Đang tải... (xem toàn văn)
Luận văn : Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định, tìm hiểu đặc tính và điều khiển các yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp glucosinolate
- i - LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian gần 5 năm học ở trường Đại học Bách Khoa TP. Hồ Chí Minh, ngành Công nghệ sinh học, em cùng các bạn lớp HC06BSH đã được trang bị vốn kiến thức chuyên ngành quý báu, là hành trang vững chắc để bước vào đời. Hôm nay, khi đã hoàn tất trang cuối cùng của Luận văn tốt nghiệp, em cảm thấy vô cùng biết ơn các thầy cô của trường Đại học Bách Khoa, đặc biệt là các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học – Khoa Kỹ thuật hóa học, đã dìu dắt em trong suốt quãng đường đại học. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến Cô Lê Thị Thủy Tiên, người đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện Luận văn tốt nghiệp. Cô đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ em rất nhiều trong suốt quá trình thực hiện đề tài luận văn. Em cũng xin cảm ơn các thầy cô trong bộ môn đã tận tình giúp đỡ mỗi khi em gặp khó khăn trong quá trình thí nghiệm. Cảm ơn các bạn lớp HC06BSH, các anh chị cao học, mọi người đã luôn bên cạnh tôi và góp thêm động lực giúp tôi phấn đấu nhiều hơn nữa. Con cũng xin cảm ơn bố mẹ, gia đình là nơi nương tựa và là nguồn động viên tinh thần lớn lao, giúp con hoàn thành tốt quá trình học tập và vững tin bước vào đời. Mặc dù đã cố gắng hết sức nhưng chắc chắn luận văn không tránh khỏi những thiếu sót, mong Quý thầy cô chỉ bảo và các bạn góp ý để luận văn được hoàn thiện hơn nữa. Xin cảm ơn ./. TP. Hồ Chí Minh, ngày 30 tháng 12 năm 2010 SVTH: VŨ THỊ NGỌC AN - ii - TÓM TẮT LUẬN VĂN Tử diệp, trụ hạ diệp và cuống tử diệp của cây bông cải xanh in vitro 7 ngày tuổi được đưa vào môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l, kinetin 1.0 mg/l và NAA nồng độ thay đổi (1.0, 1.5, 2.0 mg/l) để kích thích tạo rễ bất định. Kết quả cho thấy tử diệp và trụ hạ diệp tạo rễ bất định tốt nhất trên môi trường chứa NAA 1.5 mg/l với tỉ lệ phát sinh rễ lần lượt là 53.33% và 60.00%, mật độ rễ/mẫu cấy tương ứng là 7.25 và 7.44 rễ/mẫu. Cuống tử diệp có tỉ lệ phát sinh rễ bất định cao 63.33% trên môi trường có NAA 1.0 mg/l, tuy nhiên rễ phát sinh không nhiều (3.8 rễ/mẫu) và có nhiều mẫu tạo chồi. Rễ bất định từ tử diệp và trụ hạ diệp tiếp tục được cấy chuyền nhằm tăng sinh trước khi chuyển sang môi trường lỏng có thành phần tương tự môi trường tạo rễ. Trên môi trường lỏng, sau 4 tuần nuôi cấy, chỉ số tăng trưởng của rễ từ tử diệp và trụ hạ diệp là 1.021 0.104 và 1.318 0.110. Lượng glucosinolate tích lũy trong rễ qua 4 tuần theo dõi đạt cao nhất ở tuần thứ 3 (rễ từ tử diệp đạt 0.488 0.068 mol/g và từ trụ hạ diệp đạt 0.430 0.022 mol/g) và không thay đổi đáng kể ở tuần thứ 4. Khi bổ sung acid amin (methionine, phenylalanine và tyrosine) vào môi trường lỏng với nồng độ 10, 20, 30 mg/l, kết quả ở tất cả các nghiệm thức đều có sự gia tăng hàm lượng glucosinolate trong rễ so với mẫu đối chứng và cao nhất ở nồng độ 30 mg/l. Ở rễ từ tử diệp, hàm lượng glucosinolate tích lũy khi bổ sung methionine, phenylalanine, tyrosine nồng độ 30 mg/l lần lượt là 0.770 0.051, 0.790 0.075, 0.757 0.036 mol/g và rễ từ trụ hạ diệp là 0.844 0.069, 0.649 0.070, 0.634 0.050 mol/g. - iii - DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AITC Allyl isothiocyanate BAP (BA) 6-benzylaminopurine (benzyladenine) BITC Benzyl isothiocyanate CĐHSTTV Chất điều hòa sinh trưởng thực vật CYP Cytochrome DNA deoxyribonucleic acid GC Gas Chromatography GLS Glucosinolate GTS Glutathione S-transferase HCTC Hợp chất thứ cấp I3C Indole-3-carbinol IAA 3-indol acetic acid BDT 1,3-benzodithiole-2-thione IBA indole-3-butyric acid ITC Isothiocyanate NAA 1-naphthalene acetic acid PEITC Phenethyl isothiocyanate SFN Sulforaphane UGT UDP-glucuronosyl transferase - iv - MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC ẢNH ix CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Cây bông cải xanh Brassica oleracea var. italica 3 2.1.1. Giới thiệu – vị trí phân loại 3 2.1.2. Nguồn gốc và phân bố 4 2.1.3. Đặc điểm hình thái 5 2.1.4. Thành phần hóa học bông cải xanh 6 2.1.5. Công dụng của bông cải xanh 8 2.1.6. Nhân giống bông cải xanh nhờ phương pháp nuôi cấy mô 8 2.2. Glucosinolate 10 2.2.1. Giới thiệu và cấu trúc hóa học 10 2.2.2. Phân loại 11 2.2.3. Sinh tổng hợp glucosinolate 11 2.2.4. Thủy phân glucosinolate 14 - v - 2.2.5. Vai trò của glucosinolate thông qua các isothiocyanate 15 2.2.6. Các phương pháp trích ly và định lượng glucosinolate 17 2.3. Nuôi cấy rễ bất định thu nhận hợp chất thứ cấp (HCTC) 18 2.3.1. Rễ bất định 18 2.3.2. Nuôi cấy rễ bất định thu nhận HCTC 19 2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ bất định in vitro 22 2.3.4. Phương pháp làm tăng sản lượng HCTC trong nuôi cấy rễ bất định 23 CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 3.1. Vật liệu 25 3.2. Phương pháp nghiên cứu 26 3.2.1. Giai đoạn 1: Tạo cây mầm in vitro 27 3.2.2. Giai đoạn 2: Tạo rễ bất định 28 3.2.3. Giai đoạn 3: Cảm ứng sinh tổng hợp glucosinolate 29 3.2.4. Giai đoạn 4: Trích ly và định lượng glucosinolate 31 3.2.5. Phương pháp xử lý kết quả 34 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 4.1. Kết quả 35 4.1.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và nguồn gốc mẫu cấy đến khả năng tạo rễ bất định 35 4.1.2. Thí nghiệm 2: khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ 38 4.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của các acid amin lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất định 42 4.2. Thảo luận 48 - vi - 4.2.1. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và nguồn gốc mẫu cấy đến khả năng tạo rễ bất định 48 4.2.2. Sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ 49 4.2.3. Ảnh hưởng của các acid amin lên sự tích lũy glucosinolate của rễ bất định 50 CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51 5.1. Kết luận 51 5.2. Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 56 - vii - DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. 10 nước trồng súp lơ và bông cải xanh nhiều nhất trên thế giới 4 Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng và khoáng chất trong bông cải xanh tươi 6 Bảng 2.3. Hàm lượng glucosinolate ở 1 số loài Brassica 11 Bảng 2.4. Cấu trúc và phân loại glucosinolate 12 Bảng 2.5: Nguồn thực phẩm chứa isothiocyanate và tiền chất glucosinolate 15 Bảng 3.1. Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nguồn gốc mẫu cấy và nồng độ các CĐHSTTV lên khả năng phát sinh rễ bất định 29 Bảng 3.2. Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các acid amin lên sự tích lũy glucosinolate ở rễ bất định 30 Bảng 4.1. Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự phát sinh rễ bất định 37 Bảng 4.2. Nồng độ NAA thích hợp cho sự tạo rễ bất định 37 - viii - DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Cấu tạo 3,3’- diindolymethane 7 Hình 2.2. Cấu trúc hóa học của glucosinolate 10 Hình 2.3. Các giai đoạn trong quá trình sinh tổng hợp glucosinolate 13 Hình 2.4. Quá trình thủy phân glucosinolate và cấu trúc một số isothiocyanate 14 Hình 2.5. Cơ chế ngăn chặn ung thư của glucosinolate 16 Hình 2.6. Các loại rễ ở thực vật 19 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình thí nghiệm chung 26 Hình 3.2. Sơ đồ quy trình tạo cây mầm in vitro 27 Hình 3.3. Phản ứng ngưng tụ vòng của isothiocyanate và 1,2-benzendithiol 31 Hình 3.4. Sơ đồ quy trình thủy phân glucosinolate thành isothiocyanate 32 Hình 3.5. Sơ đồ quy trình phản ứng định lượng isothiocyanate 33 Hình 4.1. Đường cong sinh trưởng của rễ qua 4 tuần nuôi cấy trên môi trường lỏng 40 Hình 4.2. Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định từ tử diệp 40 Hình 4.3. Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định từ trụ hạ diệp 41 Hình 4.4. So sánh hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ từ tử diệp và rễ từ trụ hạ diệp qua 4 tuần nuôi cấy 41 Hình 4.5. Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ khi bổ sung methionine 43 Hình 4.6. Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ khi bổ sung phenylalanine 44 Hình 4.7. Hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ khi bổ sung tyrosine 45 Hình 4.8. So sánh ảnh hưởng của các acid amin lên rễ bất định từ tử diệp 46 Hình 4.9. So sánh ảnh hưởng của các acid amin lên rễ bất định từ trụ hạ diệp …………. 47 - ix - DANH MỤC ẢNH Ảnh 2.1. Cây bông cải xanh 3 Ảnh 2.2. Rễ cây bông cải xanh 5 Ảnh 2.3. Hoa cây bông cải xanh 6 Ảnh 2.4. Trụ hạ diệp trên môi trường MS bổ sung 3 mg/l BA kích thích tạo chồi 9 Ảnh 2.5. Tái sinh chồi từ chồi ngọn 9 Ảnh 2.6. Quy trình nuôi cấy rễ bất định Echinacea purpurea 20 Ảnh 3.1. Hạt giống bông cải xanh Brassica oleracea var italica 25 Ảnh 3.2. Hạt giống củ cải trắng Raphanus sativus 25 Ảnh 3.3. Cây mầm bông cải xanh in vitro 28 Ảnh 4.1. Rễ bất định phát sinh từ mẫu cấy sau 10 ngày nuôi cấy 35 Ảnh 4.2. Rễ bất định phát sinh từ các mẫu cấy khác nhau 36 Ảnh 4.3. Rễ thứ cấp phát sinh từ mẫu cấy sau 1 tuần cấy chuyền 38 Ảnh 4.4. Rễ tăng trưởng trong môi trường lỏng 39 Ảnh 4.5. Rễ bất định trên môi trường lỏng bổ sung acid amin 42 Chƣơng 1: Mở đầu - 1 - CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU Thực vật là nguồn cung cấp rất nhiều loại hợp chất tự nhiên quý giá, được sử dụng trong dược phẩm, hóa học nông nghiệp, ngoài ra còn dùng làm hương vị, hương thơm tự nhiên, thuốc trừ sâu sinh học và phụ gia thực phẩm (Philipson JD., 1990; Hadacek F., 2002). Việc thu nhận các hợp chất này trong tự nhiên gặp nhiều khó khăn và phụ thuộc nhiều yếu tố (thời tiết, thổ nhưỡng …). Hợp chất thứ cấp (HCTC) thường bị giới hạn theo từng loài, chi thực vật, có thể chỉ sinh ra trong một giai đoạn tăng trưởng và phát triển nhất định hoặc theo từng mùa, khi thực vật bị stress hay phụ thuộc vào nguồn dinh dưỡng cung cấp. Chính vì những nguyên nhân đó mà từ những thập niên trước, nhiều nghiên cứu nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận HCTC đã được tiến hành (Rao SR. và cs 2002, Verpoorte R. và cs 2002) . Tuy nhiên, năng suất thu được còn quá thấp, mặc dù đã có nhiều nghiên cứu tối ưu hóa môi trường phát triển và tổng hợp HCTC của tế bào cũng như chọn lựa các dòng tế bào có khả năng sản xuất cao nhất. Nguyên nhân có thể do quá trình sinh tổng hợp HCTC chịu ảnh hưởng bởi một loại mô cụ thể, sự khác biệt của các tế bào về nguồn gốc mô dẫn đến khả năng sản xuất HCTC giảm. Chính vì vậy, nuôi cấy rễ, phôi và chồi được tập trung nghiên cứu như một phương pháp có thể thay thế cho kỹ thuật nuôi cấy tế bào nhằm sản xuất HCTC (Rao và cs, 2002). Rễ bất định được cảm ứng bằng phương pháp nuôi cấy in vitro có khả năng sinh tổng hợp HCTC cao và hoạt tính khá ổn định (Hahn EJ. và cs, 2003; Yu KW. và cs, 2005). Rễ bất định có thể phát triển mạnh trên môi trường bổ sung hormone thực vật và tích lũy lượng lớn các HCTC có giá trị. Ngày nay, việc mở rộng quy mô nuôi cấy rễ bất định trong các thiết bị phản ứng sinh học lớn (bioreactor) cho thấy khả năng sản xuất HCTC trên quy mô công nghiệp là hoàn toàn khả thi (theo Murthy và cs, 2008) [13]. [...]... điều khiển các yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp glucosinolate của bông cải xanh Nội dung đề tài bao gồm: Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng phát sinh rễ bất định Khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ Khảo sát ảnh hưởng của các amino acid lên sự sinh tổng hợp glucosinolate của rễ bất định -2- Chƣơng 2 Tổng quan... 1: Mở đầu Bông cải xanh (Brassica oleracea var italica) được xem như một loại thực phẩm chức năng vì là nguồn cung cấp dồi dào glucosinolate – tiền chất của isothiocyanate, những hợp chất có khả năng chống ung thư mạnh trong các loại thực phẩm Đề tài này được tiến hành nhằm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định, từ đó có thể tìm hiểu đặc tính và điều khiển. .. Yu (2000) nuôi rễ trong bioreactor nhỏ sử dụng môi trường MS và nghiên cứu tác động của nồng độ muối và áp lực thẩm thấu lên sự tăng trưởng và sinh tổng hợp ginsenoside của rễ bất định Jeong và cs (2006) đã nghiên cứu ảnh hưởng của O2, CO2 và ethylene lên sự tăng sinh khối và tích lũy ginsenoside ở rễ bất định nhân sâm và so sánh với khi nuôi cấy - 20 - Chƣơng 2 Tổng quan tài liệu trong điều kiện không... Nghiên cứu cho thấy CO2 và C2H4 làm tăng sinh khối rễ, tuy nhiên chúng lại làm giảm sự tích lũy ginsenoside Mặt khác, nồng độ O2 tăng cao (40%) là nồng độ tối ưu cho sự tăng sinh khối và tích lũy ginsenoside ở rễ Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, lượng ginsenoside tích lũy trong rễ là 12.4 mg/g trọng lượng khô Min và cs (2007) cảm ứng rễ bất định từ củ Scopolia parviflora và nuôi cấy trên môi trường... Sinh tổng hợp HCTC ở thực vật được điều khiển chặt chẽ trong suốt quá trình phát triển và phụ thuộc vào các điều kiện như stress, sự tấn công của vi sinh vật Các chất cảm ứng như methyl jasmonate (MeJA) hay acid salicylic (SA) thường được sử dụng để cảm ứng tổng hợp HCTC ở rễ bất định Acid jasmonic và MeJA làm chậm lại quá trình sinh trưởng của rễ nhưng lại làm tăng hàm lượng ginsenoside tích lũy trong. .. 0.1 mg/l và sucrose 50 mg/l trong bình tam giác/bioreator và thiết lập đường cong sinh trưởng Các thông số như thời gian nuôi cấy, sự thông khí được khảo sát khi nuôi cấy rễ trong bioreactor Ở điều kiện nuôi cấy lý tưởng, hàm lượng scopolamine tích lũy tối ưu là 1.8 mg/g trọng lượng khô và hàm lượng hyoscyamine là 3.3 mg/g Ở loài củ cải Raphanus sativus, Betsui và cs (2004) [4] đã cảm ứng rễ bất định... chùm và rễ bất định Rễ cọc: rễ đầu tiên xuất hiện ở cây con và đâm sâu xuống mặt đất là rễ sơ cấp, từ rễ sơ cấp sẽ xuất hiện những rễ bên gọi là rễ thứ cấp Ở thực vật song tử diệp, rễ sơ cấp chiếm ưu thế so với rễ thứ cấp được gọi là hệ thống rễ cọc Rễ chùm: ở thực vật đơn tử diệp, cây có nhiều rễ nhỏ, không có rễ nào chiếm ưu thế và không đâm sâu xuống đất như rễ cọc gọi là hệ thống rễ chùm Rễ bất. .. quả nhất trong sự kích thích ra rễ Lượng oxi đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh cơ quan từ mẫu cấy Sự thông khí thường xuyên làm tăng sự ra rễ vì vậy sự ra rễ trong môi trường lỏng sẽ tốt hơn Ánh sáng có tác dụng cản sự ra rễ - 22 - Chƣơng 2 Tổng quan tài liệu Ngoài ra, sự tạo rễ bất định còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như loài thực vật, giới tính của chúng, cách đặt mẫu vào môi trường... tiếp) Giai đoạn 2: Nuôi rễ trong môi trường lỏng trong bình tam giác hoặc bioreactor và thiết lập đường cong sinh trưởng (xác định các thành phần môi trường thích hợp nhằm gia tăng sinh khối và tích lũy HCTC) Giai đoạn 3: giai đoạn tích lũy HCTC (bổ sung chất cảm ứng, môi trường hoặc tiền chất) Giai đoạn 4: nuôi cấy rễ trên quy mô lớn trong bioreactor (xác định phương pháp thích hợp để nuôi cấy... dinh dưỡng (theo Murthy và cs, 2008) [14] 2.3.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự tạo rễ bất định in vitro Tuổi và giai đoạn phát triển của cây: sự hình thành rễ từ mô của những cây còn non dễ hơn là từ cây đã trưởng thành Vị trí thu mẫu cấy trên cây: về nguyên tắc các mẫu cấy thu được trên cùng một cơ quan thực vật thì có khả năng tái sinh như nhau nhưng thực tế thì khả năng tái sinh của mỗi mẫu cấy khác . Khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đến khả năng phát sinh rễ bất định. Khảo sát sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ. Khảo sát. tố ảnh hưởng đến hàm lượng glucosinolate tích lũy trong rễ bất định, từ đó có thể tìm hiểu đặc tính và điều khiển các yếu tố tác động đến khả năng sinh tổng hợp glucosinolate của bông cải xanh Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng và nguồn gốc mẫu cấy đến khả năng tạo rễ bất định 48 4.2.2. Sự tăng trưởng của rễ bất định và sự tích lũy glucosinolate trong rễ 49 4.2.3. Ảnh hưởng