BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI B BẰNG PHƯƠNG PHÁP REAL-TIME PCR Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : VÕ THỊ HẢI YẾN MSSV: 0811110105 Lớp: 08CSH2 TP. Hồ Chí Minh, 2011 – LỜI CAM ĐOAN — Tôi xin cam đoan bài luận văn tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của cá nhân, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết. Các số liệu, những kết quả thí nghiệm trong báo cáo luận văn tốt nghiệp là trung thực. Nội dung bài báo cáo này có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng tải trên các tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo. Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến i MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 3 1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B 3 1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B 3 1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus 4 1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh 4 1.2.2. Cấu trúc bộ gen của HBV 5 1.2.3. Sự tái bản DNA 6 1.2.4. Các thành phần kháng nguyên 6 1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh 7 1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam 9 1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới 9 1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước 10 1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV 11 1.4.1. Đường lây của HBV 11 1.4.2. Triệu chứng lâm sàng 13 1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV 13 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B 15 1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) 15 1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử 16 CHƯƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 34 2.1. Vật liệu thiết bị 34 2.1.1. Vật liệu sinh học 34 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến ii 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 34 2.1.3. Hóa chất 37 2.2. Phương pháp tiến hành 37 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu 38 2.2.2. Phương pháp tách chiết 39 2.2.3. Phản ứng Real-time PCR 40 CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT bDNA branched DNA Bp base pair cDNA complementary DNA Ct Threshold cycle (chu kỳ ngưỡng) DNA Deoxyribonucle acid dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphate ELISA Enzyme Linked Immuno Assay HBV Hepatitis B Virus HBcAg Hepatitis B core Antigen HBeAg Hepatitis B envelope Antigen HBsAg Hepatitis B surface Antigen KN Kháng nguyên KT Kháng thể Nu Nuleotide PCR Polymerase chain reaction RNA Ribonucle acid T m Nhiệt độ nóng chảy của mồi Khóa luận tốt nghiệp SVTH : Võ Thị Hải Yến iv DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử 3 Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B 4 Hình 1.3. Cấu trúc bộ gene HBV 5 Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV 8 Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới 11 Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA 17 Hình 1.7. Nguyên lý PCR 19 Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR 24 Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR 26 Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real-time PCR 28 Hình 1.11. Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhân được ánh sáng kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt 33 Hình 2.1. Máy ly tâm thu huyết thanh 34 Hình 2.2. Máy Stratagene Mx300P 34 Hình 2.3. Máy ly tâm 35 Hình 2.4. Máy vortex 35 Hình 2.5. Máy ủ nhiệt khô 36 Hình 2.6. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml 36 Hình 2.7. Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR 38 Hình 2.8. Chu trình nhiệt của Real-time PCR 41 Hình 3.1. Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm 43 Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn 44 Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 1 LỜI MỞ ĐẦU I. Đặt vấn đề Viêm gan siêu vi B do Hepatitis B virus (HBV) gây bệnh phổ biến trên toàn cầu, có diễn biến phức tạp, tỷ lệ chuyển sang mãn tính cao, thường dẫn tới xơ gan và ung thư gan. Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), hiện nay có khoảng 2 tỉ người nhiễm virus viêm gan siêu vi B trên thế giới, trong đó có khoảng 6% nhiễm viêm gan siêu vi B cấp và 5 - 10% trong số này chuyển sang mãn tính ở người lớn, riêng với trẻ em tỉ lệ này lên đến 90%. Tỷ lệ tử vong trong giai đoạn cấp tính là 1%, biến chứng của viêm gan B cấp là viêm gan mãn, xơ gan, xơ gan mất bù và ung thư nguyên phát, dẫn tới tử vong 1 triệu người mỗi năm. Tại Việt Nam, hiện nay có khoảng 15 - 20% dân số nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80 - 92% bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV. Một trong những kỹ thuật phổ biến dùng để chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B được sử dụng hiện nay là phương pháp Real-time PCR, cho kết quả nhanh chóng, độ tin cậy cao, góp phần vào việc điều trị viêm gan mãn tính. II. Mục tiêu đề tài Do tỷ lệ nhiễm HBV khá cao nên ngoài biện pháp phòng ngừa thì vấn đề điều trị nhiễm HBV hay tình trạng mạng virus lâu dài trong máu cũng đang rất quan tâm. Nhưng để có thể có được những hiểu biết về các vấn đề kể trên thì cần phải xác định được một người đang mang HBsAg trong máu có thật sự đang nhiễm HBV hay không. Ngoài ra, để có được chỉ định điều trị đặc hiệu cũng như theo dõi được hiệu quả điều trị thì phải phát hiện cũng như định lượng được HBV trong máu. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 2 Trước yêu cầu thực tế đó, khóa luận “Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR” được thực hiện với mục đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA trong huyết thanh của người bệnh, nhằm giải quyết các vấn đề nói trên. III. Nhiệm vụ đề tài Giới thiệu sơ lược về virus gây bệnh viêm gan siêu vi B. Tìm hiểu các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B. Tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B bằng phương pháp Real-time PCR. IV. Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu tài liệu, lý thuyết. Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B 1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B [19] Viêm gan siêu vi B là bệnh viêm gan do virus viêm gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo đường máu và sinh dục lây đến gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, nhiều nhất tại các nước đang phát triển. 1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B [5] Bệnh được biết từ năm 1883 qua một vụ dịch viêm gan trên 191 người trong số 1289 công nhân đóng tàu ở Bremen (Anh) được chủng đậu mùa. Tất cả bệnh nhân là những người được chủng cùng một loại vaccine đậu mùa. Năm 1965, Blumberg phát hiện kháng nguyên gây bệnh viêm gan lây truyền qua huyết thanh, đặt tên là kháng nguyên Úc Châu (vì tìm thấy trên một người ở Châu Úc). HBV do Dane phát hiện năm 1970 trong huyết thanh của những bệnh nhân viêm gan bằng kỹ thuật miễn dịch hiển vi điện tử và được gọi là hạt Dane. Hình 1.1. Virus viêm gan siêu vi B trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử [23] Khóa luận tốt nghiệp SVTH: Võ Thị Hải Yến 4 1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus [8],[15],[18] Tác nhân gây viêm gan siêu vi B là một loại virus thuộc họ Hepadnaviridae, là tác nhân chủ yếu gây viêm gan và ung thư gan, được tìm thấy trong tế bào gan và trong huyết thanh của người bị nhiễm bệnh. 1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B [24] Virus hoàn chỉnh (virion) là một tiểu thể hình cầu có đường kính từ 42 - 47nm được gọi là hạt tử Dane, gồm: - Một vỏ protein có bề dày khoảng 7nm chứa kháng nguyên bề mặt HBsAg, glycoprotein và lipid. - Lõi có đường kính khoảng 28nm chứa một phân tử DNA, 2 loại kháng nguyên lõi là HBcAg, HBeAg và một số enzyme quan trọng như DNA polymerase, protein kinase. [...]... kháng siêu < /b> vi < /b> khác nhau ch , chúng chú tr ng t i m t b ph n khác nhau trên b gene c a siêu < /b> vi < /b> Tuy nhiên, d n d n HBV có th phát sinh các đ t bi n giúp siêu < /b> vi < /b> này ti p t c sinh sôi b t k đi u tr b ng thu c vi< /b> n kháng siêu < /b> vi < /b> Hi n tư ng này g i là “kháng” siêu < /b> vi,< /b> vì siêu < /b> vi < /b> có th “kháng l i” thu c kháng siêu < /b> vi < /b> Các lo i thu c kháng siêu < /b> vi < /b> có th có tác d ng trong m t th i gian đ gi m b t lư ng siêu < /b> vi.< /b> .. hình b nh vi< /b> m < /b> gan < /b> siêu < /b> vi < /b> B trên th gi i Theo t ch c y t th gi i (WHO), hi n nay trên th gi i có kho ng 2 t ngư i b nhi m HBV và 350 tri u ngư i mang m m b nh mãn tính Vi< /b> m < /b> gan < /b> siêu < /b> vi < /b> B thư ng là nguyên nhân d n đ n vi< /b> m < /b> gan < /b> mãn tính, xơ gan < /b> và ung thư gan < /b> nguyên phát v i t l t vong là 1 - 2 tri u ngư i Các genotype HBV khác nhau phân b vùng đ a lý đ c trưng khác nhau: - Genotype A ph bi n B c M ,... ph n ng PCR b ng máy tính Các đ c tính c a Real- time PCR SVTH: Võ Th H i Y n 21 Khóa lu n t t nghi p - Thi t b Real- time PCR khác thi t b PCR ch đơn gi n b ng cách b sung thêm thi t b quang h c vào máy PCR thông thư ng - B sung cơ ch t huỳnh quang vào h n h p ph n ng và ti n hành ph n ng PCR b ng máy Real- time PCR - Ph n ng huỳnh quang t i m i đi m xác đ nh nh thi t b quang h c ü Hi n nay có b n ki... polypeptide ph n lõi c a virus, g m kháng nguyên lõi là HBcAg Gene C có m t trình < /b> t ng n là pre C (precore) mã hóa HBeAg N u có m t đ t bi n t i mã ng ng (stop codon) s làm cho virus không s n xu t đư c HBeAg trong khi HBsAg v n đư c t ng h p Dòng đ t bi n này cũng có vai trò trong vi< /b> m < /b> gan < /b> siêu < /b> vi < /b> mãn và vi< /b> m < /b> gan < /b> siêu < /b> vi < /b> t i c p v Gene P (pol hay polymerase) Gene P chi m 3/4 b gene c a virus Gene này g i... HBV khá ph bi n, tuy chưa có nh ng nghiên c u d ch t h c th ng nh t 1.3.2 Tình hình b nh vi< /b> m < /b> gan < /b> siêu < /b> vi < /b> B trong nư c Vi < /b> t Nam, c 5 - 7 ngư i dân thì có m t ngư i nhi m, ch y u là ki u gene B và C Virus B xâm nh p t b o gan,< /b> bi n chúng thành nơi s n xu t virus m i Khi phát hi n ra s b t thư ng này, h mi n d ch s t n công k xâm lư c N u “cu c chi n“ th ng l i, t b o gan < /b> t n thương s đư c thay th b. .. hoàn toàn b nh thư ng M t s b vi< /b> m < /b> mãn tính n ng thì ti p t c b các tri u ch ng vi< /b> m < /b> c p như m t m i, chán ăn, đau b ng và suy gan < /b> Bi u hi n lâm sàng: gan < /b> to, b n tay ng đ Khi b bi n ch ng sơ gan < /b> có th b nư c trong b ng, vàng da, loãng máu, ch y máu trong d dày, tĩnh m ch t a l n t r n (do tăng áp làm giãn tĩnh m ch c a gan)< /b> , nam vú l n như vú n , tinh hoàn teo nh (vì gan < /b> y u làm thay đ i cân b ng c... i Y n 7 Khóa lu n t t nghi p Virus g n vào b m t t b o gan:< /b> HBV g n vào b m t t b o gan < /b> c m th nh s phù h p gi a th th c a t b o v i protein trên màng c a virus Virus xâm nh p t b o: Sau khi b m vào th th c a t b o ch , có s hòa nh p v virus v i màng t b o, sau đó capsid đư c phóng thích vào trong t b o Virus nhân lên trong t b o: Đ u tiên, các thông tin di truy n c a virus đư c mã hóa trong các phân... nh ng t b o kh e m nh và b nh nhân s đư c ph c h i Nhưng m t s ngư i, h mi n d ch không lo i tr đư c virus và h tr thành ngư i mang virus vi< /b> m < /b> gan < /b> B mãn tính Kho ng 10% s ngư i nhi m virus B rơi vào trư ng h p này Trong các trư ng h p x u nh t, các t b o gan < /b> b virus phá ho i b thay th b ng các mô s i b t thư ng, d n đ n xơ gan < /b> và ung thư gan < /b> SVTH: Võ Th H i Y n 10 Khóa lu n t t nghi p Trên b n đ d... probe trong Realtime PCR [7] SVTH: Võ Th H i Y n 28 Khóa lu n t t nghi p ü M t s đi u lưu ý khi th c hi n ph n ng Real- time PCR - Kích thư c s n ph m PCR trong ph n ng Real- time PCR Chi u dài t i ưu c a s n ph m PCR trong ph n ng Real- time PCR thư ng nh hơn 100bp Đôi khi có th tăng kích thư c s n ph m nhân b n đ n 400bp trong m t s trư ng h p v i Taqman probe S n ph m PCR có kích thư c ng n, nhân b. .. b ng (dư i sư n b n ph i) Nh ng trư ng h p b vi< /b> m < /b> n ng s đưa đ n gan < /b> to, ng y ng t, khó ng , mê mu i, lãng trí ho c b t t nh Bi u hi n lâm sàng: tăng nhi t đ , vàng da (m t tu n sau khi b nhi m và có th kéo dài đ n 1 - 3 tháng), gan < /b> to, lách to Hi m khi th y b n tay ng đ ho c “spider nevi” (m ch máu li ti k t t a thành hình nh n như hoa th trên da) - Vi< /b> m < /b> gan < /b> mãn tính Ph n l n khi b vi< /b> m < /b> mãn tính b . virus gây b nh vi m gan siêu vi B. Tìm hiểu các phương pháp chẩn đoán b nh vi m gan siêu vi B. Tìm hiểu quy trình chẩn đoán b nh vi m gan siêu vi B bằng phương pháp Real- time PCR. IV. Phương. 1.1. Đại cương về b nh vi m gan siêu vi B 1.1.1. Định nghĩa b nh vi m gan siêu vi B [19] Vi m gan siêu vi B là b nh vi m gan do virus vi m gan B (Hepatitis B Virus) gây ra, truyền nhiễm theo. Quy trình chẩn đoán b nh vi m gan siêu vi B bằng phương pháp Real- time PCR được thực hiện với mục đích đề xuất phương pháp định lượng HBV-DNA trong huyết thanh của người b nh, nhằm giải quy t