzyme cố định Enzyme cố định ( hay enzyme không tan) là enzyme có sự tham gia hoặt động trong một không gian bị giới hạn Sự giới hạn hoạt động vốn linh hoặt của enzyme. .. khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ ( Viện Hóa học, Viện Khoa học - công nghệ VN ) năm 2006 Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ 2.3.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 2.3.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain trong nước Ở nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công. .. Enzyme Bromelain Vỏ dứa Nghiền Lọc Dịch lọc Li tâm Thu dịch Ammonium sulfate Tuả Ly tâm Enzyme thô Chạy sắc ký Enzyme SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Cồn 960 19 Aceton Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 3.2.1 Thuyết minh quy trình Vỏ dứa sau khi thu nhận từ các cơ sở đưa đươc về phòng thí nghiệm Tại đây, vỏ dứa được xay hoặc nghiền nát Sau đó, đem đi lọc thu được dịch lọc và mang dịch lọc này... sử dụng làm đông tụ sữa truyền thống Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế Gần SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 15 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa đây sử dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain vỏ dứa đang được quan tâm vào mục đích này 2.3.5.2 Trong y dược học Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư,... protein Những ứng dụng khác của protease thực vật này là công nghệ làm mềm thịt và trong mục tiêu hóa Ficin thu được từ nhựa cây cọ ( Ficus carica) Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 5 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Hình 2.2 Nguồn enzyme protease từ thực vật 2.2.1.3 Protease vi sinh vật Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc, xạ khuẩn…gồm... của enzyme này Một số công trình nghiên cứu về enzyme bromelain như: SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 16 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Lê Thị Thanh Mai ( 1997 ) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelain. .. phân tử bromelain thân còn có sự hiện diện của các ion Zn2+ với hàm lượng 2 mg/g enzyme có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 12 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 2.3.4 Hoạt tính của enzyme bromelain Một số nghiên cứu cho thấy bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelain . Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ NGỌC CHÂU MSSV: 0811110006 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu i LỜI. luận. Sinh viên thực hiệ n Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii MỤC LỤC. quát 2 1.2.2. Mục tiêu cụ thể 2 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 3 2.1. Giới thi u sơ luợc về enzyme 3 2.2. Enzyme protease 4 2.2.1.Giới thi u sơ lược các enzyme protease 5 2.2.1.1. Protease động vật 5