Đang tải... (xem toàn văn)
Thu nhận và tinh sạch papain trong đu đủ
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN Thu nhận và tinh sạch Enzyme papain từ quả đu đủ Giáo Viên Hướng dẫn: Th.S Lê Thanh Hải Sinh viên thực hiện: Huỳnh Lượm Phạm Thị Minh Quách Lê Minh Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Chung Thuận Nguyên TP. HCM, Tháng 10 Năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG CAO ĐẲNG KINH TẾ - CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN Thu nhận và tinh sạch Enzyme papain từ quả đu đủ Giáo Viên Hướng dẫn: Th.S Lê Thanh Hải Lớp: C 6 SH 1 Sinh viên thực hiện: Huỳnh Lượm Phạm Thị Minh Quách Lê Minh Ngành: Công Nghệ Thực Phẩm Chung Thuận Nguyên Page 2 TP. HCM, Tháng 10 Năm 2012 LỜI CẢM ƠN Chúng tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Cao Đẳng Kinh tế - Công nghệ TP.Hồ Chí Minh và các thầy cô đã tận tình chỉ dạy và truyền đạt những kiến thức bổ ích để chúng tôi có được đầy đủ kiến thức để hoàn thành tốt bài tiểu luận này. Và cũng xin chân thành cảm ơn cô Lê Thanh Hải giáo viên giảng dạy bộ môn công nghệ protein- enzyme đã truyền đạt kiến thức và giúp chúng em hoàn thành bài tiểu luận này. Vô cùng biết ơn người thân và bạn bè đã hỗ trợ giúp chúng tôi hoàn thành tốt bài tiểu luận này. Trong quá trình thực hiện làm bài tiểu luận sẽ không tránh khỏi thiếu sót. Kính xin quý thầy cô và bạn bè đóng góp ý kiến để bài tiểu luận được hoàn chỉnh hơn. Page 3 MỤC LỤC PHẦN I : LỜI MỞ ĐẦU 3 PHẦN II : GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 4 2.1. Giới thiệu về cây đu đủ 4 2.1.1. Giới thiệu 4 2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ 5 2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 5 2.2. Giới thiệu về enzyme papain 5 2.2.1. Cysteine protease 5 2.2.2. Nguồn gốc 5 2.2.3. Tính chất của papain 5 2.2.3.1. Tính chất vật lý 6 2.2.3.2. Tính chất hóa học 7 2.2.3.2.1. Cấu tạo hóa học 7 2.2.3.2.2. Cấu trúc không gian 8 2.2.3.2.3. Cấu trúc tâm hoạt động của papain 9 2.2.3.2.4. Phản ứng của papain 11 2.2.3.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của papain 13 PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 14 3.1. Phương pháp thu nhận papain 14 3.1.1. Thu nhận nhựa đu đủ 14 3.1.2. Thu nhận papain 14 3.2. Phương pháp tinh sạch papain 15 3.2.1. Điện di 15 3.2.2. Lọc qua Sephadex G-75 15 PHẦN IV : ỨNG DỤNG ENZYM PAPAIN THỦY PHÂN BÁNH DẦU ĐẬU PHỘNG 17 4.1. Ứng dụng của enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng 17 4.1.1. Sơ đồ thực hiện phản ứng thủy phân 17 4.1.1.1. Nguyên lý chung: 17 4.1.1.2. Thuyết minh quy trình chung: 18 4.1.2. Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân 18 4.1.3. Tính chất của sản phẩm sau thủy phân 19 4.1.4. Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành 19 Page 4 4.1.5. Phương pháp xác định hoạt tính 20 4.1.5.1. Cơ chất: 20 4.1.5.2. Điều kiện: 20 4.1.5.3. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme: 20 4.1.5.3.1. Khái quát 20 4.1.5.3.2. Phương pháp xác định hoạt tính của papain 21 4.2. Một số ứng dụng của enzyme papain 25 4.2.1. Trong y học 25 4.2.2. Trong công nghiệp thực phẩm: 25 4.2.3. Trong các ngành công nghiệp khác: 26 PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 28 5.1. Kết luận 5.2. Kiến nghị DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU TÀI LIỆU THAM KHẢO PHẦN I : LỜI MỞ ĐẦU Page 5 Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase. Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là một loại men phân giải protein tồn tại trong đu đủ. Enzym papain rất tốt cho hệ tiêu hóa, giúp tiêu hóa các thức ăn giàu protein một cách dễ dàng hơn. Nó có thể giúp phân giải và loại bỏ những lớp da chết trên bề mặt cơ thể. Papain có tác dụng tiêu hóa protid, biến đổi các chất có albumin thành pepton, có tác dụng trên mỡ, trên các hydrat carbon trong môi trường hơi kiềm hay trung tính. Ở nhiệt độ thường khi cho tiếp xúc papain với lòng trắng trứng thì lòng trắng trứng bị mất tính sánh sền sệt. Trung bình một trái đu đủ cho được 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm. Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học , các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên. Với những lợi ích và giá trị mà enzyme papain đem lại , nó được ứng dụng rộng rãi và thường được dùng trong lĩnh vực chế biến mỹ phẩm. Ngoài ra, Papain rất cần cho nhiều lĩnh vực công nghiệp: dược phẩm, hóa chất, kỹ nghệ tơ sợi dệt may, thuộc da, thực phẩm Vì tầm quan trọng của enzyme papain trong nhiều lĩnh vực nên nhóm chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng enzyme papain trong thủy phân bánh dầu đậu phộng nhằm tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ứng dụng trong chăn nuôi. PHẦN II : GIỚI THIỆU VỀ ENZYME PAPAIN 2.1. Giới thiệu về cây đu đủ 2.1.1. Giới thiệu Page 6 Hình: Các loại hoa và trái đu đủ Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế, phiên mộc, cà lào, phiên qua, phan qua thụ, lô hong phlê (Campuchia), mắc hung (Lào), má hống (Thái). Đu đủ thường là cây đồng chu, nhưng đu đủ có thể xếp thành 3 loại trên phương diện giới tính: cây đực, cây lưỡng tính và cây cái. Vài cây đu đủ cũng có thể trổ cả ba loại hoa nói trên. Ngoài ra cũng có cây ra hoa không hẳn hoàn toàn đực, cái hay lưỡng tính mà lại pha lẫn nhiều ít đặc tính của ba loại hoa. Khuynh hướng thay đổi giới tính phần lớn do thời tiết gây ra tỉ như khô hạn và thay đổi nhiệt độ. 2.1.2. Phân bố sinh thái của cây đu đủ. Chi Carica L. có nguồn gốc ở vùng nhiệt đới châu Mỹ. Ở vùng núi cao (1500-3000m), từ Panama đến Bolivia, cây đu đủ trồng hiện nay rất có thể là giống lai tự nhiên của loài C. peltata Hook & Ann. Vào khoảng thế kỷ 16, người Tây Ban Nha đã đưa đu đủ vào trồng ở vùng Caribê và một số nước Đông Nam Á. Từ các địa điểm này, cây tiếp tục được trồng rộng rãi ở Ấn Độ, Srilanca, châu Đại Dương và châu Phi. 2.1.3. Hoạt tính sinh học và công dụng của một số chất có trong cây đu đủ 1. Nhựa đu đủ có thể gây viêm da. 2. Ở Trung Mỹ, trong dân gian, người ta sử dụng đu đủ để điều trị bệnh lỵamip (Entamoeba histolytica), một loại ký sinh trùng gây tiêu chảy dạng lỵ và biến chứng áp- xe gan. 3. Ở Samoa, người dân dùng phần dưới vỏ thân cây đu đủ để chữa chứng nhức răng. 4. Nhựa đu đủ có chứa papain, là một trong hai loại men tiêu hủy protein (proteolytic enzymes) có tác dụng làm mềm thịt bắp. Chính do tác dụng này, khi dùng đu đủ hầm chung với thịt, thịt sẽ mềm hơn. Người dân vùng Ca-ri-bê, Trung Mỹ cho biết họ có thể dùng khẩu phần với số lượng lớn thịt cá nhưng vẫn không hề gì nếu ăn đu đủ xanh sau đó. 5. Phần cơm đu đủ là thành phần chính của các loại mỹ phẩm như kem nền (mặt), kem đánh răng, xà bông gội đầu. 6. Các ứng dụng quan trọng trong y học của nhựa đu đủ là chiết xuất papain để dùng trong phẫu thuật cột sống (là một loại "dao phẫu thuật tự nhiên" để mở đĩa đệm). Nghiên cứu cho thấy chiết xuất papain có hoạt tính kháng sinh (antibioticactivity) với tác dụng chống vi khuẩn gram dương (gram-positive Page 7 bacteria). Nó còn được dùng để điều trị lở loét, làm tiêu giả mạc trong bệnh bạch hầu, chống kết dính sau phẫu thuật, làm thuốc giúp tiêu hóa. Trong công nghiệp, papain được dùng để tinh chế bia; xử lý len và lụa trước khi nhuộm; là phụ gia trong công nghệ chế biến cao su; khi tinh chế dầu gan cá tuna, người ta tiêm papain vào gan trước khi chiết xuất, làm cho thành phẩm giàu Vitamin A và D hơn. Khoảng 1,500 quả đu đủ xanh cỡ vừa cho được khoảng 650g papain. 2.2. Giới thiệu về enzyme papain 2.2.1. Cysteine protease - Cysteine proteases (EC.3.4.22) là nhóm các protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 21-30kDa, các protein này có khả năng xúc tác để thủy phân các loại liên kết: peptide, amide, esterthiol. Đây cũng là những enzyme có nhóm –SH trong tâm hoạt động. - Người ta đã tìm thấy hơn 20 họ cysteine proteases (Barrett, 1994) và nhiều enzyme trong số này (papain, bromelain, ficain, animal cathepsins) được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp. - Có 2 loại cysteine proteases là exopeptidase ( cathepsin X, carboxypeptidase B) và endopeptidases ( bromelain, ficain, cathepsin…). Exopeptidase thủy phân liên kết peptide ở đầu N hoặc đầu C tự do trong khi đó endopepetidase cắt đứt các liên kết peptide ở giữa chuỗi polypeptide. 2.2.2. Nguồn gốc Papain (EC 3.4.22.3) là cysteine protease được biết đến nhiều nhất và được phân lập lần đầu tiên vào năm 1879 từ nhựa trái đu đủ (Carica papaya). Đây cũng là enzyme đầu tiên được xác định cấu trúc tinh thể (Drenth et al., 1968; Kamphuis et al., 1894). Trong nhựa đu đủ ngoài enzyme papain còn có các loại protease khác như chymopapain, caricain, glycyl endopeptidase và một số enzyme khác (Baines and Brock-lehurst, 1979). Nhựa đu đủ có hàm lượng và hoạt tính papain cao nhất tập trung ở vùng có nắng nóng và độ ẩm ổn định quanh năm. 2.2.3. Tính chất của papain 2.2.3.1. Tính chất vật lý Bảng 2.1: Tính chất vật lý của papain Tính chất vật lý Giá trị Page 8 Điểm đẳng điện pI = 8.75 Hằng số sa lắng S20 2.42 ± 0.04 Hằng số phân tán D20 (10-7giây.cm2) 10.27 ± 0.13 Phân tử lượng 20,700 Độ triền quang [α]D -66.7 0 Độ xoắn 17% Vòng hiệu ứng cotton 290nm Thể tích riêng phần V(mL/g) 0.724 Trị số ma sát f/fo 1.16 Bột màu vàng hay màu nâu nhạt, tùy thuộc phương pháp sấy, không tan trong hầu hết các chất hữu cơ nhưng tan một phần trong H2O hay glycerine. Bền nhiệt. 2.2.3.2. Tính chất hóa học 2.2.3.2.1. Cấu tạo hóa học: Papain là 1 endoprotease có chứa 16% N và 1.2% S. Papain là 1 protease thiol, theo nghiên cứu của R. L. Hill và E. L Smith, papain là 1 chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọng lượng phân tử là 20.900 Dalton. Bảng 2.2: Thành phần hóa học: Amino acid Số lượng Amino acid Số lượng Alanine 13 Lyeine 9 Arginine 10 Proline 4 Aspartic acid 17 Serine 9 Half – Cysteine 6 Threonie 11 Glutamid acid 17 Tryptophan 7 Glycine 23 Tyrosine 5 Histidine 2 Valine 17 Isoleucine 10 Methionine 15 Page 9 Leucine 10 0 Tổng cộng: 185 Theo kết quả phân tích bằng tia X, phân tử papain được cấu tạo bởi 212 acid amin trong đó không có chứa methionine. Phân tử lượng khoảng 23,350 Da, phân tử là một mạch polypeptide với đầu N là isoleucine, đầu C là asparagine, có 6 gốc cysteine tạo thành 3 cầu disulfur ở các vị trí 22-63, 56-95, 153-200 không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính bền vững của cấu trúc và một nhóm –SH tự do ở vị trí 25. 2.2.3.2.2. Cấu trúc không gian Phân tử papain có dạng hình cầu với kích thước 36x48x36Ao và mạch chính bị gấp thành hai phần riêng biệt bởi một khe. Trung tâm hoạt động nằm tại bề mặt của khe này, nhóm -SH hoạt động của cysteine 25 nằm bên trái khe và nhóm histidine 159 nằm bên phải khe. Phần xoắn chiếm 20% toàn bộ các amino acid có trong phân tử. Hình: Cấu trúc bậc 3 của Papain Hoạt tính của papain dựa trên hai tâm hoạt động là Cys25 và His159. Khoảng pH hoạt động của papain khá rộng (3.5 – 8.0) tùy thuộc vào cơ chất. Khi cơ chất là casein thì hoạt tính tối ưu của papain trong vùng pH từ 5.7 – 7.0 và nhiệt độ thích hợp là 50 – 57 0 C. 2.2.3.2.3. Cấu trúc tâm hoạt động của papain Page 10 [...]... 400C Papain 3.1.1 Thu nhận nhựa đu đủ: Nhựa cây đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ nhựa là hỗn hợp enzyme chứa các protease sau: papain, chymopapain A( gốc amino acid cuối là glutamic acid), chymopapain B(gốc amino aicd là tyrosine), proteinase III, proteinase IV, thilprotesase, trong đó papain chiếm tới 95% 3.1.2 Thu nhận papain: Chuẩn bị: Do trong nhựa đu đủ. .. hủy hoàn toàn Điều đáng lưu ý là sau khi đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể thì papain có độ bền nhiệt thấp hơn papain ở trong nhựa, do trong nhựa còn chứa các protein khác có tác dụng bảo vệ papain Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 40C bền trong nhiều tháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tính trong nhiều tháng Trong khi đó hầu hết các enzyme mất hoạt tính mỗi... phân 4.1.4 Chỉ tiêu theo dõi papain thủy phân bánh dầu đậu nành Điều chế enzyme papain để thủy phân protein trong bánh dầu đậu phộng với các nội dung sau: 1 Thu nhận enzyme papain từ nhựa trái đu đủ - Khảo sát các điều kiện thu nhận enzyme papain Page 19 - Định lượng và hoạt tính của enzyme papain sau mỗi giai đoạn tinh chế - Khảo sát sự biến đổi lượng và hoạt tính enzyme papain theo thời gian - Khảo... papain: Chuẩn bị: Do trong nhựa đu đủ ngoài papain, chymopapain còn có 1 số enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo và các tạp chất khác để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả thì có quy trình hòa tan nhựa đu đủ nhằm loại bỏ tạp chất cách làm như sau: Page 15 Trộn 180g nhựa đu đủ với 100g cetile và 150g cát sạch, nghiền kĩ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300mL... trước khi tái kết tinh có thể hòa tan tinh thể papain trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 và đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc Sấy chân không Sấy chân không ở nhiệt độ 400C thu nhận papain tinh chế 3.2 Phương pháp tinh sạch papain 3.2.1 Điện di: Sử dụng gel polyacrylamide 12%, dung dịch đệm là beta-alanine 34mM, pH = 4.3 và cường độ dòng... 70% và không thay đổi độ nhớt trong dung môi methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình của papain Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochloride 6M làm biến đổi bất thu n nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của papain PHẦN III : PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN VÀ TINH SẠCH PAPAIN 3.1 Phương pháp thu. .. có trong nhựa đu đủ Bất hoạt: - Papain bị kìm hãm ( ức chế bất thu n nghịch) bởi các chất oxy hóa như: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cysteine và các hợp chất disufur khác Các chất này phản ứng với nhóm –SH ở tring tâm hoạt động của papain làm phá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó - Papain bị bất hoạt thu n nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độ thấp papain tác dụng với chloromethul cetone của Phe và. .. 2500 vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dich lỏng Kết tinh Hòa tan tủa với 400mL dung dịch cysteine 0.002M ở nhiệt độ phòng được 1 dung dịch huyền phù có pH = 6.5 Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thành, duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500 vòng/ phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể Tái kết tinh: Hòa tan tinh thể thu được ở bước trên trong nước cất nhiệt độ phòng... chất tốt hơn - Papain còn được dùng để thủy phân protein và ngăn ngừa vi khuẩn gây thối, do nhiệt độ tối ưu của nó là 700C - Papain được dùng để làm mềm thịt, dùng để thủy phân gan cá ngừ làm thu c bổ Papain còn được dùng trong sản xuất bia vì nó giúp tiêu hóa các protein còn hòa tan trong bia 4.2.3 Trong các ngành công nghiệp khác: - Papain được dùng làm mềm da trong ngành công nghiệp thu c da, dùng... them các acid amin có trong enzyme vào trong bánh dầu, để bổ sung vào thức ăn cho gia súc và cho người 4.1.2 Các thay đổi hóa sinh trong quá trình thủy phân: - Những nghiên cứu về sự liên kết enzyme và cơ chất đề ra giả thuyết: phần lớn các enzyme trở nên hấp thụ với bề mặt ngoài của protein đậu phộng theo một tiến trình tương đối nhanh, sau đó sự khuếch tán những phân tử enzyme vào trong những thành phần . ENZYME PAPAIN 2.1. Giới thiệu về cây đu đủ 2.1.1. Giới thiệu Page 6 Hình: Các loại hoa và trái đu đủ Tên khoa học: Carica papaya L., thuộc họ đu đủ - Caricac Cây đu đủ còn được gọi thù đủ ở Huế,. : LỜI MỞ ĐẦU Page 5 Trong mủ đu đủ có ba enzyme chính bao gồm: papain, chymopapain và peptidase. Papain là một enzym được lấy ra từ mủ của các quả đu đủ xanh. Ngoài ra, papain còn là một loại. đủ cho được 12g mủ, từ 4kg mủ đu đủ tươi cho 1kg papain khô và trồng đu đủ để khai thác lấy mủ chỉ hiệu quả trong vòng 3 - 4 năm tuy vòng đời của một cây đu đủ khoảng 20 năm. Ngày nay, cùng