Đang tải... (xem toàn văn)
CÁC PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN PROTEIN
1 1 C C á á c phương ph c phương ph á á p thu nh p thu nh ậ ậ n protein n protein C C á á c phương ph c phương ph á á p chi p chi ế ế t r t r ú ú t v t v à à tinh s tinh s ạ ạ ch protein đ ch protein đ ề ề u d u d ự ự a a trên nh trên nh ữ ữ ng t ng t í í nh ch nh ch ấ ấ t h t h ó ó a lý c a lý c ủ ủ a protein như đ a protein như đ ộ ộ t t í í ch ch đi đi ệ ệ n, k n, k í í ch thư ch thư ớ ớ c phân t c phân t ử ử , , đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein c a protein c ầ ầ n n chi chi ế ế t r t r ú ú t. Nhi t. Nhi ề ề u protein còn liên k u protein còn liên k ế ế t v t v ớ ớ i c i c á á c phân t c phân t ử ử sinh sinh h h ọ ọ c kh c kh á á c nên vi c nên vi ệ ệ c chi c chi ế ế t r t r ú ú t c t c á á c protein n c protein n à à y còn ph y còn ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o b o b ả ả n ch n ch ấ ấ t c t c ủ ủ a c a c á á c liên k c liên k ế ế t. t. Mu Mu ố ố n thu nh n thu nh ậ ậ n đư n đư ợ ợ c c c c á á c protein nguyên th c protein nguyên th ể ể t t ứ ứ c l c l à à protein c protein c ó ó t t ấ ấ t c t c ả ả t t í í nh ch nh ch ấ ấ t t t t ự ự nhiên đ nhiên đ ặ ặ c trưng c c trưng c ủ ủ a n a n ó ó , , c c ầ ầ n s n s ử ử d d ụ ụ ng c ng c á á c bi c bi ệ ệ n ph n ph á á p kh p kh á á c nhau. c nhau. 2 2 Nhi Nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ Đ Đ ể ể t t á á ch c ch c á á c protein kh c protein kh á á c nhau d c nhau d ự ự a trên k a trên k ế ế t t t t ủ ủ a c a c ủ ủ a a ch ch ú ú ng, n ng, n gư gư ờ ờ i ta c i ta c ó ó th th ể ể s s ử ử d d ụ ụ ng phương ph ng phương ph á á p bi p bi ế ế n t n t í í nh nh ch ch ọ ọ n l n l ọ ọ c nh c nh ờ ờ t t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a nhi a nhi ệ ệ t. t. M M ộ ộ t đi t đi ề ề u c u c ầ ầ n lưu ý l n lưu ý l à à ch ch ỉ ỉ nên d nên d ù ù ng đ ng đ ố ố i v i v ớ ớ i trư i trư ờ ờ ng h ng h ợ ợ p c p c á á c protein enzyme b c protein enzyme b ề ề n n v v ớ ớ i nhi i nhi ệ ệ t t . D . D ị ị ch protein enzyme đư ch protein enzyme đư ợ ợ c gi c gi ữ ữ ở ở 50 50 - - 70 70 0 0 C C trong th trong th ờ ờ i gian x i gian x á á c đ c đ ị ị nh, s nh, s au đ au đ ó ó protein t protein t ạ ạ p đã b p đã b ị ị bi bi ế ế n n t t í í nh đư nh đư ợ ợ c lo c lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ b b ằ ằ ng c ng c á á ch l ch l ọ ọ c ho c ho ặ ặ c ly tâm. c ly tâm. Như v Như v ậ ậ y, y, d d ị ị ch chi ch chi ế ế t protein thô b t protein thô b ề ề n v n v ớ ớ i nhi i nhi ệ ệ t c t c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c thu c thu nh nh ậ ậ n b n b ằ ằ ng c ng c á á ch cho k ch cho k ế ế t t t t ủ ủ a không thu a không thu ậ ậ n ngh n ngh ị ị ch ph ch ph ầ ầ n n l l ớ ớ n c n c á á c protein t c protein t ạ ạ p. p. 3 3 Nhi Nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ Đ Đ ể ể thu nh thu nh ậ ậ n ch n ch ế ế ph ph ẩ ẩ m protein theo phương m protein theo phương ph ph á á p k p k ế ế t t t t ủ ủ a thu a thu ậ ậ n ngh n ngh ị ị ch b ch b ằ ằ ng c ng c á á c mu c mu ố ố i trung i trung t t í í nh, c nh, c ầ ầ n ti n ti ế ế n h n h à à nh nh ở ở nhi nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ th th ấ ấ p, p, đ đ ố ố i v i v ớ ớ i dung i dung môi h môi h ữ ữ u cơ c u cơ c ầ ầ n ti n ti ế ế n h n h à à nh nh ở ở nhi nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ dư dư ớ ớ i 0 i 0 0 0 C C tr tr á á nh bi nh bi ế ế n t n t í í nh đ nh đ ặ ặ c bi c bi ệ ệ t l t l à à protein enzyme. . protein enzyme. . 4 4 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Protein l Protein l à à c c á á c ch c ch ấ ấ t lư t lư ỡ ỡ ng t ng t í í nh, v nh, v ì ì v v ậ ậ y, trong c y, trong c á á c c dung d dung d ị ị ch acid v ch acid v à à ki ki ề ề m ch m ch ú ú ng s ng s ẽ ẽ b b ị ị phân ly như phân ly như sau: sau: Ki Ki ề ề m m Protein Protein - - COOH COOH Protein Protein - - COO COO - - + H + H + + acid acid acid acid Protein Protein - - NH2 NH2 Protein Protein - - NH3 NH3 + + Ki Ki ề ề m. m. 5 5 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Do c Do c á á c acid amin trong chu c acid amin trong chu ỗ ỗ i polypeptide còn t i polypeptide còn t ồ ồ n t n t ạ ạ i i nhi nhi ề ề u nh u nh ó ó m ch m ch ứ ứ c t c t ự ự do dư do dư ớ ớ i d i d ạ ạ ng c ng c á á c ion h c ion h ó ó a l a l à à nguyên nguyên nhân t nhân t ạ ạ o ra t o ra t í í nh đa đi nh đa đi ệ ệ n c n c ủ ủ a protein. Phân t a protein. Phân t ử ử protein r protein r ấ ấ t t d d à à i nên nh i nên nh ó ó m ion t m ion t ự ự do t do t ậ ậ n c n c ù ù ng c ng c ủ ủ a chu a chu ỗ ỗ i polypeptide i polypeptide không đ không đ á á ng k ng k ể ể , ch , ch ủ ủ y y ế ế u c u c á á c nh c nh ó ó m ch m ch ứ ứ c t c t ự ự do kh do kh á á c c c c ủ ủ a a chu chu ỗ ỗ i bên (R) quy i bên (R) quy ế ế t đ t đ ị ị nh t nh t í í nh ch nh ch ấ ấ t t t t í í ch đi ch đi ệ ệ n c n c ủ ủ a phân t a phân t ử ử protein (nh protein (nh ó ó m cacboxyl c m cacboxyl c ủ ủ a amino acid, OH c a amino acid, OH c ủ ủ a a Tyrosine, Tyrosine, - - NH2 c NH2 c ủ ủ a lysine, guamidin c a lysine, guamidin c ủ ủ a Arginine, a Arginine, inidazol c inidazol c ủ ủ a histidine) a histidine) M M ứ ứ c đ c đ ộ ộ ion h ion h ó ó a c a c ủ ủ a c a c á á c nh c nh ó ó m n m n à à y ph y ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o gi o gi á á tr tr ị ị pH. C pH. C á á c nh c nh ó ó m acid m acid ở ở d d ạ ạ ng anion trong môi trư ng anion trong môi trư ờ ờ ng ki ng ki ề ề m, m, c c á á c nh c nh ó ó m ki m ki ề ề m t m t ồ ồ n t n t ạ ạ i i ở ở d d ạ ạ ng cation trong môi trư ng cation trong môi trư ờ ờ ng ng acid acid 6 6 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) ở ở m m ộ ộ t gi t gi á á tr tr ị ị pH x pH x á á c đ c đ ị ị nh, m nh, m ỗ ỗ i phân t i phân t ử ử protein c protein c ó ó m m ộ ộ t t đi đi ệ ệ n t n t í í ch t ch t ổ ổ ng s ng s ố ố n n à à o đ o đ ấ ấ y m y m à à đ đ ộ ộ l l ớ ớ n c n c ủ ủ a n a n ó ó ph ph ụ ụ thu thu ộ ộ c c v v à à o s o s ố ố lư lư ợ ợ ng c ng c á á c nh c nh ó ó m t m t í í ch đi ch đi ệ ệ n dương v n dương v à à t t í í ch đi ch đi ệ ệ n âm. n âm. K K ế ế t qu t qu ả ả l l à à ở ở gi gi á á tr tr ị ị n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ ion hydro c ion hydro c ố ố đ đ ị ị nh, c nh, c á á c c protein kh protein kh á á c nhau trong h c nhau trong h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p s p s ẽ ẽ c c ó ó t t ổ ổ ng đi ng đi ệ ệ n t n t í í ch ch kh kh á á c nhau. Nhi c nhau. Nhi ề ề u phương ph u phương ph á á p d p d ù ù ng đ ng đ ể ể t t á á ch c ch c á á c h c h ỗ ỗ n n h h ợ ợ p protein đ p protein đ ề ề u d u d ự ự a v a v à à o đ o đ ặ ặ c t c t í í nh n nh n à à y. C y. C á á c phân t c phân t ử ử protein mang đi protein mang đi ệ ệ n t n t í í ch t ch t ổ ổ ng s ng s ố ố ( ( dương ho dương ho ặ ặ c âm) c c âm) c ù ù ng ng d d ấ ấ u đ u đ ẩ ẩ y nhau ra xa nên d y nhau ra xa nên d ễ ễ tan v tan v à à o dung d o dung d ị ị ch. M ch. M ỗ ỗ i m i m ộ ộ t t protein c protein c ó ó m m ộ ộ t gi t gi á á tr tr ị ị pH nh pH nh ấ ấ t đ t đ ị ị nh m nh m à à ở ở đ đ ó ó t t ổ ổ ng s ng s ố ố đi đi ệ ệ n n t t í í ch âm v ch âm v à à đi đi ệ ệ n t n t í í ch dương trong phân t ch dương trong phân t ử ử b b ằ ằ ng không. ng không. Gi Gi á á tr tr ị ị đ đ ó ó g g ọ ọ i l i l à à đi đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n c n c ủ ủ a protein. a protein. 7 7 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Đi Đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n c n c ủ ủ a c a c á á c acid amin trung t c acid amin trung t í í nh c nh c ó ó gi gi á á tr tr ị ị pH t pH t ừ ừ 5 5 ,6 ,6 - - 7 7 ,0; ,0; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh acid nh acid (dicarboxylic) l (dicarboxylic) l à à t t ừ ừ 3 3 ,0 ,0 - - 3 3 ,2; ,2; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh ki nh ki ề ề m (diamino) l m (diamino) l à à t t ừ ừ 9,7 9,7 - - 10,8. 10,8. Ở Ở đi đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n, n, đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein l a protein l à à th th ấ ấ p nh p nh ấ ấ t, protein d t, protein d ễ ễ b b ị ị k k ế ế t t t t ủ ủ a. D a. D ự ự a v a v à à o t o t í í nh ch nh ch ấ ấ t n t n à à y, y, ngư ngư ờ ờ i ta c i ta c ó ó th th ể ể t t á á ch t ch t ừ ừ ng ng ph ph ầ ầ n c n c á á c protein enzyme trong h c protein enzyme trong h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p. p. 8 8 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) Đi Đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n c n c ủ ủ a c a c á á c acid amin trung t c acid amin trung t í í nh c nh c ó ó gi gi á á tr tr ị ị pH t pH t ừ ừ 5 5 ,6 ,6 - - 7 7 ,0; ,0; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh acid nh acid (dicarboxylic) l (dicarboxylic) l à à t t ừ ừ 3 3 ,0 ,0 - - 3 3 ,2; ,2; đ đ ố ố i v i v ớ ớ i c i c á á c acid amin c c acid amin c ó ó t t í í nh ki nh ki ề ề m (diamino) l m (diamino) l à à t t ừ ừ 9,7 9,7 - - 10,8. 10,8. Ở Ở đi đi ể ể m đ m đ ẳ ẳ ng đi ng đi ệ ệ n, n, đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein l a protein l à à th th ấ ấ p nh p nh ấ ấ t, protein d t, protein d ễ ễ b b ị ị k k ế ế t t t t ủ ủ a. D a. D ự ự a v a v à à o t o t í í nh ch nh ch ấ ấ t n t n à à y, y, ngư ngư ờ ờ i ta c i ta c ó ó th th ể ể t t á á ch t ch t ừ ừ ng ng ph ph ầ ầ n c n c á á c protein enzyme trong h c protein enzyme trong h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p. p. 9 9 N N ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ proton (pH) proton (pH) gi gi ố ố ng như trư ng như trư ờ ờ ng h ng h ợ ợ p t p t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a nhi a nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ trong vi trong vi ệ ệ c c t t á á ch chi ch chi ế ế t protein, c t protein, c ó ó th th ể ể d d ù ù ng phương ph ng phương ph á á p bi p bi ế ế n t n t í í nh nh ch ch ọ ọ n l n l ọ ọ c nh c nh ờ ờ t t á á c d c d ụ ụ ng c ng c ủ ủ a pH c a pH c ủ ủ a môi trư a môi trư ờ ờ ng. D ng. D ị ị ch ch protein enzyme đư protein enzyme đư ợ ợ c gi c gi ữ ữ ở ở pH 5 trong th pH 5 trong th ờ ờ i gian x i gian x á á c c đ đ ị ị nh. Protein t nh. Protein t ạ ạ p b p b ị ị bi bi ế ế n t n t í í nh c nh c ũ ũ ng đư ng đư ợ ợ c lo c lo ạ ạ i b i b ỏ ỏ b b ằ ằ ng ng c c á á ch l ch l ọ ọ c ho c ho ặ ặ c ly tâm. V c ly tâm. V í í d d ụ ụ citochrom C c citochrom C c ũ ũ ng tan trong ng tan trong acid trichloracetic trong khi đ acid trichloracetic trong khi đ ó ó acid n acid n à à y l y l à à m k m k ế ế t t t t ủ ủ a ph a ph ầ ầ n n l l ớ ớ n protein. n protein. Như v Như v ậ ậ y c y c á á c protein b c protein b ề ề n v n v ớ ớ i acid c i acid c ó ó th th ể ể đư đư ợ ợ c t c t á á ch chi ch chi ế ế t b t b ằ ằ ng c ng c á á ch n ch n à à y. y. 10 10 T T á á c nhân h c nhân h ó ó a h a h ọ ọ c c C C ó ó th th ể ể d d ù ù ng mu ng mu ố ố i trung t i trung t í í nh ho nh ho ặ ặ c c c c á á c dung môi h c dung môi h ữ ữ u cơ u cơ đ đ ể ể t t á á ch chi ch chi ế ế t c t c á á c protein enzyme. c protein enzyme. Phương ph Phương ph á á p n p n à à y y đư đư ợ ợ c ti c ti ế ế n h n h à à nh d nh d ự ự a tr a tr ệ ệ n cơ s n cơ s ở ở : : đ đ ộ ộ hòa tan c hòa tan c ủ ủ a protein a protein ph ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o s o s ự ự tương t tương t á á c c c c ủ ủ a c a c á á c nh c nh ó ó m t m t í í ch đi ch đi ệ ệ n n trong phân t trong phân t ử ử protein v protein v ớ ớ i c i c á á c phân t c phân t ử ử nư nư ớ ớ c. S c. S ự ự tương tương t t á á c đ c đ ó ó (còn g (còn g ọ ọ i l i l à à s s ự ự hydrate h hydrate h ó ó a) s a) s ẽ ẽ b b ị ị gi gi ả ả m xu m xu ố ố ng khi ng khi thêm v thêm v à à o dung d o dung d ị ị ch protein enzyme c ch protein enzyme c á á c dung môi h c dung môi h ữ ữ u u cơ ho cơ ho ặ ặ c c c c á á c mu c mu ố ố i trung t i trung t í í nh. nh. Dung môi h Dung môi h ữ ữ u cơ thư u cơ thư ờ ờ ng d ng d ù ù ng l ng l à à etanol, isopropanol, etanol, isopropanol, acetone ho acetone ho ặ ặ c h c h ỗ ỗ n h n h ợ ợ p c p c á á c lo c lo ạ ạ i rư i rư ợ ợ u u . . [...]... bào, người ta còn phải dùng các yếu tố vật lý và hóa học khác như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu cơ như butanol, acetone, glycerin, ethylacetat và chất tẩy (detergent) Các hóa chất tốt cho việc phá vỡ các bào quan của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ 20 Chiết rút protein Sau khi đã phá vỡ cấu trúc của các tế bào tiến hành chiết xuất các protein enzyme bằng các dung dịch đệm thích hợp,... dung dịch muối trung tính hoặc bằng nước đối với protein enzyme nội bào hoặc bằng ly tâm tách tế bào đối với các protein enzyme ngoại bào: việc chọn phương pháp tách chiết protein enzyme tùy thu c vào tính chất của protein enzyme cần nghiên cứu 21 Tách enzyme Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống Việc điều chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất... và làm sạch protein emzyme, vì phương pháp khá đơn giản 14 Phá vỡ tế bào Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào) 15 Phá vỡ tế bào Các protein enzyme nội bào có thể tồn... cấu trúc của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch 16 Phá vỡ tế bào Protein enzyme có trong tất cả các cơ thể động vật, thực vật và vi sinh vật Sau khi được tổng hợp nó có thể được tiết ra ngoài tế bào tồn tại trong các dịch cơ thể, dịch môi trường (gọi là protein enzyme ngoại bào) hoặc được giữ lại bên trong tế bào (protein enzyme nội bào) 17 Phá vỡ tế bào Các protein enzyme... sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: 1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt (phương pháp nổi ) 2 Phương pháp nuôi cấy bề sâu (phương pháp chìm) 35 Tách enzyme Phương pháp nuôi cấy bề mặt Người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên bề mặt các hoạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo, cám nếp, cám mì, bắp xay nhỏ ) Để môi trường... trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội... trong tế bào chất và các bào quan (nhân, microsome, mitochondria v.v ) của tế bào Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng.Lớp màng này ở vi khuẩn đôi khi rất bền và dày Người ta còn thấy nhiều protein enzyme liên kết rất chặt chẽ với các bào quan của tế bào Các phân tử protein enzyme không có khả năng đi qua màng của tế bào và màng của các bào quan của tế bào Do đó để có thể chiết rút các protein enzyme nội... của các tế bào có chứa protein enzyme và chuyển chúng vào dung dịch 18 Phá vỡ tế bào Để việc phá vỡ có hiệu quả, ở mô thực vật, trước khi nghiền, người ta thường thái nhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô) Còn ở các mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết protein enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết 19 Phá vỡ tế bào Muốn tách được các protein trong các. .. lên một cách đáng kể, khác thường có khi còn tổng hợp enzyme mới: hiện tượng trên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợp gọi là chất cảm ứng Sự tổng hợp một lượng đáng kể enzyme gọi là siêu 34 tổng hợp enzyme Tách enzyme Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng Có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: 1 Phương pháp nuôi... phần các dung môi hữu cơ hoặc từng phần muối (NH4)2SO4 (có nồng độ bão hòa khác nhau) thì ta có thể tách từng phần hỗn hợp protein enzyme Tuy nhiên, để phân chia hoàn toàn những hỗn hợp phức tạp, phương pháp này không cho kết quả tốt vì độ hòa tan của một số protein bị tăng lên Mặc dầu vậy, cách kết tủa từng phần này cũng rất có lợi, đặc biệt là đối với giai đoạn đầu của việc tách chiết và làm sạch protein . như sau: sau: Ki Ki ề ề m m Protein Protein - - COOH COOH Protein Protein - - COO COO - - + H + H + + acid acid acid acid Protein Protein - - NH2 NH2 Protein Protein - - NH3 NH3 + + Ki Ki ề ề m không thu ậ ậ n ngh n ngh ị ị ch ph ch ph ầ ầ n n l l ớ ớ n c n c á á c protein t c protein t ạ ạ p. p. 3 3 Nhi Nhi ệ ệ t đ t đ ộ ộ Đ Đ ể ể thu nh thu nh ậ ậ n ch n ch ế ế ph ph ẩ ẩ m protein. ph c phương ph á á p thu nh p thu nh ậ ậ n protein n protein C C á á c phương ph c phương ph á á p chi p chi ế ế t r t r ú ú t v t v à à tinh s tinh s ạ ạ ch protein đ ch protein đ ề ề u d u d ự ự a