TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM –¶— Tài liệu thực hành PHÂN TÍCH THỰC PHẨM Người biên soạn: ThS Huỳnh Quang Phước TS Ngô Đại Nghiệp ThS Trần Thị Ngọc Mai KS Trần Thị Hồng Hạnh KS Nguyễn Thị Thu Hà Tài liệu lưu hành nội Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM –¶— NỘI QUI PHỊNG THÍ NGHIỆM Trang phục Sinh viên vào PTN phải đeo bảng tên, mặc áo blouse trắng mang giày, dép có quai hậu Giờ giấc v Sinh viên thí nghiệm qui định v Sinh viên khơng phép khỏi phịng thí nghiệm chưa có cho phép giáo viên hướng dẫn v Sinh viên không tự ý vô PTN chưa có đồng ý giáo viên giảng dạy Nhiệm vụ v Phải đọc tìm hiểu trước vào PTN v Nghe thực dẫn cụ thể giáo viên, không làm thí nghiệm ngồi giáo trình chưa có đồng ý giáo viên hướng dẫn v Có thái độ khoa học nghiêm túc PTN như: • Khi làm việc với hóa chất độc hại đến thân thể phải sử dụng thiết bị bảo hộ lao động găng tay, mặt nạ phòng độc • Khi làm việc với khí độc hay dung môi dễ bay phải làm việc tủ hút • Các dung dịch đổ bỏ có liên quan đến acid hay kiềm mạnh phải pha loãng thải bỏ từ từ, sau sử dụng vịi nước xối mạnh v Thiết lập qui trình làm việc chi tiết trình cho giáo viên liên quan v Vạch kế hoạch làm việc trước vào phịng thí nghiệm v Tồn trình làm việc phải ghi chép lại cẩn thận dạng nhật ký làm việc v Tuân thủ qui định phòng cháy chữa cháy v Trực nhật đổ rác nơi quy định sau buổi học Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2010 Phụ trách phịng thí nghiệm Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm AN TỒN PHỊNG THÍ NGHIỆM Cẩn thận tiến tiến hành thí nghiệm, khơng sử dụng máy móc, dụng cụ mà chưa biết cách sử dụng Phải hiểu rõ tính chất hóa chất để tránh tai nạn đáng tiếc Không dùng dụng cụ thủy tinh chưa rửa sạch, dụng cụ thủy tinh bẩn phải để riêng rửa sau dùng Tất chai lọ đựng hóa chất phải có ghi nhãn Khi dùng hóa chất phải đọc kỹ nhãn hiệu, dùng xong phải để lại chỗ cũ Nhãn ghi hóa chất tiếng nước ngịai phải xem xét cẩn thận chỗ chưa rõ phải tra cứu tài liệu, khơng đốn Hóa chất chưa dùng phải ghi lại để tránh nhầm lẫn Trên thực tế phần lớn hóa chất chất độc nên phải cẩn thận Khi hút hóa chất ống hút (pipette) phải sử dụng bóp cao su Khi theo dõi dung dịch sôi tinh thể chảy không để mặt gần; đổ chất lỏng vào cốc phải để xa mặt Nên dùng kính bảo hộ lao động Làm nguy hiểm phải ý người đứng bên cạnh Đun chất lỏng ống nghiệm phải để miệng ống quay phía khơng có người lúc đun không giữ ống nghiệm đứng yên mà phải lắc đều, đun toàn bề mặt ống nghiệm phần chứa chất lỏng Khi làm việc với chất dễ cháy tuyệt đối: • Khơng dùng lửa • Không làm việc bên cạnh lửa • Không để chất dễ cháy bên cạnh nguồn sinh nhiệt Khi làm việc với chất dễ nổ: nitrate, chlorate, pemanganate, bicromate, peoxyt… phải cẩn thận qui cách Khi làm việc với acid base mạnh phải: • Khơng để đổ ngồi • Khi đổ acid hay base vào nước pha loãng chúng (khơng đổ nước vào acid hay base) • Sang chai phải dùng phễu (khi rót phải quay nhãn lên phía trên, chai phải để bàn, tuyệt đối khơng cầm tay) • Khơng hút acid hay base chai cịn q • Khi đun sơi phải cho đá bọt bi thủy tinh … để điều hịa, tránh để bắn hay trào ngồi 10 Khi làm việc với dụng cụ điện: • Tay phải thật khô, chỗ làm việc phải khô Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm • Cẩn thận dùng điện có điện 220 Vol 11 Khi làm việc với dụng cụ thủy tinh • Tránh đỗ vỡ • Dụng cụ loại dùng cho việc đó, đun với dụng cụ thủy tinh chịu nhiệt dùng cho chân dụng cụ đặc biệt dùng chân không 12 Khi bị vỡ đường ống dẫn nước PTN, phải nhanh chóng khóa van đường ống dẫn nước nằm sau lưng phịng thí nghiệm Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm MỤC LỤC BÀI 1: PHA CHẾ HĨA CHẤT VÀ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MICRO-KJELDAHL BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY 12 BÀI 4: NITROGEN – NITRITE 14 BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITROSALICYLIC (DNS) 17 BÀI 6: SẮC KÝ CỘT (COLUMN CHROMATOGRAPHY) LY TRÍCH - KHẢO SÁT SẮC TỐ Ở LÁ CÂY 20 BÀI 7: SẮC KÝ BẢN MỎNG (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) PHÂN TÁCH HỖN HỢP VANILLIN VÀ β NAPHTHOL 24 BÀI 8: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRÊN GIẤY (PAPER CHROMATOGRAPHY) 32 Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 1: PHA CHẾ HÓA CHẤT VÀ XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ DUNG DỊCH Lý thuyết 1.1 Cách pha nồng độ a Nồng độ phần trăm theo khối lượng Thí dụ: Muốn pha 500g dung dịch sulfat đồng 20% từ tinh thể ngậm nước CuSO4.5H2O Ta biết: Phân tử khối CuSO4 khan nước: 160 Phân tử khối CuSO4.5H2O là: 250 Muốn pha 500g CuSO4 20% cần lượng CuSO4 khan nước là: (20.500)/100 = 100g Muốn có 160g khan nước ta phải cần 250g CuSO4.5H2O Vậy muốn có 100g CuSO4 khan nước phải cần lượng CuSO4.5H2O là: (250.100)/160= 156g Lượng nước cần đổ thêm: 500 – 156 = 334g b Nồng độ phần trăm khối lượng theo thể tích - Ta hịa tan lượng chất cân nước thêm nước thể tích • Thí dụ: Cần chuẩn bị lít dung dịch NaCl 30%thì ta cần lượng NaCl là: (300.1000)/100 = 300g để hòa tan nước thêm nước cho đủ thể tích lít - Trường hợp hóa chất có ngậm nước, cân ta phải tính thêm lượng nước phân tử trường hợp - Trường hợp chất hòa tan chất lỏng ta làm tương tự trên, nghĩa cân chất tan dung môi đem trộn lẫn với cho Nhưng việc cân chất lỏng không thuận lợi cho nên cần phải đưa chất lỏng đơn vị thể tích theo cơng thức: V = P/d - Mặt khác chất lỏng thường dùng có giới hạn hịa tan tối đa tính theo % • Thí dụ: H2SO4 hòa tan tối đa 96%, HCl 37%, H3PO4 65% cân chất lỏng phải tính số g có thực dung dịch để pha cho xác Nếu ta xem HCl 100% pha dung dịch 10% ta việc cân 10g HCl thêm vào 90ml nước trộn Nhưng thực HCl có 37% nên trọng lượng cân phải (100.10)/37 = 27,02g hay 27,02/1,19 = 23ml thêm lượng nước 100 – 27,02 = 72,98g hay 72,98ml c Nồng độ phân tử gam - Mol phân tử gam khối lượng chất tính gam khối lượng phân tử Dung dịch phân tử gam dung dịch chứa phân tử gam chất hịa tan lít Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - Để chuẩn bị dung dịch 1M chất đó, người ta tính khối lượng phân tử Lấy lượng cân xác đem hịa tan dung mơi cho thành lít dung dịch (dùng bình định mức) Khi phải đun nóng dung dịch hay phản ứng tỏa nhiệt hay thu nhiệt phải nhiệt độ bình thường (200C) thêm nước tới vạch • Thí dụ: Cần 0,5 lít dung dịch K2Cr2O7 0,1M; M(K2Cr2O7) = 294,2 Để chuẩn bị dung dịch K2Cr2O7 0,1M cần lấy 0,1M cần lấy 0,1 phân tử gam, nghĩa 29,42g K2Cr2O7 Để chuẩn bị 0,5 lít ta cần cân 29,42 0,5 = 14,71g pha bình định mức 500ml Nếu chất tan chất lỏng có phần trăm thấp (chưa 100%) ta phải ý tới nồng độ % tối đa chúng để tính tốn • Thí dụ: Pha HCl 1M từ HCl 37% M(HCl) = 36,5 Ta phải cân: (36,5 x 100)/37 ≈ 98,65g HCl Hay: 98,65/1,19 ≈ 83ml HCl Vậy ta phải lấy 83ml HCl 37% pha với nước cất thành lít dung dịch HCl có nồng độ 1M d Nồng độ đương lượng gam (N) Dung dịch nguyên chuẩn 1N chứa đương lượng gam chất tan lít Đương lượng gam định nghĩa theo trường hợp riêng biệt từ phương trình phản ứng dùng lúc định phân * Trong định phân acid hay base Đương lượng gam chất acid khối lượng chất cho phản ứng ion gam H+ Đương lượng gam chất base khối lượng chất cho phản ứng ion gam OH- • Thí dụ: H+Cl- + NaOH Na+Cl- + H2O phân tử gam HCl cho ion gam H+ Vậy đương lượng gam HCl = phân tử gam HCl 2H+SO4 + Na+OH- 2Na+SO4 + H2O phân tử gam H2SO4 cho ion gam H+ Vậy đương lượng gam H2SO4 = 1/2 phân tử gam H2SO4 Một phân tử gam NaOH cho ion gam OHTrang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Vậy đương lượng gam NaOH = phân tử gam NaOH Một dung dịch nguyên chuẩn HCl chứa 36,5g HCl lít Một dung dịch nguyên chuẩn H2SO4 chứa 98/2 = 49g H2SO4 lít Con số hay dùng để chia phân tử gam thí dụ gọi hệ số nguyên chuẩn độ Trong trường hợp tổng quát số gọi γ M/ γ gọi đương lượng gam phản ứng * Trong trường hợp phản ứng oxy hóa - khử Muốn tìm đương lượng chất hệ thống oxy hóa khử, người ta đem chia phân tử gam cho số điện tích trao đổi phản ứng mà chất tham gia Thí dụ: 2Na2S2O3 + I2 Na2S4O6 + 2NaI Số điện tích trao đổi phản ứng I Do N = M/I Cách pha: việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) tương tự pha nồng độ phân tử gam (M) thay đổi số phân tử gam (M) đương lượng gam (N) Lưu ý: Hầu hết hóa chất rắn khơng tinh khiết hồn tồn Khi tính tốn pha dung dịch từ hóa chất rắn cần phải tính tới độ tinh khiết hóa chất 1.2 Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch a Dung dịch chuẩn Trong q trình pha hóa chất có nhiều yếu tố làm sai số nồng độ như: việc cân đo khơng xác, chất chưa tinh khiết hay hút nước, để lâu bị thăng hoa hay bị oxy hóa Do người ta phải kiểm tra nơng độ thực dịch pha dựa vào chất ổn định hay nồng độ xác coi dung dịch chuẩn Các chất dùng dung dịch chuẩn phải bền vững để nồng độ chất phản ứng khơng thay đổi nhanh chóng với thời gian b Cách xác định nồng độ - Hai dung dịch phản ứng với thể tích có chuẩn độ Khi thể tích V1 dung dịch có chuẩn độ C1 (C1, N) tác dụng thể tích V2 dung dịch có chuẩn độ C2 (C2, N), viết số hóa trị gam tác dụng với nhau trường hợp: C1V1 = C2V2 - Hệ thức dùng để hiệu chỉnh lại nồng độ số dung dịch cho xác Thí dụ: Ta có dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N xác Một dung dịch NaOH ta pha lấy nồng độ định pha 0,1N Đem chuẩn độ ta thấy 10ml H2SO4 0,1N tác dụng với 11ml NaOH ta pha nồng độ NaOH ta pha là: C1 = (V2C2)/V1 = 0,091N Hệ số 10/11 = 0,91 hệ số hiệu chỉnh Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Thực hành pha chế hiệu chỉnh nồng độ dung dịch 2.1 Pha chế dung dịch Yêu cầu: Pha 100ml dung dịch Na2S2O3 0,1N từ Na2S2O3 rắn (Chú ý quan sát nhãn chai để tìm thơng tin hóa chất rắn) 2.2 Chuẩn độ dung dịch Na2S2O3 dung dịch K2Cr2O7 a Nguyên tắc Trong môi trường acid, với lượng thừa KI lượng xác định dung dung dịch K2Cr2O7 chuẩn: Cr2O72- + 9I- + 14H+ = 2Cr3+ + 3I3- + 7H2O Lượng I3- (phức dung dịch I2) tạo thành chuẩn độ dung dịch Na2S2O3 b Đặc điểm - Chuẩn độ mơi trường có [H+] = 0,2 ÷ 0,4M Mơi trường acid làm tăng tính định lượng cân chuẩn độ làm cho I- dễ oxi hóa oxi khơng khí - Để phản ứng hồn tồn, cần sử dụng KI thích hợp để [I-] ≥ 2% để yên hỗn hợp tối khoảng 10 phút - Định điểm cuối: sử dụng thị hồ tinh bột c Thí nghiệm * Hóa chất - Dung dịch chuẩn K2Cr2O7 0,05N - Na2S2O3 rắn - Dung dịch KI 10% - Dung dịch H2SO4 (1:5) HCl (1:1) - Dung dịch thị hồ tinh bột * Dụng cụ - Buret 25ml: cây/tổ - Erlen 100ml: cái/tổ - Pipet 5ml: cái/tổ - Bình định mức 100ml: cái/tổ * Cách tiến hành - Buret: Dung dịch mẫu Na2S2O3 - Erlen: hút V(ml) dung dịch K2Cr2O7 0,05N + 5ml H2SO4 + 5ml KI, để yên khoảng 10 phút Chuẩn độ đến dung dịch có màu vàng nhạt + vài giọt thị hồ tinh bột Chuẩn độ tiếp đến màu xanh (dung dịch khơng màu có màu xanh xám nhạt Cr3+) * Kết - Xác định V f từ lần chuẩn độ - Xác định hệ số hiệu chỉnh nồng độ Na2S2O3 dung dịch pha Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 2: ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG BẰNG PHƯƠNG PHÁP MICRO KJELDAHL Mục đích Phương pháp Micro - Kjeldahl thường dùng để xác định tổng lượng nitơ nguyên liệu Nguyên tắc Dưới tác dụng H2SO4 đậm đặc nhiệt độ cao, hợp chất chứa hữu bị phân hủy bị oxy hóa đến CO2 H2O cịn nitơ chuyển thành NH3 tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat Nguyên liệu, thiết bị, dụng cụ, hóa chất * Nguyên liệu • Mẫu bột đậu phộng sấy khơ đến ẩm hồn tồn * Thiết bị • Hệ thống cất đạm • Bếp điện • Tủ hút * Dụng cụ • Bình Kjeldahl • Pipette 10ml • Becher • Erlen • Muỗng inox • Dĩa nhựa • Bình định mức 250ml • Phễu thủy tinh • Burette 25ml • Giá burette • Kẹp burette • Bình xịt nước cất • Ống bóp cao su * Hóa chất • H2SO4 đđ • NaOH 45% • Hỗn hợp CuSO4 : K2SO4 theo tỉ lệ 1:3 • H2SO4 0,1N • Chỉ thị methyl red (hay phenolphtalein) Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm * Dựng đồ thị chuẩn Glucose Ống đối chứng Ống số Mẫu - 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 - - - - - - - 1,0 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 2,0 1,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 Dd glucose chuẩn 0,1% (ml) Dd mẫu (ml) Nước cất (ml) Thuốc thử DNS (ml) OD 540nm Đun (đun cách thủy) ống nghiệm phút Làm nguội đến nhiệt độ phòng, đo mật độ quang (OD) bước sóng 540nm * Lưu ý • Phản ứng tạo thành mơi trường kiềm mẫu có chứa acid phải trung hịa trước đem phân tích • Phương pháp đặc hiệu cho tất đường khử • Các mẫu đun để thời gian (20 phút) trước đo Các mẫu không đun bị thủy phân • Những dung dịch đường đậm đặc phải pha loãng cho màu dung dịch mằm lọt khoảng dãy màu ống đến Xử lý kết • Xây dựng đường chuẩn glucose y = f(x) với trục tung (y) mật độ quang, trục hồnh (x) hàm lượng glucose (mg) • Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ X (mg/ml) glucose dung dịch mẫu Tính tốn Hàm lượng glucose ngun liệu tính theo cơng thức: G= X V 100 f 1000.m mẫu (%) Với: m V X fmẫu : lượng mẫu đem thí nghiệm (g) : thể tích định mức dung dịch thí nghiệm (100ml) : nồng độ đường khử dung dịch mẫu tính theo glucose (mg/ml) : hệ số pha lỗng mẫu (nếu có) Trang 19 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 6: SẮC KÝ CỘT (COLUMN CHROMATOGRAPHY) LY TRÍCH VÀ KHẢO SÁT SẮC TỐ Ở LÁ CÂY Nguyên tắc Trong loại thường có chứa sắc tố gồm chlorophyll, carotenoid… Những loại sắc tố dùng rộng rãi thực phẩm y dược Ở thực hành này, dùng phương pháp sắc ký ngoại hấp (hấp phụ) để tách chúng khỏi hỗn hợp Trước hết sắc tố cho hấp phụ vào cột cellulose (cellulose xem phase cố định), sau dung ly chúng nhờ loại dung mơi khác (phase di động) để tách chúng khỏi hỗn hợp Như ta biết loại sắc tố có cây, đứng mặt phân cực tăng dần sau: carotene, xanthophyl, chlorophyll b, chlorophyll a Như ta cho dung ly chúng loại dung môi phân cực tăng dần: ether dầu hỏa, ether dầu hỏa 2% acetone, ether dầu hỏa 5% acetone cuối ether dầu hỏa 20% acetone Cuối ta tách sắc tố riêng biệt Sau có sắc tố, ta phải định tính định lượng chúng Về định tính, khảo sát phổ hấp thu Mỗi sắc tố có phổ hấp thu riêng, nhở mũi hấp thu cực đại cho phép xác định chúng Muốn định lượng riêng sắc tố, thông thường người ta dùng phương pháp thực nghiệm (gần đúng) cô lập chúng sắc tố dễ bị phân huỷ khó mà có chất chuẩn Hình 6.1: Trình tự thao tác sắc ký cột Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, ngun liệu * Thiết bị • Cân phân tích • Spectrophotometer • Thiết bị lọc chân không Trang 20 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm * Dụng cụ • Cột sắc ký • Becher • Pipette • Ống đong 50ml • Đũa thủy tinh • Ống nghiệm • Bình tia • Cối sứ • Giấy lọc φ * Hóa chất • Bột cellulose (dùng cho sắc ký hấp phụ) • Petrlium ether • Acetone * Nguyên liệu • Lá rau má Tiến hành * Ly trích sắc tố từ Nghiền nhuyễn cối sứ 20g tươi (thường dùng rau má) Thêm vào 30ml acetone, trộn nhiều lần 10 phút, lọc qua phễu Buchner hứng phần acetone Đổ chất trích acetone vào phễu chiết, ta trích lần thứ với ether dầu hỏa Muốn vậy, ta đỗ vào phễu chiết 10ml ether dầu hỏa, lắc nhẹ, để yên tách thành phase Bỏ phase dưới, thêm 50ml nước cất, lắc nhẹ (có thể có nhũ tương, thời gian lắc khoảng – 10 phút), bỏ phần (phase nước) làm khoảng 10 lần hết mùi acetone (có thể ngửi để xác định, dung dịch cịn chứa acetone khơng thể tách carotene được) Mục đích có hỗn hợp chứa sắc tố dung mơi vơ cực Nếu dung dịch cịn nhiều (>2ml), đun cách thuỷ đến thể tích cịn khoảng 2ml (đong thể tích xác dung dịch này) Các sắc tố hòa tan ether dầu hỏa tách nhờ phép sắc ký ngoại hấp cột cellulose * Sự phân ly sắc tố cột cellulose Để vào cột miếng bơng gịn nhỏ Ngâm ether dầu hỏa lượng vừa đủ bột cellulose 15 phút đổ vào cột, vừa đổ, vừa gõ nhẹ vào cột để bột cellulose lắng nhớ đừng cellulose khô Bề cao cột cellulose khoảng 12 – 15cm Để yên khoảng 15 phút cho cột ổn định, mở khóa cho dung môi chảy xuống mực ether dầu Trang 21 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm hỏa vừa xuống đến đầu cột cellulose, cho vào cách thận trọng 1ml dung dịch sắc tố ether dầu hỏa Mở khóa cho dung mơi chảy xuống, dung mơi cịn lại cột vừa chạm đến đầu cột, ta cho 1ml ether dầu hỏa, làm lần hỗn hợp sắc tố nằm hoàn toàn cột, lúc sắc tố ngoại hấp (hấp phụ) cột cellulose Sự phân ly thực với dung mơi ether dầu hỏa có nồng độ acetone cao dần Ether dầu hỏa Được dùng để dung ly carotene Khi phần ether dầu hỏa dùng để rửa hạ xuống đầu cột, ta đổ lượng vừa đủ ether dầu hỏa để dung ly (khoảng – 10ml), ta hứng phần dung dịch chứa carotene Ta cho chảy đến phần cột hết phần carotene Hỗn hợp ether dầu hỏa 2% acetone Đổ vào cột hỗn hợp ether dầu hỏa + 2% acetone, ta thấy xuất lớp: xanthophyl chlorophyll b, chlorophyll a (xanthophyl có màu vàng, chlorophyll b có màu xanh cây, chlorophyll a có màu xanh vỏ đậu) Cứ tiếp tục dung ly thu xanthophyl Phần xanthophyl thường nhiều, dung ly gần hết xanthophyl, ta bắt đầu cho ether dầu hỏa 5% acetone vào, sắc tố xanthophyl chlorophyll b di chuyển xanthophyl di chuyển nhanh Hỗn hợp ether dầu hỏa 5% aceton Hỗn hợp dùng để dung ly chlorophyll a Hỗn hợp ether dầu hỏa 20% aceton Chlorophyll b (xanh vỏ đậu) Chlorophyll a (xanh cây) Xanthophyl (vàng) Hình 6.2 Quá trình tách sắc tố cột Hỗn hợp dùng để dung ly chlorophyll b * Vẽ quang phổ hấp phụ sắc tố Để phần dung ly hứng vào quang phổ kế, đo độ dài song từ 350 -700nm tăng dần 20nm, ta có thay đổi mật độ quang sắc tố (Chọn dung dịch không ether dầu hỏa đo carotene, hỗn hợp ether dầu hỏa + 2% acetone đo xanthophyl…) Trang 22 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Vẽ quang phổ hấp thu sắc tố phân ly (trục tung mật độ quang, trục hoành độ dài sóng) Chú ý: Trong đo quang phổ hấp thu, nhớ đo mật độ quang dung dịch: - Chlorophyl a, chlorophyll b độ dài sóng 661,6 644,8nm - Với carotene xanthophyl trộn lẫn đo mật độ quang độ dài sóng 470nm Định lượng Các sắc tố định lượng theo công thức thực nghiệm sau: Ca = 11,24A661,6 – 2,04A644,8 Cb = 20,13A644,8 – 4,19A661,6 Ca+b = 7,05A661,6 + 18,09A644,8 1000A470 – 1,90Ca – 63,14Cb Cx+c = 214 Trong đó: Ca: nồng độ chlorophyll a (µg/ml) Cb: nồng độ chlorophyll b (µg/ml) Ca+b: nồng độ tổng cộng chlorophyll (µg/ml) Cx+c: nồng độ tổng cộng carotenoid (carotene xanthphyl) (µg/ml) Az: mật độ quang đo độ dài sóng z Lưu ý: tính nồng độ sắc tố, mật độ quang sắc tố tính đơn vị thể tích cố định Muốn vậy, chúng tơi đề nghị lúc đầu đong thể tích carotene giả sử V ml, sau với dung dịch xanthophyl, chlorophyll a chlorophyll b cô bếp cách thuỷ để loại bớt dung môi cho loại sắc tố tích thu V ml Trang 23 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm SẮC KÝ BẢN MỎNG (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) PHÂN TÁCH HỖN HỢP VANILLIN VÀ β NAPHTHOL BÀI 7: PHÂN TÁCH CÁC SẮC TỐ TỪ LÁ CÂY Sơ lược lý thuyết 1.1 Định nghĩa - Sắc ký trình tách cấu tử hỗn hợp dựa vào việc cấu tử phân bố khác pha tĩnh pha động Pha tĩnh cột nhồi (sắc ký cột) pha động dung môi hữu di chuyển ngang qua; pha tĩnh lớp mỏng chất hấp phụ, lúc pha động hút thấm lên lớp mỏng nhờ lực hút mao dẫn - Sắc ký mỏng kỹ thuật phân bố rắn - lỏng, pha lỏng di động cho lớp mỏng chất hấp phụ tráng lên phẳng vật liệu thủy tinh, nhôm plastic Do chất hấp phụ tráng lớp mỏng nên có tên gọi chung bảng mỏng 1.2 Chất hấp phụ - Có loại chất hấp phụ thông dụng alumin G silicagel G Chữ G chữ Gypsum (sulfat calcium) Trong chất hấp phụ dùng cho mỏng thường có 10 – 13% chất gypsum để làm chất kết dính Muốn có dung dịch sệt chất hấp phụ để tráng bản, dùng dung mơi clorur methylen để tạo dung dịch sệt, mịn, đồng không làm cho gypsum kết dính lại nên để dành dung dịch sệt nhiều ngày chưa kịp tráng Có thể sử dụng nước làm dung mơi, tráng khó tróc nên dùng để lâu có tượng vón cục 1.3 Tráng 1.3.1 Tráng khổ nhỏ (2-3x6-8) - Các kiếng rửa chất tẩy rửa thông dụng để loại hết vết dầu mỡ, vết bẩn; khơng rửa dung dịch acid cromic; tráng lại nước cất; dựng đứng cho nước sấy khô - Chuẩn bị dung dịch sệt: bình hình khối trụ khối chữ nhật có nắp đậy chứa sẵn 100ml CH2Cl2 100ml nước cất, vừa cho từ từ vừa khuấy 30g chất silicagel G alumin G - Nhúng bản: ghép kiếng sát khít vào nhúng ngập vào dung dịch sệt nói trên, rút lên từ từ khỏi dung dịch, để yên phút cho dung dịch chảy trả vào chai Tách riêng đặt nằm ngang 10 phút, dùng dao lam cạo bỏ phần bột dư thừa cạnh, sấy 30 phút 1100C Lấy ra, để nguội, bọc tờ giấy thấm bảo quản bình hút ẩm để nơi khô Trang 24 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm 1.3.2 Tráng khổ lớn (4x12, 5x10, 10x20…) - Chuẩn bị dung dịch sệt: theo dẫn nhà sản xuất tính tốn lượng silicagel lượng nước cho sau: 10x20, dùng 3g silicagel 10ml nước Cho bột khơ vào becher nhỏ có sẵn lượng nước cần thiết, dùng đũa khuấy đều, nhẹ hỗn hợp -2 phút tạo dung dịch sệt, đồng nhất, khơng có bọt khí - Tráng bản: tay trái cầm bản, nằm lịng bàn tay, dùng ngón tay cái, trỏ để giữ bên cạnh bản, tay phải cầm becher chứa dung dịch sệt, vừa rót vừa kéo phủ dung dịch lên đầu cạnh bản, vừa nghiêng nhẹ để dung dịch chảy xuống phủ hết bản; rót thêm vài giọt gel lên kiếng chỗ chưa tráng dùng mỏ nhọn becher châm bể bọt khí tráng Để yên nhiệt độ phịng cho mặt rối sấy khơ 1100C 30 phút, bảo quản kỹ để dùng dần 1.4 Lựa chọn dung môi - Việc chọn dung môi triển khai tùy thuộc vào mẫu cần tách ly Với mẫu chưa biết thành phân, chưa biết tài liệu tham khảo, cần thử nghiệm với nhiều loại dung môi khác nhau, từ loại không phân cực đến loại phân cực - Cách xác định nhanh loại dung môi phù hợp với mẫu: Chấm dung dịch mẫu thành nhiều chấm lên mỏng, vết chấm cách cm Dùng ống vi quản để đưa dung mơi có độ phân cực khác nhau, thấm nhẹ lên vết chấm mẫu, vết chấm mẫu giọt dung môi loại khác Sau chấm, dung mơi lan tỏa tạo thành vịng trịn Dùng viết chì khoanh trịn vết lan xa dung mơi Quan sát vịng trịn đồng tâm: dung mơi làm cho mẫu lan lúc với tiền tuyến dung mơi dung mơi q phân cực; dung môi mà mẫu nằm chỗ không đủ phân cực Hoặc để dễ quan sát nên thiết lập loạt thử nghiệm với bình triển khai sắc ký mỏng bình chứa dung môi với độ phân cực tăng dần: hexan, benzene, chloroform, eter diethyl, acetone, methanol Chuẩn bị bảng mỏng có chứa mẫu chất nhúng vào bình chuẩn bị Ghi nhận độ di động cấu tử mẫu: o Nếu dung môi khiến cho tất cấu tử nằm chỗ mức xuất phát dung mơi chưa đủ độ phân cực: dung môi không phù hợp o Nếu dung môi khiến tất cấu tử di chuyển hết lên mức tiền tuyến dung mơi dung mơi q phân cực: dung môi không phù hợp o Nếu dung mơi làm cho chất mẫu ban đầu tách thành nhiều vết khác cách gọn, rõ, sắc nét vị trí vết nằm khỏang 1/3 đến 2/3 chiều dài sắc ký dung mơi phù hợp o Nếu qua q trình triển khai mà nhận thấy hệ thống đơn dung môi không cho vết gọn, rõ, sắc nét cần thử triển khai với hệ thống hỗn hợp dung môi Dung môi tách tốt chất sắc ký mỏng thích hợp cho sắc ký cột Trang 25 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Tiền tuyến dung môi Vết chấm mẫu Dung môi không đủ phân cực Dung mơi phù hợp Dung mơi q phân cực Hình 7.1: Cách lựa chọn dung môi 1.5 Chấm - Trước chấm mẫu lên phải vạch lằn "mức xuất phát" cách đáy 1cm; lằn "mức tiền tuyến dung môi" cách đầu 0,5cm - Mẫu chất lỏng sử dụng trực tiếp Nếu mẫu chất rắn, lấy 1mg mẫu đặt lên mặt kiếng đồng hồ, hịa tan mẫu với vài giọt dung mơi dễ bay acetone Dùng vi quản nhúng nhẹ phần đầu nhọn vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn hút dung dịch mẫu vào vi quản, chấm nhẹ phần đầu nhọn có chứa mẫu lên mỏng điểm cách đáy 1cm Cẩn thận, nhẹ nhàng để đầu nhọn vi quản chạm nhẹ, không làm thủng lỗ bề mặt Chạm vào lấy thật nhanh để dung dịch mẫu thấm vào tạo thành điểm tròn nhỏ Thổi nhẹ lên vết chấm để dung môi bay mau không lan thành vết chấm to Có thể chấm thêm lên vết cũ vài lần để có vết đậm, rõ, đường kính khơng 2mm Nên chấm nhiều lần, lần lượng nhỏ dung dịch mẫu chấm lần với lượng mẫu lớn Nếu cần phải chấm lúc nhiều vết chấm vết chấm phải cách 1cm cách đáy 1cm cách cạnh bên 1cm 1.6 Chuẩn bị bình triển khai Bình hình khối trụ khối chữ nhật có đường kính lớn bề ngang Đặt tờ giấy lọc bao phủ mặt bình chừa khoảng để quan sát bên Tính tốn lượng dung mơi giải ly cho vào bình cho vào bình, lớp dung môi dày khỏang 0,5-0,7cm Cho dung môi giải ly vào bình, để yên 5-10 phút để bão hịa dung mơi bình Bản mỏng cầm thẳng đứng nhúng vào dung mơi bình, nhúng vào phải cẩn thận để hai cạnh bên khơng chạm vào thành bình; lúc vị trí vết chấm mẫu nằm cao cách mặt thống dung mơi khoảng 0,5cm Đậy nắp bình, dung môi hút lên nhờ lực hút mao dẫn Theo dõi mực dung môi lên đến vạch tiền tuyến dung mơi lấy khỏi bình Sấy nhẹ máy sấy Quan sát mắt dùng viết chì khoanh nhẹ vết thấy Cịn khơng thấy gì, nhìn đèn tử ngoại, iod phun với thuốc hình thích hợp Trang 26 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Hình 7.2: Bình triển khai sắc ký Hình 7.3: Tiến trình sắc ký 1.7 Hiện hình vết chấm sau triển khai - Thuốc hình thơng dụng Iod Muốn hình, cho mỏng triển khai, sấy khô vào lọ miệng rộng có nắp đậy, lọ có lọ nhỏ chứa vài tinh thể iod Đậy nắp lại, iod tỏa chiếm hết lọ vết hình rõ bảng mỏng Lấy mỏng khỏi lọ, dùng viết chì khoanh dấu vết theo thời gian iod thăng hoa vết biến - Phương pháp thông dụng nhìn đèn tử ngoại Các vết chất thấy vết sáng - Một phương pháp khác trộn thêm chất phát huỳnh quang vào chất hấp phụ tráng Lúc đèn tử ngoại mỏng phát sáng vết điểm tối - Đa số nhóm chức hữu nhìn thấy phun dung dịch acid sulfuric đậm đặc lên đặt vào lò sấy 1100C - Với hợp chất aldehyd, ceton phun thuốc thử 2,4-dinitrophenylhydrazin lên thấy xuất vết màu vàng, vàng cam đỏ - Với hợp chất phenol dùng FeCl3 - Để phát acid carboxylic dùng bromocresol lục - Các hợp chất dễ bị oxid hóa dùng permanganate kali, dicromat kali - Để phát amin dùng paradimethylaminobenzaldehyd - Các amino acid dùng dung dịch ninhydrin 1.8 Giá trị Rf - Trong trình giải ly, hợp chất phải ln di chuyển đọan dài định so với đoạn dài mà dung môi di chuyển Tỷ lệ Rf (Ratio to front) Đoạn đường di chuyển chất Rf = Đoạn đường di chuyển dung môi Trang 27 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - Trong điều kiện định, trị số Rf số cho chất Có thể dùng Rf để xác định hợp chất chưa biết phải có kết hợp với nhiều kiện khác - Để đo Rf: vết chấm có đường kính nhỏ, chọn tâm vết Với vết lan to, nên chạy lại mỏng chấm mẫu thành điểm nhỏ Các vết kéo dài có đuôi nên chọn tâm trọng lực vết Thực hành 2.1 Phân tách hỗn hợp vanillin β naphthol * Dụng cụ hóa chất Dụng cụ Hóa chất Ống nghiệm có nắp Silicagel 0,8g Kiếng thủy tinh 4x12cm Chloroform 13ml Kiếng thủy tinh 10x10cm Acetat ethyl 7ml Ly thủy tinh đáy Natri sulfat Ống đong 10ml Dd vanillin Becher 50ml Dd β-naphthol Ống vi quản Iod Đèn cồn Dd FeCl3 Bình phun sắc ký Bình iod Đũa thủy tinh Quả bóp cao su Giấy lọc Bút chì, thước kẻ Máy sấy * Cách tiến hành § Tráng mỏng - Vệ sinh thủy tinh Trang 28 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - Cho 0,8g silicagel vào ống nghiệm có nắp, thêm 3ml nước cất, đậy nắp lại lắc thật mạnh tạo hỗn hợp huyền phù Nhanh chóng mở nắp ống nghiệm tráng silicagel lên thủy tinh 4x12cm Sau tráng silicagel xong, để sắc ký khô tự nhiên mặt bàn sấy 1100C vòng 30 phút - Tiến hành tráng sắc ký § Chuẩn bị triển khai - Lau thật sấy khơ bình triển khai Cắt giấy lọc ép vào mặt bình Cho 10ml hệ dung ly chloroform – acetate ethyl (tỷ lệ 8:2 5:5) vào bình - Đậy nắp bình lại để n cho hệ dung mơi thấm ướt hết giấy lọc - Thực bình triển khai với hệ dung ly § Triển khai sắc ký mỏng - Các dung dịch chấm gồm loại: Dung dịch vanillin, dung dịch β-naphthol, dung dịch hỗn hợp vanillin β-naphthol - Dùng ống vi quản để chấm dung dịch lên mỏng cách mép 1cm Đánh dấu mép để xác định mức hệ dung ly thấm ướt (khoảng 0,5cm) Để yên cho vết chấm khơ, cho mỏng vào bình triển khai, đậy nắp bình lại Khi hệ dung ly thấm ướt đến mức đánh dấu mức lấy mỏng Để yên cho khô tự nhiên đem màu - Tiến hành triển khai mỏng § Hiện màu mỏng tính giá trị Rf - Sau triển khai để khô tự nhiên, mỏng hình cách cho vào bình iod , mỏng hình cách phun dung dịch FeCl3 sấy khơ - Quan sát mỏng tính giá trị Rf vanillin β-naphtol màu iod dung dịch FeCl3 Trang 29 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm 2.2 Phân tách sắc tố từ * Dụng cụ hóa chất Dụng cụ, thiết bị Nguyên liệu, hóa chất Ống nghiệm có nắp Rau ngót 20g Bản mỏng Acetone 50ml Bình triển khai Petroleum ether 50ml Cốc nung Ống đong 50ml Becher 50ml Ống vi quản Phễu chiết Bình phun sắc ký Bình iod Cối chày sứ Đũa thủy tinh Quả bóp cao su Giấy lọc Viết chì, thước kẻ Máy sấy Thiết bị lọc chân không * Cách tiến hành (Mẫu chuẩn bị chung cho nhóm lớn) § Ly trích sắc tố từ - Nghiền nhuyễn cối sứ 20g tươi (thường dùng rau ngót) Thêm vào 30ml acetone, trộn nhiều lần 10 phút, lọc qua phễu Buchner hứng phần acetone - Đổ chất trích acetone vào phễu chiết, ta trích lần thứ với ether dầu hỏa Muốn vậy, ta đỗ vào phễu chiết 10ml ether dầu hỏa, lắc nhẹ, để yên tách thành phase Bỏ phase dưới, thêm 50ml nước cất, lắc nhẹ (có thể có nhũ tương, thời gian lắc khoảng – 10 phút), bỏ phần (phase nước) làm khoảng 10 lần hết mùi acetone (có thể ngửi để xác định, dung dịch cịn chứa acetone khơng thể tách carotene được) Mục đích có hỗn hợp chứa sắc tố dung mơi vơ cực Nếu dung dịch cịn nhiều Trang 30 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm (>2ml), đun cách thuỷ đến thể tích cịn khoảng 2ml (đong thể tích xác dung dịch này) Các sắc tố hòa tan ether dầu hỏa tách nhờ phép sắc ký mỏng § Chuẩn bị mỏng (mỗi tổ mỏng) - Dùng viết chì làm dấu kẻ đường theo chiều ngang mỏng (cách đáy khoảng cm) - Làm dấu mức (cách mặt khoảng 2cm) § Triển khai sắc ký mỏng - Dùng ống vi quản để chấm dung dịch sắc tố ly trích phần trước lên mỏng (ngay đường kẻ sẵn) Dùng máy sấy sấy nhẹ cho khô Thực lặp lại thao tác lần - Cho mỏng vào bình triển khai có chứa sẵn hệ dung mơi (chiều cao mức dung mơi khoảng 0,5 cm): • Tổ 1: petroleum ether • Tổ 2: hỗn hợp petroleum ether 2% acetone • Tổ 3: hỗn hợp petroleum ether 5% acetone • Tổ 4: hỗn hợp petroleum ether 10% acetone • Tổ 5: hỗn hợp petroleum ether 15% acetone • Tổ 6: hỗn hợp petroleum ether 20% acetone - Đậy nắp bình lại - Khi hệ dung ly thấm ướt đến mức đánh dấu mức lấy mỏng ra, để yên cho khơ tự nhiên § Tính giá trị Rf - Tính giá trị Rf sắc tố - Cho biết có hỗn hợp sắc tố: chlorophyll a (màu xanh vỏ đậu), chlorophyll b (màu xanh cây), xanthophyl (màu vàng), carotene (màu vàng cam) Câu hỏi Tìm hiểu sắc tố tự nhiên? Muốn thu sắc tố ta phải làm nào? Tìm hiểu cơng thức định lượng sắc tố sau thu? Trang 31 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Bài 8: PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ TRÊN GIẤY (PAPER CHROMATOGRAPHY) Nguyên lý - Nguyên tắc sắc ký giấy dựa vào tính chất có hệ số phân chiakhác hai dung mơi khơng hồ lẫn nên sắc ký giấy gọi sắc ký phân chia giấy - Đối với dung môi đặc hiệu, di chuyển chất đặc trưng hệ số Rf Đoạn đường di chuyển chất Rf = Đoạn đường di chuyển dung mơi Dụng cụ, hố chất - Máy sấy Bút chì, compass, kéo Cốc nung Giấy sắc ký Whatman số FN số Dung dịch acid glutamic chuẩn (acid glutamic 1mg/ml H2O) Các acid amin Arg, Leu, Cys Pro Bột Dung môi Butanol: Acid acetic: H2O tỷ lệ 5: 2: theo thể tích Lắc bình gạn, để n 1-2 ngày cho tách thành hai lớp rõ rệt.lớp lớp nước bão hoà butanol, lớp butanol bão hồ nước, cho thêm 1-2% butanol để làm dung mơi chạy sắc ký Thuốc thử màu: 0,2g ninhydrin pha aceton cho vừa đủ 100ml Bình chng thuỷ tinh kín Micropipet ống mao dẫn nhỏ để chấm sắc ký Bình phun thuốc thử màu Hình 8.1: Sắc ký giấy Trang 32 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Kỹ thuật tiến hành - Sắc ký giấy chiều có trang bị đơn giản Có thể tự trang bị cách dùng bình chng thuỷ tinh có nắp đậy kín - Kẻ đường thẳng cách mép tờ giấy chạy sắc ký khoảng 2cm Trên đường kẽ này, dùng micropipet chấm vết acid glutamic chuẩn cạnh vết dung dịch bột cần thử Khoảng cách vết chấm từ 2-3cm Thể tích vết từ 5-10µl Chấm nhiều lần, chờ khơ lại chấm Có thể dùng máy sấy tóc sấy nhẹ cho mau khơ Đường kính vết gọn tốt, thường không 0,5cm Sau chấm sắc ký, cuộn giấy thành hình trụ đặc vào bình sắc ký chứa dung mơi butanol bão hồ nước đậy kín bình - Khi dung môi triển khai gần hết tờ giấy chạy sắc ký, lấy để khơ nhiệt độ phịng - Phun dung dịch Ninhydrin 0,2% để màu - Có thể để khô tự nhiên sấy nhẹ tủ sấy (60o 30 phút) Tính tốn u cầu - So sánh Rf vết màu lên dung dịch bột cần thử với dung dịch acid glutamic chuẩn Nếu dung dịch bột sau triển khai giấy sắc ký có vết có Rf với vết acid glutamic chuẩn bột tinh khiết khơng có lẫn tạp chất khác - So sánh Rf hỗn hợp acid amin acid amin chuẩn Trang 33 ... lượng phân tử Dung dịch phân tử gam dung dịch chứa phân tử gam chất hịa tan lít Trang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm - Để chuẩn bị dung dịch 1M chất đó, người ta tính khối lượng phân tử... môi cho loại sắc tố tích thu V ml Trang 23 Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm SẮC KÝ BẢN MỎNG (THIN LAYER CHROMATOGRAPHY) PHÂN TÁCH HỖN HỢP VANILLIN VÀ β NAPHTHOL BÀI 7: PHÂN TÁCH CÁC SẮC TỐ... lượng gam H2SO4 = 1/2 phân tử gam H2SO4 Một phân tử gam NaOH cho ion gam OHTrang Tài liệu thực hành Phân tích thực phẩm Vậy đương lượng gam NaOH = phân tử gam NaOH Một dung dịch nguyên chuẩn