BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 BÁO CÁO TỔNG KẾT DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC HỒN THIỆN QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT MÃ SỐ: KC.10.DA17 Chủ nhiệm dự án: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM 6613 26/10/2007 TP.HCM, tháng 09 năm 2007 BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CÔNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 BÁO CÁO TỔNG KẾT DỰ ÁN SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM CẤP NHÀ NƯỚC HỒN THIỆN QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ CHIẾT XUẤT HOẠT CHẤT TỪ CÂY TRINH NỮ HOÀNG CUNG (Crinum latifolium L Amaryllidaceace) ĐỂ SẢN XUẤT VIÊN NANG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÌ ĐẠI LÀNH TÍNH TUYẾN TIỀN LIỆT MÃ SỐ: KC.10.DA17 CHỦ NHIỆM DỰ ÁN: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM CƠ QUAN CHỦ TRÌ: CƠNG TY CỔ PHẦN DƯỢC LIỆU TW2 CƠ QUAN CHỦ QUẢN: BỘ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ THỜI GIAN: 1.2006 - 6.2007 TỔNG KINH PHÍ DỰ ÁN: 4.934,3 triệu đồng KINH PHÍ TỪ NGÂN SÁCH: 1.300 triệu đồng KINH PHÍ THU HỒI: 835 triệu đồng TP.HCM, tháng 09 năm 2007 MỤC LỤC PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN II: TỔNG QUAN 13 Tình hình nghiên cứu ngồi nước Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)… 13 Tính cấp thiết khả thi dự án 17 Mục tiêu dự án 17 Nội dung dự án 18 PHẦN III: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Nguyên liệu… 19 Phương pháp nghiên cứu… 19 PHẦN IV: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU… 22 Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid từ dược liệu Trinh nữ hoàng cung (tươi khô) dùng làm nguyên liệu sản xuất viên nang Trinh nữ hoàng cung (Crila) quy mô cơng nghiệp 22 1.1 Nghiên cứu chiết xuất hoạt chất alcaloid Trinh nữ hoàng cung 23 1.1.1 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid tồn phần từ dược liệu khơ TNHC 23 1.1.2 Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết alcaloid tồn phần từ dược liệu tươi TNHC 25 1.2 Máy móc thiết bị quy trình cơng nghệ chiết xuất 27 1.3 Vệ sinh vô trùng an toàn lao động 30 1.4 Nội dung kiểm tra trình sản xuất 30 1.5 Xử lý dư phẩm trình chiết xuất 30 1.6 Hồ sơ làm việc cần thiết 30 Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm Trinh nữ hoàng cung 31 2.1 Công thức viên nang Crila 31 2.2 Một số kết nghiên cứu bào chế viên nang… 32 2.2.1 Độ ẩm tới hạn độ ẩm cân hạt 32 2.2.2 Dải phân bố cỡ hạt 34 2.2.3 Tính chảy hạt 34 2.2.4 Tính phân tán nước 35 2.3 Khảo sát viên nang Crila 36 2.4 Nghiên cứu theo dõi độ ổn định sản phẩm 37 2.5 Quy trình sản xuất viên nang CRILA 39 2.5.1 Cách tiến hành 39 2.5.2 Máy móc thiết bị chủ yếu 39 2.5.3 Quy trình công nghệ sản xuất viên nang Crila 40 2.5.4 Vệ sinh vô trùng an toàn lao động 41 2.5.5 Nội dung kiểm tra trình sản xuất 41 2.5.6 Dư phẩm phế phẩm 42 2.6 Hồ sơ làm việc cần thiết 42 Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm 43 3.1 Nghiên cứu định tính định lượng alcaloid crinamidin nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm phương pháp HPLC… 43 3.2 Xây dựng tiêu chuẩn sở TNHC, cao khô TNHC viên nang Crila 52 PHẦN V: KẾT QUẢ VÀ ỨNG DỤNG CỦA DỰ ÁN 69 PHẦN VI: BÀN LUẬN 72 PHẦN VII: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73 PHẦN VIII: TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 PHẦN IX: CÁC PHỤ LỤC 79 KÝ HIỆU VÀ Ý NGHĨA CÁC CHỮ VIẾT TẮT TNHC Trinh Nữ Hoàng Cung Crinum latifolium L HPLC: Sắc ký lỏng hiệu cao High Performance Liquid Chromatography SKLM: Sắc ký lớp mỏng Thin Layer Chromatography S: Độ lệch chuẩn Standard Deviation RSD: Độ lệch chuẩn tương đối Relative Standard Deviation LOD: Giới hạn phát Detection Limit LOQ: Giới hạn định lượng Quantitation Limit UV-VIS Tử ngoại – khả kiến Ultra Violet (Spectroscopy) IR: Hồng ngoại Infrared Spectroscopy NMR: Cộng hưởng từ hạt nhân Proton nuclear Magnetic Resonance MS: Phổ khối lượng Mass Spectroscopy BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA DỰ ÁN KH&CN CẤP NHÀ NƯỚC Tên đề tài: Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất từ TNHC (Crinum latifolium L.) để sản xuất viên nang điều trị phì đại lành tính tuyến tiền liệt Mã số: KC.10.DA17 Thuộc chương trình Khoa Học Cơng Nghệ trọng điểm cấp Nhà nước giai đoạn 2001-2005 “Khoa học công nghệ phục vụ chăm sóc bảo vệ sức khỏe cộng đồng” Chủ nhiệm dự án: TS NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM Cơ quan chủ trì dự án: CƠNG TY CP DƯỢC LIỆU TW2 Thời gian thực hiện: 18 tháng (từ tháng năm 2006 đến tháng năm 2007) Tổng kinh phí thực dự án: 4.934,3 triệu đồng Trong đó: kinh phí từ NSNN: 1.300 triệu đồng (bằng chữ: ngàn ba trăm triệu đồng) Kinh phí thu hồi: 835 triệu đồng Tình hình thực dự án so với hợp đồng 7.1 Về mức độ hoàn thành khối lượng cơng việc Hồn thành mục tiêu dự án: - Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất alcaloid từ dược liệu TNHC quy mơ cơng nghiệp - Hồn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm TNHC - Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm định lượng Crinamidin phương pháp HPLC Hoàn thành nội dung dự án: - Hoàn thiện quy trình công nghệ chiết xuất alcaloid từ dược liệu TNHC (lá TNHC tươi TNHC khô) dùng làm nguyên liệu sản xuất viên nang Trinh nữ hoàng cung (CRILA) quy mô cơng nghiệp - Hoàn thiện quy trình sản xuất viên nang từ bán thành phẩm TNHC Nghiên cứu ổn định thuốc từ 24 tháng lên 36 tháng - Nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin – định lượng phương pháp HPLC - Xây dựng tiêu chuẩn sở TNHC, cao khô TNHC, thuốc thành phẩm thẩm định lại thuốc xây dựng - Sản xuất 10.098.000 viên thuốc Crila 7.2 Về u cầu khoa học tiêu sản phẩm KHCN - - Sản phẩm dự án Viên nang Trinh nữ hoàng cung (CRILA) viên thuốc mới, đạt tiêu chuẩn sở có tác dụng điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, giá thành hợp lý, hiệu điều trị cao Sản phẩm chế tạo từ hai quy trình cơng nghệ chiết xuất bào chế hoàn thiện nâng cấp Xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm viên thuốc phương pháp HPLC Tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin 7.3 Về tiến độ thực - Đảm bảo tiến độ đề cương hợp đồng khoa học công nghệ số 11/2006/HĐ-DA, ngày 28/12/2006 - Nghiệm thu cấp sở quy định Bộ Khoa học Cơng nghệ Về đóng góp đề tài: Dự án hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất có hoạt tính sinh học có tác dụng ức chế phát triển khối u Sản phẩm dự án viên nang CRILA bào chế từ nguyên liệu chiết xuất từ dược thảo TNHC (Crinum latifolium L.) Hiện nay, có hai viên thuốc viên nang mềm Tadenan bào chế từ vỏ Mận Gai Châu Phi có tên khoa học Pygeum africanum Permixon từ Serenoa repens Pháp sản xuất, viên Crila viên thuốc thứ ba sau hai viên thuốc xếp vào kho tàng thuốc điều trị tuyến tiền liệt Viên CRILA cịn có khả chữa trị bệnh u xơ tử cung viên thuốc chữa u xơ tử cung sản xuất từ dược thảo Cho đến chưa có viên thuốc chữa u xơ tử cung sản xuất từ nguồn gốc thiên nhiên Viên CRILA đời cung cấp đủ thuốc phục vụ sức khỏe người bệnh nước xuất .Về giải pháp khoa học – công nghệ Đã hồn thiện quy trình cơng nghệ, tạo nguyên liệu để sản xuất thuốc điều trị bệnh khối u từ dược thảo Việt Nam thiết bị máy móc sản xuất nước thiết kế theo u cầu quy trình cơng nghệ cần tạo sản phẩm alcaloid có hoạt tính sinh học .Về phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nghiên cứu cổ điển kết hợp với phương pháp nghiên cứu hoàn thành nội dung dự án: - Chiết xuất phương pháp ngấm kiệt Các phương pháp hóa lý: Phổ hồng ngoại, khối phổ, cộng hưởng từ hạt nhân Sắc ký lớp mỏng, sắc ký cột Định lượng Crinamidin phương pháp HPLC .Những đóng góp khác Trong q trình nghiên cứu hồn thiện quy trình chiết xuất chúng tơi có cải tiến dung mơi chiết xuất nâng cao chất lượng sản phẩm so với giai đoạn nghiên cứu phịng thí nghiệm Khi sử dụng dung môi chiết cồn/acid, nước/acid, trước sử dụng acid tartric nên sản phẩm thu có mùi chua acid tartric kết tinh cao Để giải vấn đề q trình hồn thiện quy trình công nghệ chiết xuất thay acid tartric acid acetic Sản phẩm thu khơng cịn mùi acid acid acetic bốc q trình loại dung môi.Sản phẩm thu đạt chất lượng tốt Chúng giải vấn đề giá thành sản phẩm hợp lý hồn thiện quy trình chiết xuất nguyên liệu từ tươi, khâu xử lý nguyên liệu tươi theo quy trình kỹ thuật phá vỡ màng nguyên sinh tế bào chiết với dung mơi thích hợp Tiết kiệm chi phí điều trị bệnh so với sử dụng thuốc ngoại nhập để điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt Tạo công ăn việc làm cho người lao động Tạo sản phẩm thuốc từ nguồn dược liệu nước phục vụ sức khỏe cộng đồng PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt bệnh phổ biến nước Thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt gánh nặng bệnh nhân gia đình họ, chi phí điều trị cao Theo kết nghiên cứu 30% nam giới lứa tuổi 40 trở lên mắc phải bệnh Tình trạng sức khỏe người bệnh giảm sút phải tiểu nhiều lần đêm, ảnh hưởng đến sinh hoạt làm việc Do nhu cầu thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt ngày trở nên cấp thiết Để đáp ứng nhu cầu thuốc chữa bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt, Công ty Cổ phần Dược Liệu TW2 Bộ Y Tế cho phép thực nghiên cứu hai đề tài sau: Đề tài 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất alcaloid tồn phần từ Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L.) dùng làm nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung Do TS.Nguyễn Thị Ngọc Trâm làm chủ nhiệm đề tài Kết nghiệm thu đạt loại với nội dung nghiên cứu sau: Nghiên cứu trồng Trinh nữ hoàng cung làm nguyên liệu cho nghiên cứu sản xuất - Chọn giống Trinh nữ hoàng cung mặt hình thái thực vật có hiệu suất trồng cao - Xác định kỹ thuật trồng - Sơ đánh giá ảnh hưởng yếu tố khí hậu, thổ nhưỡng lên suất thu hoạch - Xác định thời điểm thu hoạch cho suất cao Xây dựng tiêu chuẩn sở cho dược liệu Trinh Nữ Hoàng Cung - Đã xây dựng tiêu chuẩn sở hoàn chỉnh cho nguyên liệu Trinh Nữ Hoàng Cung - Kiểm nghiệm nguyên liệu thu hoạch theo tiêu chuẩn sở xây dựng Nghiên cứu sơ thực vật, hóa học chiết xuất - Đã nghiên cứu, khảo sát mặt hình thái thực vật, vi phẫu soi bột Trinh Nữ Hồng Cung để xác định tính xác thực xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu - Xây dựng phương pháp định tính, định lượng alcaloid tồn phần tính theo lycorine để phục vụ nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn, nghiên cứu chiết xuất làm sở để đánh giá hiệu suất quy trình chiết suất - Chiết thăm dị dược liệu dung mơi khác nhau: dung mơi có tính phân cực yếu cloroform; dung môi không phân cực ether dầu hỏa; dung môi phân cực mạnh cồn/acid, nước acid, chiết xuất với độ cồn 96o, 70o, 50o, thử tác dụng sinh học dịch chiết từ chọn phương pháp chiết xuất dung mơi thích hợp cho nghiên cứu quy trình chiết: Phương pháp chiết xuất ngấm kiệt, cồn 70o + 2% acid tartric, tỉ lệ dung môi dược liệu 9:1 - Xây dựng quy trình chiết tối ưu cho hiệu suất xấp xỉ 100% tính theo alcaloid tồn phần Nghiên cứu hồn thiện quy trình chiết - Đã tiến hành chiết thử quy mơ pilot: 5kg/mẻ để hồn thiện quy trình xây dựng Kết cho thấy quy trình ổn định, hiệu suất quy trình tính lượng alcaloid tồn phần có cao khơ đạt trung bình: 73,12 ± 7,78% - Tiêu chuẩn hóa sản phẩm cao khơ Khảo sát thăm dò dạng chế phẩm viên nang cứng - Đã khảo sát thử công thức quy trình sản xuất viên nang TNHC (Crila) từ cao khơ TNHC sản phẩm quy trình chiết xuất với liều lượng viên nang tương đương 1g dược liệu khơ Dự kiến quy trình thiết bị chiết xuất TNHC - Trên sở quy trình chiết xuất xây dựng được, dự kiến quy trình dây chuyền thiết bị thích hợp cho triển khai sản xuất quy mô lớn làm sở cho việc chuẩn bị đầu tư sản xuất Bảng 20: Kết khảo sát : Lô 021102 Thời gian Hình thức (tháng) Độ đồng khối lượng Mất khối lượng làm khô Độ rã (phút) Định tính Định lượng (mg) Độ nhiễm khuẩn (%) Viên nang PTB = 380mg 4,2 13 Đạt 1,35 Theo TC Ñaït Ñaït 4,5 10 Ñaït 1,28 Ñaït Ñaït Ñaït 4,7 15 Đạt 1,24 Đạt Đạt Đạt 4,5 18 Ñaït 1,27 Ñaït 12 Ñaït Ñaït 4,9 16 Ñaït 1,30 Ñaït 18 Ñaït Ñaït 5,0 12 Ñaït 1,34 Ñaït 24 Ñaït Ñaït 5,2 15 Ñaït 1,36 Ñaït 30 Ñaït Ñaït 5,8 12 Đạt 1,32 Đạt 36 Đạt Đạt 5,5 14 Đạt 1,34 Đạt Bảng 21: Kết khảo sát : Lô 031102 Thời gian Hình thức (tháng) Độ đồng khối lượng Mất khối Độ rã lượng (phút) làm khô Định tính Định lượng (mg) Độ nhiễm khuẩn Đạt 1,27 Theo (%) Vieân PTB = 4,8 14 nang 385mg Đạt Đạt 5,2 12 Đạt 1,28 Đạt Ñaït Ñaït 5,3 15 Ñaït 1,26 Ñaït Ñaït Ñaït 5,1 13 Đạt 1,30 Đạt 12 Đạt Đạt 5,4 12 Ñaït 1,25 Ñaït 18 Ñaït Ñaït 5,6 16 Ñaït 1,27 Ñaït 24 Ñaït Ñaït 5,8 12 Ñaït 1,31 Ñaït 30 Ñaït Ñaït 5,6 14 Ñaït 1,29 Ñaït 36 Ñaït Ñaït 5,5 15 Đạt 1,26 Đạt TC 21 2.5 Quy trình sản xuất viên nang CRILA 2.5.1 Cách tiến hành + Trộn bột cao khơ Trinh nữ hồng cung với aerosil máy trộn lập phương thời gian: 15 phút (Hỗn hợp A) + Ngừng máy, cho tiếp tinh bột sấy khô sodium starch glycolat vào hỗn hợp A , trộn tiếp 20 phút (Hỗn hợp B) + Ngừng máy, cho tiếp talc magnesi stearate vào hỗn hợp B, trộn tiếp 10 phút + Hỗn hợp bột đóng vào lần túi PE, buộc chặt miệng túi để tránh ẩm lấy mẫu kiểm nghiệm bán thành phẩm 2.5.2 Máy móc thiết bị chủ yếu - Thiết bị máy móc cho dây chuyền sản xuất viên nang cứng chủ yếu thiết kế sản xuất nước phù hợp yêu cầu kỹ thuật quy trình sản xuất có Cơng ty, kinh phí dự án cấp, giá thành thiết bị máy móc so với máy móc nhập rẻ nhiều Do đó, khấu hao thiết bị máy móc vào giá thành sản phẩm phù hợp với thu nhập người lao động - Máy móc thiết bị tự sản xuất nước tạo thêm công ăn việc làm cho người lao động Việt Nam Thúc đẩy phát triển ngành chế tạo máy nước ta tiến dần lên theo kịp nước - Trên sở số máy móc thiết bị có, chúng tơi đảm bảo đủ số thuốc phục vụ nước cho bệnh nhân mắc bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt Bảng 22: Máy móc thiết bị bào chế chủ yếu Stt Tên thiết bị Số lượng Công suất Nước SX Máy sửa hạt ướt 300-400kg/h Việt Nam Máy sấy 28khay, 100kg/lần Việt Nam Máy xay búa 100-300kg/h, Việt Nam 3625 vòng/phút Máy rây hai tầng 50kg/giờ Việt Nam Máy trộn lập phương 25 vòng/phút Việt Nam Máy đóng nang bán tự động 20-21vòng /h Trung Quốc Máy lau nang 7000viên/phút Trung Quốc Máy hút bụi công nghiệp 110m khí/giờ Trung Quốc Máy hút ẩm 110m3/1h Trung Quốc 10 Máy đếm viên 50.000 viên/h Đài Loan 22 2.5.3 Quy trình công nghệ sản xuất viên nang CRILA Sơ đồ 3: Sơ đồ tóm tắt quy trình công nghệ sản xuất viên nang CRILA Aerosil Cao khô TNHC Rây 0,75mm Tinh bột DST Rây 0,75mm Tacl Rây 0,75mm Magnesi stearate Trộn khô Rây 0,75mm Hỗn hợp A Trộn khô (tạo hạt) Hỗn hợp B Tạo cốm trơn KNSPTC Cốm BTP Đóng nang Vỏ nang rỗng Viên nang TNHC Lau chọn nang KNBTP Đóng gói KNTP Thành phẩm Bao bì 23 2.5.4 Vệ sinh vơ trùng an tồn lao động 2.5.5 Nội dung kiểm tra trình sản xuất 2.5.6 Dư phẩm phế phẩm 2.5.7 Hồ sơ làm việc cần thiết Nghiên cứu định tính định lượng alcaloid crinamidin nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 3.1 Tạo lập chất chuẩn Crinamidin Crinamidin công bố tài liệu có cơng thức cấu tạo sau (Hình 1): O OH O N O OMe Hình 1: Cơng thức cấu tạo Crinamidin Cơng thức phân tử: C17H19NO5; Phân tử lượng: 317,09 Việc chiết tách alcaloid từ Trinh nữ hoàng cung thực Viện Hố học thuộc Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Sau kỹ thuật kết tinh lại nhiều lần sắc ký cột điều chế, thu alcaloid tinh khiết Chất bột tinh thể màu trắng ngà, có điểm nóng chảy đo khoảng 225oC (223oC – 228oC) Cấu trúc phân tử xác định phương pháp phổ: Hồng ngoại IR, cộng hưởng từ hạt nhân proton 1H NMR, cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C, 13C NMR, phổ khối lượng MS Kết phân tích biện giải phổ thu cho biết chất kết tinh có phân tử lượng 317,09 tương ứng với công thức phân tử C17H19NO5 có cấu trúc hố học Crinamidin Chất sau kiểm tra tiếp phổ tử ngoại - khả kiến thấy có cực đại hấp thụ khoảng 283 – 285 nm (Hình 2) sắc ký đồ HPLC điều kiện phân tích thời gian khoảng 45 phút cho pic có tR = 32 - 33 phút (Hình 3): 24 Hình 2: Phổ hấp thụ UV/VIS Hình 3: Sắc ký đồ chất chuẩn Như vậy, chất chiết Crinamidin tinh khiết, dùng để làm chất chuẩn việc tiếp tục khảo sát phân tích định tính, định lượng alcaloid dược liệu Trinh nữ hoàng cung bán thành phẩm viên nang Crila 3.2 Xây dựng phương pháp định tính, định lượng crinamidin TNHC, bán thành phẩm viên nang Crila b Xây dựng phương pháp phân tích định tính, định lượngcrinamidin b.1 Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký: Trên sở máy sắc ký lỏng Merck - Hitachi với detector UV-VIS , sử dụng cột pha đảo RP 18 RP (250 x 4,6 mm; µm), dung dịch thử dung dịch chuẩn mục a.3, tiến hành khảo sát với số hệ pha động, tốc độ dòng khác nhau: Pha động: Đã tiến hành khảo sát số hệ pha động: Acetonitril – Đệm phosphat 100 mM pH 3,0 (10 : 90); Dung dịch g natri octansulfonat 420 ml nước, điều chỉnh đến pH 3,0 với acid phosphoric - Acetonitril (80 : 20); Acetonitril 12% - Tetrahydrofuran 10% - Đệm phosphat pH 2,75 (52 : 15 : 33) Qua thực nghiệm thấy pha động Acetonitril – Đệm phosphat 100 mM pH 3,0 (10 : 90) tốc độ dòng 1,0 – 1,5 ml/phút cho phép tách tốt crinamidin khỏi thành phần khác mẫu thử 25 Bước sóng phát detector UV: Để xác định bước sóng phát crinamidin, ghi phổ UV-VIS dung dịch crinamidin pha động hỗn hợp acetonitril – đệm phosphat pH 3,0 (10 : 90) khoảng từ 200 nm – 500 nm Phổ UV thu cho thấy crinamidin pha động có hấp thụ cực đại khoảng 283 – 285 nm (Hình 1), chúng tơi chọn bước sóng phát 285 nm Tóm lại qua nghiên cứu khảo sát thực nghiệm, cuối lựa chọn điều kiện sắc ký sau: - Cột RP 18 (250 x 4,6 mm; µm) - Dung mơi động: Acetonitril - Đệm phosphat 100 mM, pH 3,0 với chương trình rửa giải sau: Thời gian (phút) % Acetonitril % đệm phosphat pH 3,0 0→40 10 90 40→41 10→40 90→60 41→60 40 60 60→61 40→10 60→90 61→65 10 90 - Tốc độ dòng : 1,0- 1,5 ml/ phút - Detector UV : 285 nm - Thể tích tiêm : 50 µl - Nhiệt độ phân tích : Nhiệt độ phịng b.2 Xây dựng đánh giá phương pháp định tính Crinamidin: Để xác định xem mẫu thử có xuất pic trùng thời gian lưu với pic crinamidin mẫu chuẩn không, tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn dùng detector diode array cho phép so sánh phổ mẫu thử mẫu chuẩn dựa hệ số match Kết thu cho thấy: - Trong điều kiện sắc ký lựa chọn pic tách rõ ràng, nhiễu thấp, sắc ký đồ mẫu thử Trinh Nữ Hồng Cung (Hình 4B), bán thành phẩm (Hình 4C) viên Crila (Hình 4D) cho pic có thời gian lưu (tR ~33 phút) với pic crinamidin sắc ký đồ mẫu chuẩn (Hình 4A) 26 A B C D Hình 4: Sắc ký đồ so sánh phổ mẫu thử mẫu chuẩn A Chuẩn Crinamidin B Lá TNHC C Bán thành phẩm viên Crila D Viên Crila - Tại thời gian lưu pic crinamidin sắc ký đồ thử chuẩn cho phổ trùng khít lên (Hình 5) với hệ số match 0,9938 Hình.5: Phổ so sánh UV-VIS crinamidin mẫu chuẩn mẫu thử (hệ số match = 0,9938) - Kết cho thấy pic thu sắc ký đồ mẫu thử tinh khiết Như vậy, thành phần khác có mẫu thử khơng ảnh hưởng đến q trình phân tích crinamidin điều kiện sắc ký lựa chọn Pic crinamidin sắc ký đồ dung dịch thử khiết cho phép tiến hành định tính, định lượng 27 b.3 Đánh giá phương pháp: b.3.1./ Tính thích hợp hệ thống sắc ký: Pha mẫu chuẩn theo dẫn mục a.3, tiêm lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC Tiến hành sắc ký với điều kiện lựa chọn Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống ghi Bảng 23: Bảng 23: Kết khảo sát tính thích hợp hệ thống Hoạt chất RSD RSD thời gian lưu diện tích pic (%) (%) Crinamidin 0,37 Số đĩa lý thuyết trung bình (N) Hệ số bất đối trung bình (T) 11300 1,4 0,79 Kết cho thấy điều kiện sắc ký mà lựa chọn hệ thống HPLC mà sử dụng phù hợp đảm bảo ổn định phép phân tích định lượng crinamidin b.3.2 Khoảng tuyến tính phương pháp định lượng: Kết thể Bảng 24 Bảng 24: Kết khảo sát khoảng tuyến tính Dung dịch Nồng độ (µg/ml) 30 60 90 120 150 225 300 Diện tích pic 291421 643168 1004920 1350318 1722121 2646479 3547082 Phương trình hồi qui: y = 12094x – 83692 Hệ số tương quan : r = 0,9999 Kết khảo sát cho thấy với khoảng nồng độ crinamidin từ 30 µg/ml đến 300 µg/ml có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích pic tương ứng 28 b.3.3 Độ lặp lại phương pháp: Kết ghi Bảng 25 Bảng 25: Kết khảo sát độ lặp lại phương pháp Tên mẫu thử Số mẫu Hàm lượng Crinamidin định lượng tìm thấy Các số liệu thống kê Lá TNHC 989,1 ± 45,0 µg/gam S = 32,4 ; RSD = 3,3% Bán thành phẩm viên Crila 146,0 ± 6,5 µg/gam S = 4,7 ; RSD = 3,2% Viên nang Crila 74,7 ± 3,8 µg/viên S = 2,7 ; RSD = 3,6% Với kết cho phép ta áp dụng chương trình để định lượng crinamidin mẫu dược liệu TNHC bán thành phẩm thành phẩm b.3.4 Độ phương pháp: Độ phương pháp xác định phương pháp thêm vào mẫu thử lượng mẫu crinamidin chuẩn cho tổng lượng crinamidin nằm khoảng tuyến tính khảo sát Kết thu ghi Bảng 26 Bảng 26: Kết khảo sát độ phương pháp Tên mẫu thử Số lần định lượng Lượng Lượng tìm % tìm lại thêm vào lại đươc (µg) trung bình trung bình Lá TNHC 1050 1022,7 97,4 S = 2,8; RSD = 2,9% Bán thành phẩm 400 356,0 89,0 S = 7,0; RSD = 7,9% Viên nang Crila 400 373,6 93,4 S = 5,0; RSD = 5,3% Số liệu thống kê 3.3 Kết luận: Trong năm qua, chúng tơi hồn thành nội dung nghiên cứu tạo lập chất chuẩn crinamidin chiết tách từ TNHC, khảo sát xác định điều kiện phân tích HPLC để định tính định lượng alcaloid dược liệu bán thành phẩm viên nang Crila Phương pháp phân tích thẩm định đạt yêu cầu tính đặc hiệu, độ xác lặp lại, dùng để xác định crinamidin TNHC chế phẩm Phương pháp kiểm nghiệm bổ sung vào tiêu chuẩn nguyên liệu, tiêu chuẩn bán thành phẩm thành phẩm, góp phần hồn thiện nâng cấp tiêu chuẩn chất lượng thuốc Crila 29 KẾT QUẢ VÀ ỨNG DỤNG CỦA DỰ ÁN Sản xuất 10.098.000 viên Crila Để chủ động có thuốc phục vụ sức khỏe cộng đồng từ nguồn dược thảo nước Bộ Khoa Học Và Cơng Nghệ hỗ trợ kinh phí để dự án sản xuất thử nghiệm KC.10.DA17 hoàn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L Amaryllidaceace) hoàn thiện quy trình cơng nghệ bào chế viên nang cứng CRILA dùng điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt Trong thời gian thực dự án, viên nang CRILA bước xâm nhập thị trường tạo lòng tin người bệnh, hiệu điều trị bệnh rõ rệt Viên nang CRILA viên thuốc bào chế từ nguồn dược liệu sạch, ổn định hoạt chất sinh học, từ hai quy trình cơng nghệ chiết xuất, bào chế hoàn thiện Trong thời gian thực dự án để sản phẩm viên nang Crila đưa nhanh vào thị trường Trung tâm NCPTSX Dược Phẩm CRINA-Công Ty CP Dược Liệu TW2 kết hợp với công ty dược phẩm, bệnh viện nước phân phối viên nang CRILA đến bệnh viện, hiệu thuốc, tận dụng phương tiện thông tin đại chúng để quảng bá sản phẩm thị trường, cung cấp thuốc cho người bệnh miền đất nước Miền Bắc - Hà Nội: Công ty CP Dược Phẩm Y Tế Hapharco, Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Trung Ương , Chi nhánh Công ty CP Dược Liệu TW2, Công ty CP Dược Phẩm TM Việt Cường, … - Hải phịng Cơng ty TNHH Thương Mại Việt Tiến Miền Trung - Công ty CP Dược Phẩm Hoàng Phúc- Đà Nẵng Miền Nam - Thành phố Hồ Chí Minh: Trung tâm Kinh Doanh Thuốc – Công ty CP Dược Liệu TW2, Công ty TNHH Dược Phẩm Hương Thảo – Q.10, Công ty CP Dược Phẩm Q.10- Cửa hàng 38, Bệnh Viện Y Học Cổ Truyền Thành Phố Hồ Chí Minh, Cơng ty CP Dược Phẩm Q.3, … Các tỉnh phía Nam - Cần Thơ, Tiền Giang, Long An, Sóc Trăng, … Dự kiến năm 2007, khả tiêu thụ sản phẩm tăng cao Khoảng 8.000.000 viên/năm 30 VIÊN NANG TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRILA) VIÊN NANG TRINH NỮ HOÀNG CUNG (CRILA) 31 BÀN LUẬN Kết nghiên cứu - Trong q trình nghiên cứu quy mơ pilot chúng tơi tiến hành chiết xuất với cồn 70o môi trường acid tartric Khi thực quy trình quy mơ cơng nghiệp sản phẩm cao alcaloid có mùi acid, có vị chua acid tartric Để khắc phục tăng chất lượng sản phẩm thu được, chúng tơi thay acid tartaric acid acetic Ngồi giá thành acid acetic thấp so với acid tartric - Về tinh chế sản phẩm: Chúng đưa phương pháp đơn giản phù hợp với quy trình sản xuất quy mơ cơng nghiệp - Khi nghiên cứu hồn thiện quy trình bào chế chúng tơi nâng tuổi thọ thuốc lên 36 tháng - Về tiêu chuẩn kiểm nghiểm: Trong hồ sơ đăng ký thuốc Crila Cục quản lý Dược - Bộ Y Tế chúng tơi định lượng alcaloid tồn phần phương pháp acid – baze Hiện tiêu chuẩn kiẻm nghiệm nâng cấp sử dụng phương pháp HPLC để định tính, định lượng crinamidin nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm.Vì tiêu chuẩn kiểm nghiệm có sử dụng HPLC vào định tính định lượng hồn thành vào năm 2007, phần theo dõi độ ổn định thuốc Crila kiểm nghiệm theo tiêu chuẩn cũ đăng ký với Cục quản lý Dược - Bộ Y Tế Sau đăng ký lại xin phép thực theo tiêu chuẩn xây dựng Hiệu kinh tế xã hội - Hoàn thành dự án KC.10.DA17 tạo dựng sở vật chất kỹ thuật sản xuất thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt nước ta - Sản phẩm thuốc viên nang CRILA đời tham gia vào kho tàng thuốc điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt giới Dự án hoàn thành sản xuất đủ thuốc phục vụ sức khỏe cộng đồng từ nguồn dược thảo nước, hiệu điều trị cao, giá thành hợp lý - Chúng ta so sánh giá thành loại thuốc loại nhập Pháp: + Viên nang CRILA: 1.200 đồng/viên – sản xuất từ nguồn dược thảo Việt Nam Trinh Nữ Hoàng Cung (Crinum latifolium L Amaryllidaecae.) + Viên Tadenan : 9.000 đồng/viên – sản xuất từ vỏ Pygeum africanum (một loại mận Châu Phi) + Khả điều trị bệnh: Viên CRILA có khả làm giảm thể tích tuyến tiền liệt, Tadenan khơng làm giảm thể tích tuyến tiền liệt + Khả cải thiện tiểu tiện tăng chất lượng sống Tadenan CRILA tương đương - Viên nang CRILA có khả thay loại thuốc nhập sản xuất từ dược thảo Tadenan, Permixon Pháp Bảo tồn nguồn thuốc TNHC 32 - Để bảo đảm chất lượng sản phẩm, ổn định mặt tác dụng sinh học, Trung tâm NCPTSX Dược phẩm CRINA thuộc Công ty Cổ phần Dược liệu TW2 phát triển trồng TNHC Trại Dược liệu Long Thành - Đồng Nai với diện tích 10ha Giống nghiên cứu phân biệt với Crinum latifolium khác AND - Với nguồn giống có, chúng tơi phát triển vùng trồng thành hàng trăm ha, đủ nguyên liệu sản xuất thuốc phục vụ sức khoẻ cộng đồng 4.Đào tạo - Đã đào tạo cán công nhân kỹ thuật thành thạo sản xuất - Đề tài nghiên cứu thuốc TNHC có 10 báo đăng tải tạp chí khoa học ngồi nước 5.Bã dược liệu sau chiết hoạt chất: Được sử dụng làm phân bón 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Chúng thực dự án theo mục tiêu nội dung đề cương hội đồng khoa học cơng nghệ phê duyệt + Hồn thiện quy trình cơng nghệ chiết xuất hoạt chất alcaloid từ dược liệu TNHC quy mô công nghiệp.Với quy mô ≥ 200kg dược liệu khô ≥ 1.000kg dược liệu tươi + Đã nghiên cứu thay đổi acid tartric acid acetic giải khâu tinh chế tương đối đơn giản đảm bảo chất lượng sản phẩm thu đượcđạt TCCS phù hợp với quy mô sản xuất cơng nghiệp + Đã hồn thiện quy trình sản xuất viên nang Crila từ cao khô TNHC, khảo sát thông số kỹ thuật bào chế: Công thức viên nang, độ ẩm, nghiên cứu dải phân bố cỡ hạt, tính chảy hạt, tính phân tán nước, độ đồng khối lượng, độ rã, khối lượng làm khô nghiên cứu độ ổn định thuốc điều kiện tự nhiên 36 tháng Kết cho thấy viên nang Crila đạt chất lượng theo TCCS sau 36 tháng bảo quản Do chúng tơi đề nghị nâng hạn dùng thuốc lên 36 tháng Hiện quy trình sản xuất viên nang Crila thực với quy mô 200.000 viên mẻ sản xuất + Đã nâng cấp tiêu chuẩn kiểm nghiệm nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm, tạo chất chuẩn tinh khiết crinamidin để sử dụng phương pháp HPLC định tính định lượng nguyên liệu, bán thành phẩm thành phẩm Đã xây dựng tiêu chuẩn sở nguyên liệu, bán thành phẩm, thành phẩm + Sản xuất 10.098.000 viên Crila - Kết nghiên cứu đăng ký Cục Sở hữu trí tuệ - Bộ Khoa học Công nghệ cấp “Bằng độc quyền giải pháp hữu ích” theo Quyết định số A8994/QĐ-ĐK, ngày 18 – 08 – 2005 - Dự án tạo viên thuốc mới, viên nang CRILA, điều trị bệnh phì đại lành tính tuyến tiền liệt có hiệu điều trị cao đạt 89,18%, điều trị bệnh u xơ tử cung đạt 79,5% có giá thành hợp lý, liều điều trị gần 50% giá thành thuốc nhập loại - Dự án thiết kế lắp đặt hoàn chỉnh dây chuyền sản xuất cao khô TNHC dây chuyền sản xuất viên nang cứng Crila - Công ty CP Dược Liệu TW2 cải tạo nâng cấp xưởng chiết xuất cao dược liệu TNHC xưởng sản xuất viên nang CRILA - Doanh số dự án: + Năm 2005: 2,4 tỷ đồng + Năm 2006: 3,1 tỷ đồng 34 Kiến nghị - Công ty mong muốn có giúp đỡ quan tâm Bộ Y Tế cho phép viên nang CRILA xếp vào danh mục thuốc thiết yếu thuốc bảo hiểm y tế để tạo điều kiện cho sản phẩm phát triển mạnh nữa, tạo chổ đứng cho sản phẩm thị trường - Viên nang CRILA cịn có thêm vài tác dụng điều trị khác điều trị u xơ tử cung, hỗ trợ điều trị ung thư Kinh phí nghiên cứu khoa học cơng ty có phần eo hẹp Kính đề nghị Bộ Khoa học Công nghệ hỗ trợ để phát triển sản phẩm CRILA thử lâm sàng CÔNG TY CỔ CP DƯỢC LIỆU TW2 CHỦ NHIỆM DỰ ÁN TS.NGUYỄN THỊ NGỌC TRÂM 35 ... cứu hoàn thiện qui trình cơng nghệ chiết xuất alcaloid tồn phần từ Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L. ) dùng l? ?m nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị bệnh u xơ tuyến tiền liệt, u xơ tử cung. .. điều trị bệnh phì đại l? ?nh tính tuyến tiền liệt (u xơ tuyến tiền liệt) TÍNH CẤP THIẾT VÀ KHẢ THI CỦA DỰ ÁN Bệnh phì đại l? ?nh tính tuyến tiền liệt bệnh phổ biến xã hội nước, nhu cầu thuốc điều trị. .. cung (Crinum latifolium L. ) để sản xuất viên nang điều trị phì đại l? ?nh tính tuyến tiền liệt? ?? 12 PHẦN II: TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ CÂY TNHC (Crinum latifolium L. ) Từ