VI SINH VẬT ĐẠI CƯƠNG MỤC LỤC CHƯƠNG I MỞ ĐẦU VỀ VI SINH VẬT HỌC ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC 1.1 Đối tượng vi sinh vật học đại cương 1.2 Sự phân bố vi sinh vật 10 1.3 Vai trò vi sinh vật 10 1.4 Nhiệm vụ vi sinh vật học đại cương 11 KHÁI LƯỢC VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT HỌC 12 2.1 Giai đoạn trước phát minh kính hiển vi 12 2.2 Giai đoạn sau phát minh kính hiển vi (Phát vi sinh vật) 12 2.3 Giai đoạn vi sinh vật học thực nghiệm với Pasteur 13 2.4 Giai đoạn sau Pasteur vi sinh học đại 15 CÁC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA VI SINH VẬT 17 3.1.Kích thước nhỏ bé 17 3.2 Hấp thu nhiều, chuyển hoá nhanh 18 3.3 Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh 18 3.4 Có lực thích ứng mạnh dễ dàng phát sinh biến dị 19 3.5 Phân bố rộng, chủng loại nhiều 20 3.6 Là sinh vật xuất trái đất 20 CHƯƠNG II VI SINH VẬT NHÂN NGUYÊN THỦY 22 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HÌNH THÁI VÀ CẤU TẠO TẾ BÀO VI SINH VẬT 22 1.1 Kính hiển vi 22 1.1.1 Kính hiển vi quang học 22 1.1.2 Kính hiển vi điện tử 23 1.2 Phương pháp làm tiêu hiển vi 24 1.2.1 Phương pháp làm tiêu soi tươi (giọt ép, giọt treo) 24 1.2.2 Phương pháp làm tiêu nhuộm soi kính hiển vi quang học 25 1.2.3 Phương pháp quan sát kính hiển vi điện tử 26 VI KHUẨN 27 2.1 Hình dạng kích thước 27 2.1.1 Cầu khuẩn (Coccus) 27 2.1.2 Trực khuẩn (Bacillus, Bacterium) 29 2.1.3 Cầu trực khuẩn (Cocco-Bacillus) 31 2.1.4 Phẩy khuẩn (Vibrio) 31 2.1.5 Xoắn thể (Spirillum) 31 2.1.6 Xoắn khuẩn (Spirochaeta) 32 2.2 Cấu tạo tế bào vi khuẩn 33 2.2.1 Thành tế bào (Cell wall) 34 2.2.2 Màng tế bào chất 37 2.2.3 Tế bào chất (Cytoplasm) 39 2.2.4 Mesosom 39 2.2.5 Ribosom 40 2.2.6 Các hạt dự trữ 41 2.2.7 Thể nhân (nuclear body) 42 2.2.8 Bao nhầy (capsula) 44 2.2.9 Tiêm mao (Flagella) nhung mao (pilus hay fimbria) 45 2.2.10 Nha bào hình thành nha bào (spore) 49 MỘT SỐ NHÓM VI KHUẨN ĐẶC BIỆT 53 3.1 Xạ khuẩn 53 3.2 Mycoplasma dạng L vi khuẩn 56 3.3 Rickettsia 57 SỰ SINH SẢN Ở VI KHUẨN 58 4.1 Sinh sản vô tính 58 4.2 Sinh sản hữu tính 58 CHƯƠNG III VI SINH NHÂN THẬT 61 NẤM MEN 61 1.1 Hình thái, cấu tạo nấm men 61 1.1.1 Hình thái, kích thước nấm men 61 1.1.2 Cấu tạo tế bào nấm men 62 1.2 Sinh sản nấm men 70 1.2.1 Sinh sản vơ tính 70 1.2.2 Sinh sản hữu tính: Sinh sản bào tử túi 73 1.3 Vai trò nấm men 75 1.4 Phân loại nấm men 76 NẤM MỐC (NẤM SỢI) 76 2.1 Hình thái nấm mốc 76 2.2 Cấu tạo nấm mốc 78 2.2.1 Khuẩn ty 78 2.2.2 Bào tử 84 3 TẢO 88 3.1 Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta) 89 3.2 Nhóm Tảo nâu 90 3.2.1 Ngành Khuê tảo hay Tảo cát (Bacillariophyta) 90 3.2.2 Ngành Tảo giáp (Pyrrophyta) 91 3.2.3 Ngành Tảo nâu (Phaeophyta) 91 3.3 Nhóm Tảo lục 92 3.3.1 Ngành Tảo lục (Chlorophyta) 93 3.3.2 Ngành Tảo vòng (Charophyta) 94 3.3.3 Ngành Euglenophyta (Tảo mắt) 94 CHƯƠNG IV SINH LÝ HỌC VI SINH VẬT 98 DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT 98 1.1 Thành phần hóa học tế bào vi khuẩn 98 1.1.1 Nước 98 1.1.2 Vật chất khô 99 CÁC KIỂU DINH DƯỠNG Ở VI SINH VẬT 106 2.1 Nhu cầu thức ăn vi sinh vật 106 2.2 Nguồn thức ăn nitơ vi khuẩn 110 2.3 Nguồn thức ăn khoáng vi sinh vật 112 2.4 Nhu cầu chất sinh trưởng vi sinh vật 114 CƠ CHẾ VẬN CHUYỂN CÁC CHẤT DINH DƯỠNG VÀO TẾ BÀO VI SINH VẬT 115 3.1 Khuếch tán thụ động 116 3.2 Vận chuyển nhờ permease 116 TRAO ĐỔI VẬT CHẤT VÀ NĂNG LƯỢNG 120 4.1 Quá trình trao đổi lượng 120 4.1.1 Bản chất hô hấp vi sinh vật 121 4.1.2 Các loại hô hấp 121 4.2 Sự phân giải hợp chất hữu 129 4.2.1 Phân giải hợp chất không chứa Nitơ 129 4.2.2 Phân giải hợp chất hữu chứa Nitơ 140 4.3 Tổng hợp hợp chất hữu 144 4.3.1 Tổng hợp hợp chất hữu có Nitơ 144 4.3.2.Tổng hợp hợp chất hữu không chứa Nitơ 147 SỰ SINH TRƯỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI SINH VẬT 148 5.1 Sinh trưởng, sinh sản phát triển vi khuẩn 148 5.2 Phương pháp nghiên cứu phát triển vi sinh vật 148 5.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật 148 5.2.2 Nuôi cấy vi khuẩn 150 5.3 Các phương pháp định lượng vi khuẩn 151 5.3.1 Đếm trực tiếp kính hiển vi 151 5.3.2 Đếm số tế bào sống (khuẩn lạc đĩa thạch) 153 5.3.3 Phương pháp đo độ đục huyền phù vi khuẩn 154 5.4 Lý thuyết phát triển vi khuẩn 156 5.5 Biểu đồ phát triển vi khuẩn 158 5.5.1 Sinh trưởng phát triển vi khuẩn điều kiện nuôi cấy tĩnh 158 5.5.2 Hiện tượng sinh trưởng kép 161 5.5.3 Sinh trưởng phát triển vi khuẩn điều kiện nuôi cấy liên tục 162 CHƯƠNG V ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 165 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC TÁC NHÂN VẬT LÝ 165 1.1 Độ ẩm 165 1.2 Nhiệt độ 165 1.2.1 Nhiệt độ thấp 166 1.2.2 Nhiệt độ cao 167 1.3 Áp suất thẩm thấu 168 1.4 Sóng siêu âm 168 1.5 Sức căng bề mặt 169 1.6 Tia xạ 169 1.6.1 Ánh sáng mặt trời 170 1.6.2 Tia tử ngoại (tia cực tím -UV) 170 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ HÓA HỌC 171 2.1 Ảnh hưởng pH môi trường 171 2.2 Thế oxi hóa khử (Eh) 172 2.3 Các chất diệt khuẩn (sát trùng) 173 2.3.1 Phenol 173 2.3.2 Ethanol 173 2.3.3 Các halogen tác dụng độc với vi khuẩn 174 2.3.4 Kim loại nặng 174 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ SINH HỌC HAY TƯƠNG TÁC GIỮA VI SINH VẬT VỚI VI SINH VẬT VÀ VỚI VI SINH VẬT KHÁC 176 3.1 Kháng sinh 176 3.1.1 Khái niệm phân loại chất kháng sinh 176 3.1.2 Một số vấn đề kháng sinh 179 - Cơ chế tác động kháng sinh 179 - Hiện tượng kháng thuốc vi sinh vật 180 - Cơ chế hình thành tính kháng thuốc vi sinh vật 181 3.2 Tế bào diệt tự nhiên yếu tố hòa tan 183 3.3 Kháng thể 184 3.4 Tiêu độc khử trùng 184 3.4.1 Tiêu độc phương pháp tiêu độc 184 3.4.2 Khử trùng phương pháp khử trùng 185 CHƯƠNG VI DI TRUYỀN HỌC VI SINH VẬT 190 MỘT SỐ KHÁI NIỆM CHUNG 190 CƠ SỞ VẬT CHẤT DI TRUYỀN CỦA VI KHUẨN 191 2.1 ADN nhiễm sắc thể, ARN protein 191 2.1.1 Sao chép (tự sao) 191 2.1.2 Phiên mã 193 2.1.3 Dịch mã 194 2.2 Khái niệm phân loại Plasmid 197 2.3 Biến dị vi khuẩn 199 2.3.1 Sự thích nghi 199 2.3.2 Các loại biến dị 200 VẬN CHUYỂN VÀ TÁI TỔ HỢP THÔNG TIN DI TRUYỀN 204 3.1 Chuyển nạp 205 3.1.1 Những thí nghiệm F Griffith chuyển nạp 1928 206 3.1.2 Thí nghiệm in vitro tượng chuyển nạp 207 3.1.3 Bản chất nhân tố chuyển nạp 208 3.1.4 Điều kiện để có chuyển nạp 209 3.1.5 Các giai đoạn trình chuyển nạp 210 3.1.6 Ứng dụng chuyển nạp nghiên cứu di truyền học 212 3.2 Tải nạp 214 3.2.1 Khái niệm phage vi khuẩn vi khuẩn sinh tan 215 3.2.2 Các kiểu tải nạp 219 3.2.3 Cơ chế chung tải nạp 221 3.2.4 Ứng dụng trình tải nạp 221 3.3 Giao nạp (tiếp hợp) 222 3.3.1 Chứng minh có tượng lai vi khuẩn 222 3.3.2 Sự phân hóa giới tính 223 3.3.3 Episome plasmid 223 3.3.4 Nhân tố F/ 223 3.3.5 Tái tổ hợp 224 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT DI TRUYỀN TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TRUYỀN NHIỄM 224 4.1 Quy trình thường quy để chẩn đốn bệnh vi sinh vật 224 4.2 Những trở ngại chẩn đoán vi khuẩn học 225 4.3 Phương pháp nhân ADN (PCR: polymerase chain reaction) 225 CHƯƠNG VII KỸ THUẬT BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT 229 PHIẾU THÔNG TIN VỀ CHỦNG VI SINH VẬT BẢO QUẢN 229 CHỨC NĂNG CỦA BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT 230 MỘT SỐ ĐIỂM LƯU Ý ĐỐI VỚI MỘT BỘ SƯU TẬP GIỐNG VI SINH VẬT 231 3.1 Duy trì khả sống vi sinh vật bảo quản 231 3.2 Quan tâm đến số lượng tế bào tiến hành bảo quản 231 3.3 Duy trì đặc tính di truyền ổn định chủng vi sinh vật bảo quản 231 3.4 Tính chủng vi sinh vật bảo quản 231 3.5 Kinh phí cần cho Bộ sưu tập vi sinh vật 231 3.6 Bảo quản chủng có giá trị 232 3.7 Cung cấp chủng giống cho khách hàng 232 3.8 Cung cấp thông tin liên quan đến chủng bảo quản 232 3.9 Kiểm tra chất lượng chủng vi sinh vật bảo quản 233 3.10 Cơ sở liệu Bộ sưu tập vi sinh vật 233 GIỚI THIỆU CHUNG MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT 233 4.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật 233 4.2 Phương pháp đông khô vi sinh vật phương pháp đông khô trực tiếp 235 4.2.1 Phương pháp đông khô 235 4.2.2 Phương pháp đông khô dịch thể trực tiếp (L-drying) 236 4.2.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu 237 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 238 5.1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn 238 5.1.1 Bảo quản vi khuẩn 238 5.1.2 Bảo quản xạ khuẩn: 241 5.2 Bảo quản vi tảo 242 5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi 242 5.4 Phương pháp bảo quản nấm men 248 CHƯƠNG I MỞ ĐẦU VỀ VI SINH VẬT HỌC ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC 1.1 Đối tượng vi sinh vật học đại cương Xung quanh chúng ta, ngồi sinh vật lớn mà nhìn thấy được, cịn có vơ vàn vi sinh vật nhỏ bé, muốn nhìn thấy chúng phải sử dụng kính hiển vi, người ta gọi chúng vi sinh vật Môn khoa học nghiên cứu hoạt động sống vi sinh vật gọi Vi sinh vật học Vi sinh vật học phát triển nhanh dẫn đến việc hình thành lĩnh vực khác nhau: vi khuẩn học (Bacteriology), nấm học (Mycology), tảo học (Algology) virus học (Virolory), Việc phân chia lĩnh vực cịn dựa vào phương hướng ứng dụng Do thấy cịn có y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh vật công nghiệp, vi sinh vật học nông nghiệp Ngay vi sinh vật học nông nghiệp có nhiều chuyên ngành: vi sinh vật lương thực, vi sinh vật thực phẩm, Mỗi lĩnh vực có đối tượng cụ thể riêng, cần sâu Tuy nhiên mức độ định chuyên ngành có điểm giống Vi sinh vật học đại cương, nghiên cứu quy luật chung vi sinh vật Đối tượng nghiên cứu vi sinh vật học vi khuẩn, xạ khuẩn (Actinomycetes), virus, Bacteriophage (thể thực khuẩn), nấm, tảo, nguyên sinh động vật Vi khuẩn: nhóm vi sinh vật có nhân nguyên thủy, thể đơn bào, sinh sản chủ yếu hình thức trực phân, thể nhỏ bé, muốn quan sát phải sử dụng kính hiển vi quang học Virus: sinh vật mà kích thước chúng vô nhỏ bé, ký sinh nội bào tuyệt đối, muốn quan sát chúng phải sử dụng kính hiển vi điện tử Nấm: trước coi thực vật bậc thấp khơng có diệp lục tố, thường đơn bào, có nhóm giả đa bào, thể phân nhiều nhánh khơng có vách ngăn vách ngăn có lỗ thơng, thuộc tế bào nhân thật Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé có cấu trúc thể tương đối đơn giản chúng có tốc độ sinh sơi nẩy nở nhanh chóng hoạt động trao đổi chất vơ mạnh mẽ Vi sinh vật phân giải hầu hết tất loại chất có giới, kể chất khó phân giải, chất gây hại đến nhóm sinh vật khác Bên cạnh khả phân giải, vi sinh vật có khả tổng hợp nhiều hợp chất hữu phức tạp, điều kiện nhiệt độ, áp suất bình thường 1.2 Sự phân bố vi sinh vật Vi sinh vật phân bố rộng rãi tự nhiên: đất, nước, khơng khí, thể sinh vật khác, lương thực, thực phẩm loại hàng hóa Chẳng thế, phân bố chúng cịn theo hệ sinh thái vô phong phú, đa dạng, từ lạnh đến nống, từ chua đến kiềm, từ háo khí đến kị khí, Do phân bố rộng rãi hoạt động mạnh mẽ nên vi sinh vật có tác dụng lớn việc tham gia vịng tuần hồn vật chất trái đất tham gia vào trình sản xuất nông nghiệp Vi sinh vật học đại cương, nghiên cứu quy luật chung vi sinh vật 1.3 Vai trò vi sinh vật Trong thiên nhiên, vi sinh vật giữ mắt xích trọng yếu chu chuyển liên tục bất diệt vật chất, khơng có vi sinh vật hay lý mà hoạt động vi sinh vật bị ngừng trệ dù thời gian ngắn, làm ngưng hoạt động sống trái đất Thật người ta tính tốn khơng có vi sinh vật hoạt động để cung cấp CO2 cho khí đến lúc lượng CO2 bị cạn kiệt, lúc xanh quang hợp được, sống lồi sinh vật khác khơng tiến hành bình thường được, bề mặt trái đất trở nên lạnh lẽo 10 Hình 7.2 Đơng khơ vi sinh vật 4.2.2 Phương pháp đơng khơ dịch thể trực tiếp (L-drying) Ngồi phương pháp đơng khơ mơ tả trên, cịn có phương pháp đông khô trực tiếp Khác biệt với phương pháp chỗ dịch huyền phù vi sinh vật làm khơ nhanh chế độ chân khơng thích hợp mà mẫu không cần làm lạnh từ trước Phương pháp đặc biệt có ý nghĩa nhóm vi khuẩn khơng có khả sống nhiệt độ thấp giai đoạn tiền đông Các thông số quan trọng cần quan tâm thực phương pháp là: - Tuổi vi sinh vật bảo quản - Thành phần dịch huyền phù tế bào vi sinh vật - Tốc độ đông khô - Nhiệt độ đông khô thấp - Khoảng thời gian làm khô mẫu độ ẩm cuối mẫu Phương pháp nhanh thuận lợi cho đợt bảo quản số lượng lớn mẫu Thông thường theo phương pháp vi sinh vật bảo quản từ 10-20 năm Nói chung hai phương pháp có nhiều ưu điểm so với phương pháp trước thời gian bảo quản lâu, tiết kiệm cơng sức sai sót nhãn mác tạp nhiễm 236 Tuy nhiên, nhược điểm lớn phương pháp giá thành thiết bị Độ ổn định chủng vi sinh vật bảo quản theo đợt đông khô khác Hơn chủng trước đem sử dụng phải hoạt hố mơi trường thích hợp số lần để phục hồi đặc tính sinh học 4.2.3 Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu vi sinh vật bảo quản môi trường dịch thể nước cần cho hoạt động sống vi sinh vật bị bất hoạt nhiệt độ lạnh sâu (-196°C -> -80 °C) Hình 7.3 Bảo quản lạnh sâu Đặc biệt với phương pháp bảo quản lạnh sâu nitơ lỏng phương pháp vạn Phương pháp thích hợp với nhiều đối tượng vi sinh vật khác vi khuẩn, nấm sợi, nấm men, virut, tảo dòng tế bào động vật Tuy nhiên, phương pháp bộc lộ số nhược điểm đầu tư kinh phí cho thiết bị điện, nitơ lỏng rủi ro cháy nổ Đặc biệt phương pháp khơng thích hợp với chủng vi sinh vật thường xuyên dùng đến Nói chung phương pháp thường dùng với chủng vi sinh vật có đặc tính q mà khơng thích hợp với phương pháp đơng khơ 237 Hình 7.4 Bảo quản nitơ lỏng MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PHỔ BIẾN SỬ DỤNG TRONG BẢO QUẢN CÁC NHÓM VI SINH VẬT CỤ THỂ 5.1 Các phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn 5.1.1 Bảo quản vi khuẩn a Phương pháp đông khô (Freeze drying/ lyophilization) Đây phương pháp phổ biến sử dụng bảo tàng vi sinh vật giới Phương pháp đông khô hạn chế thay đổi đặc tính vi sinh vật bảo quản thời gian dài Phương pháp đơng khơ trình bày phương pháp dùng NCTC (National Colleciton Type Culture, Anh) * Nuôi vi khuẩn cho đông khô: Vi khuẩn cấy mơi trường ống thạch nghiêng thích hợp Tuy nhiên, chuẩn bị dịch vi khuẩn môi trường dịch thể phải làm đậm đặc tế bào li tâm Tuổi tế bào quan trọng thường chọn tế bào nằm pha sinh trưởng log * Chuẩn bị đệm mẫu: Có thể dùng hai loại đệm sau: 238 + Đệm huyết thanh- inositol; Meso-inositol: gam Huyết ngựa (số 3): 100 ml Thanh trùng phương pháp lọc vi khuẩn, sau phân 5ml vào bình vô trùng + Đệm inositol: Môi trường dinh dưỡng bột số 2: 2.5 gam Meso-inositol: gam Nước cất: đủ 100 ml Phân ml vào bình khử trùng nhiệt độ 121OC * Chuẩn bị dịch tế bào: Mật độ tế bào có ý nghĩa quan trọng chất lượng bảo quản Thơng thường thu sinh khối từ ống thạch nghiêng dùng cho 1-2 ml đệm pha mẫu để tạo dịch huyền phù tế bào Mật độ vi khuẩn thông thường cần đạt 1010 (đối với vi sinh vật khơng có bào tử) Mật độ giảm với vi sinh vật có bào tử Hai đệm pha mẫu dùng với vi khuẩn trường hợp enterobacteria khơng dùng đệm huyết gây thay đổi đặc tính miễn dịch vi khuẩn * Chuẩn bị ống đông khô: Ống đông khô rửa sau ngâm qua đệm với dịch acid loãng (HCl 2%) lại rửa sạch, làm khô chuẩn bị nút bông, ống trùng khô khử trùng theo phương pháp thông thường * Chuẩn bị mẫu trước đông khô: Lượng dịch huyền phù vi khuẩn đưa cẩn thận pipet pasteur vào ống đông khô khoảng 0.1- 0.2 ml Chú ý thao tác phải cẩn thận tránh dính mẫu vào thành hay phía ống đơng khơ * Bước tiền đông khô: Mục tiêu bước làm bay bị lạnh đơng tạo đá Trước tiến hành đông khô mẫu chuẩn bị qua bước tiền đơng (như trình bày trên) sau bước tiền đơng khơ tiến hành mẫu lắp vào hệ thống đơng khơ q trình làm nước điều kiện lạnh tiến hành khoảng 239 * Tạo chỗ thắt ống đông khô: Sau bước tiền đông khô, yêu cầu phải tạo vết thắt Việc tạo vết thắt thực với hệ thống đèn hàn Tuy nhiên, sở bảo quản vi sinh vật sử dụng hệ thống hàn tạo vết thắt thiết bị tự động * Hậu đông khô: Trong bước mẫu lại tiếp tục làm khô độ ẩm cuối đạt khoảng 1% Thời gian cho bước thay đổi từ 1-2 * Hàn ống đông khô: Việc hàn ống trực tiếp thiết bị đông khơ (manifold) cần có kinh nghiệm cẩn thận Trước hết phải tiến hành khố van sau thực thao tác hàn ống đông khô * Kiểm tra độ chân không ống đông khô: Người ta sử dụng thiết bị đèn phát mức độ chân không Với mẫu đạt độ chân không cần thiết xuất màu xanh tím nhạt Đối với mẫu khơng đạt tiêu chuẩn khơng có tín hiệu màu tím đậm * Kiểm tra khả sống mẫu: Đếm số lượng tế bào phương pháp chủ yếu để đánh giá chất lượng bảo quản Việc đếm thực trước sau đơng khơ Các bước kiểm tra thực sau năm để đánh giá chất lượng mẫu đơng khơ Nói chung khả sống vi sinh vật có bào tử cao vi sinh vật khơng có bào tử loại gram dương cao vi sinh vật gram âm Tuy nhiên, với vi sinh vật kỵ khí u cầu phải tiến hành theo qui trình, tránh vi sinh vật tiếp xúc với oxy * Bảo quản mẫu: Mẫu thông thường bảo quản 4OC hay nhiệt độ phòng b Phương pháp giữ lạnh sâu - Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào ni cấy mơi trường nhiệt độ thích hợp đầu pha log 240 - Pha dịch tế bào với glycerol DMSO trùng trước để đạt nồng độ cuối 10% mật độ tế bào 106 - Dịch huyền phù tế bào đưa vào ống lạnh sâu đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để dịch xanh metylene 0.05% để phát ống bị rị rỉ) Tồn mẫu để nhiệt độ phịng 30 phút cân áp suất thẩm thấu ngồi tế bào Trong trường hợp có nitơ lỏng mẫu chuyển sang bình nitơ lỏng Mẫu đưa vào lạnh sâu cần theo tốc độ định Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3 OC/phút để đạt tới nhiệt độ -30OC ban đầu Sau mẫu làm lạnh tiếp với tốc độ cao 10-15 OC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh cần thiết (-100OC đến -80 OC) Hiện nay, có thiết bị làm lạnh sâu chương trình hố với tốc độ mong muốn Tuy nhiên, đơn giản mẫu ban đầu đặt đá khơ sau lại đưa vào tủ lạnh sâu đặt thời gian vài để đạt nhiệt độ -65OC - Hoạt hoá mẫu: mẫu lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) hoạt hoá cách làm tan nhanh tới mức (thơng thường đưa vào tủ ấm 37 OC 40-60 giây) Như vậy, theo cách đạt khả sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản c Một số phương pháp bảo quản khác: Bảo quản gelatin silicagel 5.1.2 Bảo quản xạ khuẩn: Xạ khuẩn mang đặc tính vi khuẩn nấm sợi (có sợi bào tử) cần có phương pháp bảo quản thích hợp Thơng thường xạ khuẩn bảo quản theo cách thông thường cấy truyền, đông khô lạnh sâu với vi khuẩn Tuy nhiên, có phương pháp kinh tế mà đảm bảo chất lượng chủng bảo quản mà chúng tơi trình bày đây, phương pháp bảo quản đất Các bước tiến hành bảo quản đất: - Chuẩn bị đất: lấy đất vườn làm khô 150 OC để làm chết vi sinh vật có bào tử trứng giun có Đất sau trùng nghiền nhỏ qua lưới có kích thước 30 mesh Đất sau nghiền đưa vào ống nghiệm chuẩn bị nút trùng 241 60 phút Trước tiến hành bảo quản phải kiểm tra nhiễm khuẩn đất cách cấy vòng que cấy đất từ ống nghiệm đặt vào môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn giữ 24 OC, 28 OC 37 O C, kiểm tra sau 2-4 ngày - Chuẩn bị dịch huyền phù xạ khuẩn Nước cất vô trùng dùng để tạo dịch huyền phù xạ khuẩn (hay bào tử xạ khuẩn) từ ống thạch nghiêng Lấy ml dịch huyền phù cho vào ống nghiệm để khô nhiệt độ phòng (24OC) thời gian tháng Đập nhẹ vào thành ống cho hạt tách bảo quản mẫu 4OC - Hoạt hoá mẫu đơn giản cách lấy vòng que cấy mẫu đưa lên môi trường (thạch dịch thể) để nhiệt độ thích hợp 5.2 Bảo quản vi tảo Vi tảo thông thường bảo quản theo phương pháp: Cấy truyền, lạnh sâu đông khô Các phương pháp trình bày chi tiết phần vi khuẩn Một số điểm cần ý bảo quản vi tảo chỗ: Nên dùng tế bào già pha cân bằng, phương pháp lạnh sâu cho kết tốt phương pháp đông khô 5.3 Các phương pháp dùng cho bảo quản nấm sợi a Phương pháp cấy truyền: Phương pháp thường ứng dụng với sợi nấm có bào tử Các chủng nấm sợi ni mơi trường thạch thích hợp sợi nấm phát triển đến mức độ cực đại, sau trình hình thành bào tử, ống giống bảo quản theo cách khác nhau: - Các ống thạch để tủ lạnh (4-7 OC) - Bảo quản thạch lớp dầu: Các ống thạch bảo quản lớp dầu parafin có tỷ trọng tương đối 0.83- 0.89 khử trùng nhiệt độ 121 OC 15 phút Lớp dầu cách bề mặt thạch khoảng cm Nhiệt độ bảo quản 15-20 OC - Bảo quản nước, nấm sợi nuôi môi trường thạch đĩa Sau sợi phát triển cực đại cắt thành miếng nhỏ kích thước khoảng mm2 cho vào lọ nước trùng Bảo quản nhiệt độ phịng b Bảo quản nấm sợi có bào tử silicagel: 242 Chuẩn bị: - Lọ đựng silicagel (10-15ml) có nắp chịu nhiệt (sắt hay nhựa) trùng nhiệt độ 170 OC - Silicagel: Loại suốt, khơng có màu, kích thước số lượng hạt silicagel đưa vào khơng q 1/3 thể tích lọ, trùng nhiệt độ 170 °C - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng, môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào lọ đựng silicagel Chú ý silicagel hút nước sinh nhiệt việc đưa dịch bào tử vào phải thực chậu nước đá Lượng dịch bào tử đưa vào khơng vượt q 1/3 thể tích hạt silicagel lọ Sau dùng tay lắc đảm bảo hạt silicagel dính dịch bào tử nấm sợi Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, môi trường nhiệt độ thích hợp - Lọ silicagel đậy nắp cẩn thận khơng vặn chặt (nới 1,5 vịng) sau giữ bình hút ẩm (độ ẩm 35-40%), 25OC tuần Vặn chặt nút quấn giấy parafil giữ 4OC -Kiểm tra độ sống sót sau bảo quản: -Mẫu silicagel °C, dùng que cấy vô trùng lấy hạt silicagel để mặt thạch mơi trường mầm thóc (Maltagar), lắc cho hạt silicagel tiếp xúc lên mặt môi trường Để nhiệt độ thích hợp, kiểm tra tra khuẩn lạc nấm theo thời gian thích hợp c -Bảo quản nấm sợi có bào tử theo phương pháp đông khô (freez-drying): Chuẩn bị: 243 - Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170OC - Môi trường sữa tách bơ (Skimmilk) 20% khử trùng ướt (115OC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) -Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml sữa trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 0,3 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng Dán nhãn, ghi thông tin cần thiết mã số chủng, ngày bảo quản, mơi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút hay giấy bạc - Giữ -80°C trước tiến hành đông khô, đồng thời bật máy Dura-Stop, nhiệt độ đạt -40OC, đưa mẫu vào tủ đông khô Dura-Stop, bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -55OC, tăng nhiệt độ Dura-Stop lên -5OC, để qua đêm - Tăng nhiệt độ Dura-Stop lên 25°C, đạt nhiệt độ cần thiết, tắt máy hút chân không không tắt Dura-Dry - Tắt Dura-Stop, nối tube mẫu vào hệ thống manifold, bật máy Dura-Dry, tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55OC Chú ý: Trong trường hợp dùng Dura-Dry thực sau: - Tiến hành bước 1,2,3,4 - Mẫu để tiền đông khô -80°C Bật máy DuraDry, đạt nhiệt độ -60oC đến -55oC, độ chân không 45 minitor, gắn ống mẫu với hệ thống manifold tiến hành hàn ống độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC Kiểm tra độ sống sót sau đơng khơ: - Mở ống đơng khơ cách đốt nóng đầu hàn đèn cồn làm lạnh đột ngột cồn đốt 244 - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 1ml nước cất vô trùng từ ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất vô trùng làm tan mẫu đông khơ Hút tồn dịch huyền phù sang ống nghiệm chứa 9,8 ml nước cất Trộn nhỏ vào vị trí khác (mỗi vị trí giọt) mơi trường thạch đĩa thích hợp nghiêng cho dịch chảy dọc theo hướng hình vẽ: Hình 7.5 PP kiểm tra độ sống sót vi sinh vật sau đơng khơ - Sau đậy nắp đĩa, bao quanh parafil để nhiệt độ thích hợp - Cách đánh giá: Rất tốt: ≥ 100 khuẩn lạc Khá: 50 – 100 khuẩn lạc Trung bình: 10-50 khuẩn lạc Kém: < 10 khuẩn lạc Không mọc Bảo quản thực với mẫu từ trở lên Tuy nhiên, có số nấm sợi mà khuẩn lạc mọc tràn lan đánh sau: Nếu khuẩn lạc mọc khắp bề mặt đĩa tốt Mẻ đông khô thành cơng số khuẩn lạc mọc chiếm nửa bề mặt môi trường đĩa petri Các mẫu có số lượng khuẩn lạc mọc mức phải làm tăng mật độ bào tử trước đông khô thay đổi môi trường sinh bào tử, chuẩn bị dịch huyền phù bào tử từ 3-4 ống nghiệm bào tử nấm sợi d Bảo quản nấm sợi phương pháp đông khô trực tiếp: 245 Phương pháp đông khô trực tiếp thực tương tự phương pháp đơng khơ trình bày thực sau: Chuẩn bị: - Ống đông khô rửa (sonic cleaner) 15 phút sau khử trùng 170oC - Môi trường L-drying chuẩn có thành phần sau: Đệm phosphat: 0.1M : 100 ml Monosodium glutamat: g Adonitol: 1.5 g (Khử trùng 115oC/20 phút) - Ống thạch nghiêng (có thể đĩa petri) chứa bào tử nấm sợi, tuỳ theo chủng môi trường nuôi cấy mà thời gian thu bào tử thích hợp khác (10-15 ngày) Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur lấy khoảng 3-4 ml môi trường trùng cho vào ống nghiệm chứa bào tử nấm sợi, dùng que cấy tạo dịch huyền phù bào tử nấm có mật độ cao (đối với số chủng có số lượng bào tử thấp tạo dịch bào tử từ vài ống thạch bào tử khác nhau) - Dùng pipet pasteur lấy dịch bào tử cho vào ống đông khô (0,2 ml), thông thường chuẩn bị 13 ống cho chủng, dán nhãn, ghi thông tin cần thiết số mã chủng, ngày bảo quản, mơi trường nhiệt độ thích hợp Sau đậy nút bơng hay giấy bạc - Đồng thời bật máy Dura-Dry, mức độ chân không đạt 45 minitor, nhiệt độ -75oC, nối ampoule mẫu vào hệ thống manifold (chú ý khoá van chân không nối ampoule mẫu với tube manifold sau lại mở ra, để đảm bảo độ chân khơng cần thiết làm đông khô phải đưa mẫu vào tín hiệu đèn thị cho phép) Khi độ chân không đạt 45-48 minitor, nhiệt độ -55oC tiến hành q trình làm khơ - Hàn kín ampoule mẫu: -Khi máy Dura-Dry chạy để đảm bảo độ chân không cần thiết, khoá van cho ampoule mẫu tiến hành hàn với mẫu vị trí ống bị thắt Dùng lửa gas để đốt nóng phần ống 246 thắt cho phía xoay cho thuỷ tinh chảy bịt kín ống Sau dùng lửa gas để cắt rời phần (nối với manifold) phần chứa mẫu Hết đợt lại khoá van ampoule mẫu hàn Kiểm tra chất lượng sau bảo quản: - Để kiểm tra độ sống sót mẫu nấm sợi bảo quản, thực theo cách mô tả phần đông khô - Kiểm tra độ chủng: mẫu cấy môi trường thích hợp quan sát hình thái đặc điểm sinh học đặc trưng cần thiết để đánh giá khả tạp nhiễm đặc tính sinh học - Thí nghiệm đánh giá nhanh thời gian bảo quản: mẫu sau đông khô trực tiếp giữ 37oC tuần Độ sống sót mẫu bảo quản giảm tuần 37oC tương đương với bảo quản 10 năm 4oC e Bảo quản nấm sợi phương pháp lạnh sâu -80 oC nitơ lỏng (-196 oC): Chuẩn bị: - Chuẩn bị dung dịch glycerol 10% (3 ml ống nghiệm) khử trùng 121 oC 15 phút Ống nhựa nút xoáy (2 ml), rửa sonic cleaner, khử trùng 170 oC - Chuẩn bị mẫu nấm sợi mơi trường thạch đĩa có lượng bào tử lớn Cách tiến hành: - Dùng pipet pasteur hút khoảng 0,3 ml glycerol trùng vào ống nhựa đựng mẫu Sau dùng dao vơ trùng cắt lấy miếng nhỏ môi trường chứa sợi bào tử nấm sợi cho vào ống nhựa Lượng glycerol đủ để phủ lên miếng thạch mẫu, đậy nút bao băng parafil sau dán nhãn - Mẫu trước tiên phải để 5oC (tạo điều kiện cho glycerol vào tế bào), sau làm lạnh sâu tử 25oC xuống -55oC với tốc độ 1oC/phút Trong trường hợp khơng có thiết bị làm lạnh để 20oC giờ, sau chuyển sang -80oC hay nitơ lỏng (-196oC) Chú ý: Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu thích hợp với hầu hết nấm sợi sinh bào tử tế bào có vách ngăn Nhưng phương pháp tỏ khơng thích hợp với nấm sợi khơng sinh bào tử 247 khơng có vách ngăn Trong trường hợp cần nuôi cấy nấm sợi mơi trường thích hợp để tạo bào tử Nếu khơng khắc phục phải tiến hành ni môi trường dịch thể để thu lấy sinh khối giữ glycerol 10% Đánh giá khả sống mẫu bảo quản: - Làm tan mẫu (mẫu lấy từ tủ lạnh sâu -80oC nitơ lỏng o 196 C) bể ổn nhiệt 37oC phút - Dùng que cấy lấy miếng môi trường thạch đặt vào vị trí khác mơi trường thạch đĩa thích hợp Để nhiệt độ thích hợp xem khả mọc sau thời gian thích hợp (2-4 ngày) Chú ý lấy mẫu cần lấy sợi nấm để đưa vào môi trường thạch đĩa Một số điều ý bảo quản nấm sợi: - Ảnh hưởng ánh sáng với trình hình thành bào tử: Phần lớn trường hợp thành công phương pháp bảo quản phụ thuộc vào số lượng bào tử Ánh sáng tác nhân quan trọng trình hình thành bào tử nấm sợi, ánh sáng có bước sóng ngắn có tác dụng kích thích q trình hình thành bào tử, ánh sáng gần vùng cực tím (3100 – 4000 nm) có tác dụng thay đổi màu sắc kích thước khuẩn lạc - Thành phần mơi trường: Nói chung mơi trường có thành phần dinh dưỡng nghèo thường cho lượng bào tử lớn - Tránh nhiễm tạp mạt (mite), chủng nấm sợi lưu giữ thường bị mạt phá hoại Đầu tiên chúng ăn chủng giống làm hỏng, sau gây tạp nhiễm mang bào tử vi khuẩn thể từ ống sang ống khác Vì lý mà cần có biện pháp hạn chế mạt, thông thường chủng giống phải bảo quản nơi sạch, nhiệt độ 4-8oC 5.4 Phương pháp bảo quản nấm men Tương tự nấm sợi, có nhiều phương pháp bảo quản nấm men Chúng đề cập đến phương pháp thông dụng sử dụng sưu tập nấm men lớn giới a Phương pháp cấy truyền: Cấy truyền phương pháp đơn giản, nhanh rẻ tiền thông dụng nhất, nhiên hạn chế phương pháp dễ tạp nhiễm thay đổi đặc điểm sinh học, tính trạng di truyền bất lợi bảo quản theo phương pháp Cấy truyền môi trường dịch thể: 248 - Cách tiến hành đơn giản chuẩn bị 10 ml môi trường nuôi cấy nấm men (thông thường môi trường YM Yeast extract – Maltose) lọ McCartney khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phút Thường làm lọ cho chủng bảo quản - Một vòng que cấy chủng nấm men bảo quản đưa vào môi trường thao tác vô trùng giữ 25oC 72 Phải kiểm tra phát triển chủng bảo quản - Sau mẫu giữ 4oC - Thông thường theo cách thời gian bảo quản chủng thường thay đổi từ 2- tháng Cấy truyền môi trường thạch: Cấy truyền môi trường thạch tương tự môi trường dịch thể môi trường bổ sung thạch (1.6%) Giống sau cấy giữ 72 nhiệt độ thích hợp để đạt độ phát triển cần thiết, sau để 4-8oC Theo phương pháp giống có thời gian sống lâu phương pháp cấy truyền dịch thể, thông thường giống bảo quản từ 3-6 tháng Thời gian bảo quản kéo dài từ 2-3 năm ống giống bảo quản dầu parafin trùng đổ lên môi trường thạch cho tạo lớp dày khoảng 1cm b Phương pháp bảo quản lạnh sâu đông khô (xem phần phương pháp dùng cho bảo quản vi khuẩn xạ khuẩn) Tóm tắt Các vi sinh vật sinh trưởng phát triển môi trường, chịu tác động nhân tố mơi trường, đặc tính sinh lý chung dễ dàng bị biến đổi Các phương pháp bảo quản chủng giống vi sinh vật nhằm mục đích lưu trữ giống vi sinh vật phân lập được, giống vi sinh vật có đặc tính q giống vi sinh vật quan tâm Mục tiêu phương pháp bảo quản kéo dài tuổi thọ vi sinh vật khơng làm thay đổi làm thay đổi tính chất chúng Câu hỏi ơn tập Trình bày phương pháp bảo quản giống vi khuẩn? 2, Trình bày phương pháp bảo quản giống nấm mốc 249 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyền, Phạm Văn Ty Vi sinh vật học Nhà xuất Giáo dục 1998 Nguyễn Thành Đạt Cơ sở học Vi sinh vật Nhà xuất Đại học Sư phạm 2002 Phạm Thành Hổ Sinh học đại cương Nhà xuất Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh.2002 Biền Văn Minh, Phạm Văn Ty, Kiều Hữu ảnh, Phạm Hồng Sơn, Phạm Ngọc Lan, Nguyễn Thị Thu Thủy Giáo trình vi sinh vật học Nhà xuất Đại học Huế 2006 Trần Linh Thước Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm Nhà xuất Giáo dục 2002 250 ... CHƯƠNG I MỞ ĐẦU VỀ VI SINH VẬT HỌC ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC 1.1 Đối tượng vi sinh vật học đại cương 1.2 Sự phân bố vi sinh vật 10 1.3 Vai trò vi sinh vật 10... MỞ ĐẦU VỀ VI SINH VẬT HỌC ĐỐI TƯỢNG VÀ NHIỆM VỤ CỦA VI SINH VẬT HỌC 1.1 Đối tượng vi sinh vật học đại cương Xung quanh chúng ta, sinh vật lớn mà nhìn thấy được, cịn có vơ vàn vi sinh vật nhỏ bé,... (Algology) virus học (Virolory), Vi? ??c phân chia lĩnh vực cịn dựa vào phương hướng ứng dụng Do thấy cịn có y sinh vi sinh vật học, vi sinh vật học thú y, vi sinh vật công nghiệp, vi sinh vật học