KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHOA:MT & CNSH BỘ MÔN:CNSH HỌ VÀ TÊN: NGUYỄN THỊ THU NGÀNH: CNSH MSSV: 207111055 LỚP: 07CSH 1 Đầu đề Khóa luận tốt nghiệp: CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): - Tổng quan về cây Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu một số qui trình nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh 3 Ngày giao Khóa luận tốt nghiệp : 05/04/2010 4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 28/06/2010 5 Họ tên người hướng dẫn CN BÙI VĂN THẾ VINH Phần hướng dẫn Toàn bộ Nội dung và yêu cầu KLTN đã được thông qua Bộ môn Ngày tháng năm 2010 CHỦ NHIỆM BỘ MÔN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) CN BÙI VĂN THẾ VINH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN Người duyệt (chấm sơ bộ): ………………………………… Đơn vị:……………………………………………………… Ngày bảo vệ:………………………………………………… Điểm tổng kết:……………………………………………… Nơi lưu trữ Khóa luận tốt nghiệp: ………………………… SVTH: NGUYỄN THỊ THU 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH LỜI CẢM ƠN Vậy là ba năm học dưới mái trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ đã kết thúc Trong suốt thời gian học tập em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ tận tình từ phía thầy cô, gia đình và bạn bè Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới quí thầy cô trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ nói chung cũng như quí thầy cô khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức để em có thể vững bước, tự tin với những gì đã được học Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn trong suốt quá trình học tập cũng như trong thời gian làm bài khóa luận tốt nghiệp Xin cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ, để em có thêm nhiều động lực hoàn thành tốt khóa học Do vẫn còn nhiều hạn chế về trình độ và kiến thức nên bài tiểu luận vẫn còn nhiều hạn chế, thiếu sót Em mong quí thầy cô, bạn bè chỉ dạy, bổ sung và thông cảm để em có thể rút ra nhiều kinh nghiệm làm bài trong quá trình học tập Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thu TP.HCM, tháng 7 năm 2010 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH MỤC LỤC NHIỆM VỤ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU DANH SÁCH CÁC HÌNH CHƯƠNG I ĐẶT VẤN ĐỀ .01 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích của đề tài CHƯƠNG II TỔNG QUAN 03 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật 0.3 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Các kỹ thuật nuôi cấy 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 2.1.4 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 2.1.5 Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật 2.2 Giới thiệu cây Sâm Ngọc Linh 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Đặc điểm hình thái 2.2.3 Sinh thái và phân bố 2.2.4 Hiện trạng và tiềm năng của cây sâm Ngọc Linh 2.2.5 Thành phần hóa học CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO SÂM NGỌC LINH 27 3.1 Nuôi cấy mô sẹo 3.1.1 Nguyên liệu 3.1.2 Môi trường 3.1.3 Thiết bị và dụng cụ 3.1.4 Hóa chất 3.1.5 Qui trình thực hiện SVTH: NGUYỄN THỊ THU 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.1.6 Điều kiện nuôi cấy 3.2 Tái sinh chồi từ mô sẹo 3.2.1 Nguyên liệu 3.2.2 Môi trường 3.2.3 Thiết bị và dụng cụ 3.2.4 Hóa chất 3.2.5 Qui trình thực hiện 3.2.6 Điều kiện nuôi cấy 3.3 Nuôi cấy rễ 3.3.1 Nguyên liệu 3.3.2 Môi trường 3.3.3 Thiết bị và dụng cụ 3.3.4 Hóa chất 3.3.5 Qui trình thực hiện 3.3.6 Điều kiện nuôi cấy 3.4 Nuôi cấy sinh khối 3.4.1 Nguyên liệu 3.4.2 Môi trường 3.4.3 Thiết bị và dụng cụ 3.4.4 Hóa chất 3.4.5 Qui trình thực hiện 3.4.6 Điều kiện nuôi cấy 3.5 Tái sinh cây qua con đường tạo phôi soma 3.5.1 Nguyên liệu 3.5.2 Môi trường 3.5.3 Thiết bị và dụng cụ 3.5.4 Hóa chất 3.5.5 Qui trình thực hiện 3.5.6 Điều kiện nuôi cấy 3.6 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng SVTH: NGUYỄN THỊ THU 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái 3.6.3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 3.6.4 Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo 3.6.5 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 3.6.6 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh 3.6.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo 3.6.8 Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro 43 3.6.9 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi 3.6.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro .44 3.6.11 Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo 3.6.12 Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ bất định CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC SVTH: NGUYỄN THỊ THU 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SVTH: NGUYỄN THỊ THU GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH DANH SÁCH CÁC BẢNG BIỂU Bảng 2.1: Thời gian tối thiểu để hấp khử trùng môi trường nuôi cấy mô ở 1210C 13 Bảng 2.2: Nồng độ và thời gian sử dụng 1 số chất xử lí mô cấy thực vật .14 Bảng 2.3: Hàm lượng một số saponin chính trong sâm .20 Bảng 2.4: Hàm lượng saponin của Sâm Ngọc Linh so sánh với các loài Panax spp trồng trọt 21 Bảng 2.5: Các saponin chính yếu trong thành phần saponin dẫn chất protopanaxatriol 21 Bảng 2.6: Acid Oleanolic 22 Bảng 2.7: Ocotillol 22 Bảng 2.8: Các axid béo được tìm thấy 23 Bảng 2.9: Thành phần acid amin chủ yếu 24 Bảng 2.10: Các nguyên tố vi lượng .25 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các loại nồng độ khử trùng .35 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh cấy mô 36 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 37 Bảng 3.4: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo 38 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá 39 Bảng 3.6: Ảnh hường của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh 40 Bảng 3.7: Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung BA và NAA 42 Bảng 3.8: Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro 43 Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng SVTH: NGUYỄN THỊ THU 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH tăng trưởng chồi 44 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro .44 Bảng 3.11: Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo 45 Bảng 3.12: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA 47 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA 47 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Sâm Ngọc Linh ngoài tự nhiên 15 Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 16 Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 17 Hình 3.1: Mô sẹo Sâm Ngọc Linh 28 Hình 3.2: Chồi Sâm Ngọc Linh 30 Hình 3.3: Rễ Sâm Ngọc Linh 31 Hình 3.4: Nuôi cấy trong Bioreactor 32 Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh .34 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Dương Tấn Nhựt và cộng sự, Đề tài “ Hoạt chất saponin từ các nguyên liệu nuôi cấy invitro của cây Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP HCM 2 Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2006), Công nghệ tế bào, Nxb ĐHQG TP HCM 3 Nguyễn Ngọc Dung, Nhân giống Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học, Nxb Nông Nghiệp 4 Nguyễn Ngọc Duy (1995), Nhân giống Sâm Ngọc Linh bằng con đường sinh học và kinh nghiệm trồng Nhân Sâm ở Khai Thành Triều Tiên, Nxb Nông Nghiệp 5 Nguyễn Thanh Bình, Nguyễn Ngọc Duy (1996), Thăm dò khả năng nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô invitro cây Sâm Ngọc Linh và một số cây trong dự án chuyên ngành lâm nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM 6 PGS TS Lê Văn Hoàng, Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật, Đại học Đà Nẵng 7 PGS TS Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Trường Đại Học Nông Lâm TP HCM 8 Viện Dược Liệu, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam (Tập II), Nxb KH & KT 9 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Sinh lý học thực vật, Nxb GD 10 http://www.nhasinhoctre.com/forum/viewtopic.php?f=47&t=4450 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH PHỤ LỤC  Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962): (mg l -1) Khoáng đa lượng NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCL2.2H2O 440 Mg2SO4.7H2O 370 KH2PO4.7H2O 170 (mg l -1) Khoáng vi lượng KI 0.83 H3BO4 6.2 MnSO4.4H2O 22.3 ZnSO4.7H2O 8.6 Na2MoO4.2H2O 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Na2.EDTA 27.8 (mg l -1) Vitamin và các chất hữu cơ khác Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0.5 Pyridoxine HCl 0.5 Thiamine HCl 0.1 Glycine 2.0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.5.6 Điều kiện nuôi cấy: - Nhiệt độ: 25 ± 20C - Cường độ chiếu sáng: 2.500 – 3.000 lux - Thời gian chiếu sáng: 10 giờ/ ngày - Độ ẩm: 75- 80 % Hình 3.5: Phôi vô tính Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU 43 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến nuôi cấy Sâm Ngọc Linh 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng của một số loại chất khử trùng: Đối với Sâm Ngọc Linh bộ phận thí nghiệm là đầu (mầm, thân, rễ) Chọn chồi mọc thẳng hay chồi bên làm nguyên liệu nuôi cấy có chiều dài 2-3 cm, cắt bỏ hết lá, xử lý bằng cồn 70 % trong 1 phút ở tủ cấy vô trùng, sau đó tráng lại 3 lần bằng nước cất vô trùng, sau đó xử lý mẫu bằng dung dịch hypoclorid canxi hay HgCl2 sau đó tráng bằng nước cất vô trùng nhiều lần cho sạch hết chất khử trùng Sau khi khử trùng xong cắt phần đầu có màu xanh, chiều dài 0.4 cm đặt vào môi trường Bảng 3.1: Ảnh hưởng của các loại nồng độ khử trùng: Mẫu Số mẫu Sâm HgCl2 10 5 Ngọc Linh gian thân, (phút) 20 5 0.3% 5 15 20 0.4% 5 Thời (Mầm, 0.2% 10 15 100% 100% 100% 20% 40% 40% Chết Chết Chết rễ) Mẫu Sâm Số mẫu Ca(OCl)2 10 10 Ngọc Linh gian thân, (phút) 20 100% 100% 100% 5 10% 10 15% 15 5 10 40% Chết Chết Chết Chết Thời (mầm, 5% 15 rễ) SVTH: NGUYỄN THỊ THU 44 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Sâm Ngọc Linh xử lý bằng HgCl 2 với nồng độ 0.2 % trong thời gian 20 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp (20%) và tỷ lệ nhiễm không cao (80%) Còn đối với xử lý bằng Ca(OCl)2 với nồng độ 10%, thời gian 5 phút thì tỷ lệ nhiễm thấp (10 %) và tỷ lệ không nhiễm cao (90%) (Bảng 3.1) 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái: Sử dụng các mẫu mầm, thân, rễ Sâm Ngọc Linh Nuôi cấy phối hợp trên các tổ hợp môi trường khác nhau để đánh giá sự phát sinh hình thái Bảng 3.2: Ảnh hưởng của các tổ hợp hoocmon lên sự phát sinh hình thái của Sâm Ngọc Linh cấy mô: Bộ Đối phận tượng cấy Hoccmon sinh hình thái IBA Sâm Mầm, Ngọc IAA NAA 0.2 0.5 0.5 K 2ip G 0.2 0.5 1 0.5 0.25 0.2 0.5 thân, rễ Linh Kết quả phát 0.5 0.5 8 1 1 3 0.5 1 0.5 3 Chết Chết Callus Callus Rễ Phôi soma Phôi chồi Rễ Chồi  Kết quả: - Với tổ hợp hoocmon IBA 0.5 + 2ip 1 thì Sâm Ngọc Linh phát sinh phôi soma - Với tổ hợp hoocmon NAA 1 + G 3 thì phát sinh phôi chồi - Với tổ hợp hoocmon NAA 8 + 2ip 0.5 thì phát sinh rễ 3.6.3 Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc không cần trong suốt thời gian tạo mô sẹo Đối với mẫu lá, đa số trường hợp thì sự tạo mô sẹo trong tối thường tốt hơn ngoài sáng Tuy nhiên, một số trường hợp mẫu cấy lại tạo mô sẹo tốt hơn trong điều kiện sáng Môi trường tốt nhất cho sự tạo mô sẹo ban đầu từ mẫu lá và cuống lá được dùng để khảo sát điều kiện chiếu sáng Mẫu được đặt trong hai điều kiện tối hoàn toàn và chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Bảng 3.3: Ảnh hưởng của điều kiện chiếu sáng lên khả năng tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: 2,4-D (mg/l) 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 Bộ phận Phần trăm tạo mô sẹo (%) Chiếu sáng (16 giờ/ ngày) Tối hoàn toàn 20 90 90 80 100 100 100 100 30 80 90 80 100 100 100 100 Lá Cuống lá  Kết quả: Kết quả ở bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ phát sinh mô sẹo trên các mẫu lá và cuống lá gần như tương đương giữa hai điều kiện chiếu sáng và tối, nhưng lượng mô sẹo trong điều kiện tối ít hơn và chất lượng mô sẹo cũng kém hơn do có hiện tượng thủy tinh thể, nhất là môi trường có 3.0 mg/l 2,4-D 3.6.4 Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo: Mô sẹo được cắt theo ba kích thước: KT1, KT2, KT3 Mẫu mô sẹo với kích thước xác định được cấy vào môi trường nhân nhanh SVTH: NGUYỄN THỊ THU 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Mô sẹo sau quá trình tăng sinh được sử dụng cho quá trình tái sinh chồi và rễ bất định Bảng 3.4: Ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo: Chỉ tiêu quan sát Trọng lượng tươi ban đầu (mg) Kích thước (cm) Sinh khối sau Trọng lượng tươi (mg) 4 tuần nuôi cấy Trọng lượng khô (mg) Tỷ lệ chất khô ( %) Tỷ lệ tăng sinh khối khô KT1 KT2 KT3 (0.5*0.5) (0.7*0.7) (1.0*1.0) 147 6 267 ± 18 576 ± 24 1.1*0.9 1.4*1.0 1.6*1.2 667 ± 45 804 ± 35 1505 ± 66 53.9 ± 36 57.8 ± 2.5 102.8 ± 4.5 8.08 7.19 6.83 5.46 3.22 2.65  Kết quả: Kích thước mẫu cấy là một yếu tố quan trọng trong nhân giống invitro Khi khảo sát ảnh hưởng của kích thước mẫu cấy ban đầu lên sự tăng sinh mô sẹo, ta nhận thấy kích thước nhỏ nhất (KT1) cho hiệu quả tốt nhất về tỷ lệ tăng sinh khối lẫn trọng lượng khô, trong khi đó không có sự khác biệt nhiều về khả năng tăng sinh giữa KT2 và KT3 (Bảng 3.4) Sự tương quan này có thể bắt nguồn từ tương quan giữa kích thước mẫu cấy - khả năng thu nhận dinh dưỡng từ môi trường và do ảnh hưởng của các chất thải nội sinh của mô sẹo trong quá trình nuôi cấy 3.6.5 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: Những nghiên cứu đã có trên các đối tượng thuộc chi Panax cho thấy giai đoạn khởi tạo mô sẹo thường có sự kết hợp giữa cytokinin và auxin SVTH: NGUYỄN THỊ THU 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Mẫu lá và cuống lá sau khi được khử trùng được cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các loại auxin 2,4-D, IBA, NAA, với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0 và 3.0 mg/l Mẫu lá được đặt ngửa trên mặt môi trường và cuống lá cũng được đặt ngửa (Vết cắt hướng lên trên) Bảng 3.5: Ảnh hưởng của auxin lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lá và cuống lá: Auxin Nồng độ auxin ( mg/l) 2,4-D IBA NAA 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 0.5 1.0 2.0 3.0 Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Cuống lá Lá 100 20 100 90 100 90 100 80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0  Kết quả: Kết quả thu được sau 8 tuần nuôi cấy được ghi nhận trong bảng 3.5 Trong ba loại auxin được bổ sung vào môi trường thì chỉ có 2,4-D có khả năng kích thích lá và cuống lá tạo mô sẹo Trên môi trường bổ sung 1.0 mg/l 2,4-D, các mẫu cấy có tỷ lệ hình thành mô sẹo cao nhất (Đạt 90 % đối với lá và 100 % đối với cuống lá), có lượng sẹo hình thành nhiều nhất, cấu trúc chắc và có màu vàng sáng Ở nồng độ 3.0 mg/l 2,4-D, mô sẹo bắt đầu có hiện tượng thủy tinh thể Do đó, ở nồng độ 2,4-D từ 3.0 mg/l trở lên không phù hợp cho sự phát sinh mô sẹo 3.6.6 Ảnh hưởng của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: Các mẩu mô sẹo được tạo từ giai đoạn khởi tạo được cấy vào môi trường MS bổ sung 0.2 mg/l TDZ và các loại auxin 2,4-D, IBA và NAA với nồng độ thay đổi từ 0.5; 1.0; 2.0; 3.0 và 5.0 mg/l trong điều kiện chiếu sang 16 giờ/ ngày Bảng 3.6: Ảnh hường của auxin lên khả năng tăng sinh mô sẹo Sâm Ngọc Linh: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Trọng Auxi Nồng độ GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Sinh khối sau 4 tuần nuôi cấy lượng tươi 2,4-D IBA NAA (mg/l) 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 0.5 1.0 2.0 3.0 5.0 ban đầu (mg) n Trọng lượng tươi (mg) 203 ± 16 212 ± 14 204 ± 17 205 ± 9 201 ± 13 197 ± 18 203 ± 19 207 ± 13 203 ± 15 209 ± 12 218 ± 8 212 ± 14 206 ± 15 199 ± 7 205 ± 14 584 ± 34 809± 37 711 ± 32 508 ± 24 493 ± 38 474 ± 23 532 ± 29 631 ± 32 552± 26 531 ± 23 485 ± 13 548 ± 21 588 ± 18 602 ± 32 720 ± 48 Tỷ lệ tăng Trọng Tỷ lệ sinh lượng khô chất khô khối (mg/l) (%) 43.3 ± 2.5 66.2 ± 3.0 52.4 ± 2.4 36.6 ± 2.2 34.6 ± 1.7 45.6 ± 2.2 48.6 ± 2.7 49.5 ± 2.5 41.1 ± 1.9 35.3 ± 1.5 41.2 ± 1.1 45.0 ± 1.8 46.6 ± 1.4 45.7 ± 2.4 51.6 ± 3.4 7.42 8.18 7.37 7.21 7.01 9.62 9.14 7.84 7.45 6.66 8.49 8.22 7.92 7.60 7.20 khô 3.18 4.56 3.73 2.65 2.50 3.45 3.56 3.63 3.10 2.53 2.81 3.33 3.37 3.38 3.77  Kết quả: Bảng 3.6 cho thấy sau quá trình tăng sinh, mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0.5 mg/l IBA có tỷ lệ chất khô cao nhất 9.62 % nhưng tỷ lệ tăng sinh khối khô cao nhất là 4.56 lần lại thu được ở mô sẹo trên môi trường có 2,4-D ở nồng độ 1.0 mg/l Có thể sự kết hợp giữa auxin và cytokinin đã làm tăng khả năng thu nhận đường và các chất dinh dưỡng khác từ môi trường của mô sẹo và kéo theo sự tăng sinh của mô sẹo, đặc biệt là tăng tỷ lệ chất khô IBA có thể là auxin kích thích sự thu nhận dinh dưỡng từ môi trường khi kết hợp với TDZ tốt hơn so với NAA và 2,4-D Kết quả là tỷ lệ chất khô của mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có IBA cao nhất trong ba loại auxin sử dụng Tuy IBA cho tỷ lệ mô sẹo có tỷ lệ chất khô cao nhất nhưng 2,4-D có tỷ lệ tăng sinh khối khô cao nhất (Gấp 4.56 lần) và có tỷ lệ chất khô tương đối cao (8.18 %) Mặt khác, mô sẹo trên môi trường 2,4-D có hình thái tốt nhất, là dạng mô sẹo có khả năng tái sinh cao SVTH: NGUYỄN THỊ THU 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 3.6.7 Ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo: Các mô sẹo thu được trong thí nghiệm nhân nhanh mô sẹo được tách và chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung BA và NAA với các nồng độ trong bảng 3.6  Kết quả: Tỷ lệ giữa auxin và cytokinin đóng vai trò cần thiết cho tái sinh chồi, cytokinin thường thúc đẩy sự hình thành chồi và quá trình này thường được kích thích khi bổ sung auxin với nồng độ thấp Trong thử nghiệm, khi sử dụng BA kết hợp với NAA kết quả nhận thấy các tổ hợp NAA và BA khác nhau, sự kết hợp giữa 1.0 mg/l BA và 1.0 mg/l NAA cho số chồi đạt cao nhất là 6.3 chồi/ mẫu và trọng lượng trung bình là 0.185 g (Bảng 3.7) Bảng 3.7: Khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo trên môi trường MS có bổ sung BA và NAA: BA (mg/l) 0.5 1.0 2.0 NAA (mg/l) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Số lượng chồi/ mẫu 5.0 6.1 4.6 3.3 3.0 5.5 6.3 5.9 3.9 3.7 4.2 5.5 2.9 50 Trọng lượng chồi (g) 0.106 0.141 0.193 0.197 0.094 0.163 0.185 0.158 0.148 0.157 0.152 0.141 0.144 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 2.0 2.5 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 4.0 2.8 2.7 3.3 3.0 2.6 0.8 0 0.112 0.108 0.154 0.122 0.122 0.108 0 3.6.8 Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: Những chồi tốt nhất sau khi thu nhận được thì được tách và chuyển vào môi trường ½ MS có bổ sung 1.0 g/l than hoạt tính, 30 g/l sucrose, 0.5 mg/l NAA và BA ( 0.5; 1.0; 2.0; 4.0 mg/l) Bảng 3.8: Ảnh hưởng của BA lên quá trình tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh invitro: BA (mg/l) Trọng lượng tươi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.5 1.0 2.0 4.0 0.61 0.87 0.72 0.71 5.66 6.16 4.11 4.33 3.0 3.3 4.0 3.9  Kết quả: Trong các nồng độ BA đươc sử dụng, nồng độ 1.0 mg/l BA kết hợp với 0.5 mg/l NAA cho kết quả tăng trưởng chồi chốt nhất với trọng lượng tươi của chồi là 0.87 g và chiều cao chồi là 6.16 cm (Bảng 3.8) Vậy môi trường nuôi cấy có bổ sung 1.0 mg/l BA và 0.5 mg/l tốt nhất cho quá trình tăng trưởng chồi 3.6.9 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi: SVTH: NGUYỄN THỊ THU 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH Những chồi tốt nhất trong thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 và đường với các nồng độ đường là 10; 20; 30; 40; 50; 60 g/l  Kết quả: Qua các kết quả thử nghiệm cho thấy sucrose là carbohydrate hào tan chiếm ưu thế và nồng độ thường dùng nằm trong khoảng 30 - 120 g/l sucrose Nghiên cứu ảnh hưởng của sucrose lên sự tăng trưởng chồi Sâm Ngọc Linh sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy việc bổ sung sucrose vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng tích cực lên sự sinh trưởng chồi Sự gia tăng nồng độ sucrose trong môi trường không những kích thích sinh trưởng chồi Sâm Ngọc Linh mà còn có tác dụng mạnh đến sự biến đổi khối lượng của chúng Nồng độ 50 g/l sucrose cho kết quả tốt nhất về trọng lượng, chiều cao và số lượng lá (Bảng 3.9) Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tăng trưởng chồi: Sucrose (g/l) Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 10 20 30 40 50 60 0.49 0.55 0.68 1.06 1.46 1.28 4.4 5.4 5.7 5.8 6.1 6.1 2.2 2.5 2.6 3.2 3.5 3.2 3.6.10 Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro: Những chồi tốt nhất trong thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường ½ MS có bổ sung 0.5 mg/l NAA, 1.0 mg/l BA, pH = 5.7 với các nồng độ than hoạt tính lần lượt là 1.0; 2.0; 3.0 và 4.0 g /l Bảng 3.10: Ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tăng trưởng chồi invitro: Than hoạt tính (g/l) 0 Trọng lượng chồi (g) Chiều cao chồi (cm) Số lượng lá/ chồi 0.53 3.3 3.6 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 52 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 1.0 2.0 3.0 4.0 GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH 0.61 1.01 0.97 0.94 4.6 5.3 6.8 8.5 3.7 3.3 2.7 3.1  Kết quả: Than hoạt tính không phải là một chất điều hòa sinh trưởng thưc vật, nhưng nó có khả năng thay đổi thành phần môi trường Than hoạt tính điều chỉnh pH môi trường, hấp thụ các chất làm cản trở sự phát triển của mô Kết quả thu được cho thấy khi nồng độ than hoạt tính tăng thì có sự thay đổi rõ rệt về trọng lượng cũng như chiều cao của chồi, nhưng số lượng lá không có sự thay đổi đáng kể Trọng lượng chồi đạt cao nhất trên môi trường chứa 2.0 g/l than hoạt tính là khoảng 1.01 g/chồi, tăng 1.9 lần so vời đối chứng (Bảng 3.10) Vậy nồng độ 2.0 g/l than hoạt tính là phù hợp nhất cho qúa trình tăng sinh chồi Sâm Ngọc Linh 3.6.11 Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo: Mô sẹo được cấy vào môi trường ra rễ có chứa các auxin (NAA, IBA, IAA) ở các nồng độ lần lượt là 1.0; 3.0; 5.0; 7.0 mg/l Bảng 3.11: Ảnh hưởng của IAA, IBA, NAA đến khả năng ra rễ bất định từ mô sẹo: Auxin NAA IAA IBA Nồng độ Tỷ lệ ra rễ Số lượng ( mg/l) (%) rễ / mẫu 1.0 3.0 5.0 7.0 1.0 3.0 5.0 7.0 1.0 3.0 5.0 7.0 30 100 70 50 0 0 10 0 70 80 100 60 3.0 ± 0.3 8.7 ± 0.1 2.6 ± 0.1 2.1 ± 0.1 SVTH: NGUYỄN THỊ THU Tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu (%) 5.98 21.88 6.23 12.21 Chiều dài tối đa của rễ (mm) 18 13 9 8 0.2 ± 0.2 1.6 ± 0.1 4.0 ± 0.3 4.8 ± 0.3 3.5 ± 0.1 53 7.83 5.21 15.81 8.06 16 21 18 1.7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH  Kết quả: Quá trình khảo sát ảnh hưởng của ba loại auxin trên, ta nhận thấy IAA không thích hợp cho quá trình ra rễ Sâm Ngọc Linh từ mô sẹo vì auxin này hầu như không kích thích mô sẹo ra rễ bất định NAA và IBA thì ngược lại Nồng độ 3.0 mg/l NAA cho kết quả tố nhất với tỷ lệ ra rễ lên đến 100 %, số lượng rễ/ mẫu lớn nhất (8.7 rễ/ mẫu), tỷ lệ khối lượng rễ / mẫu lớn nhất (21.88 %), chiều dài tối đa của rễ là 13 mm (Bảng 3.11) IBA ở nồng độ 5.0 mg/l cho tỷ lệ ra rễ đạt 100 %, Số lượng rễ trung bình/ mẫu 4.8 mẫu, tỷ lệ khối lượng 15.81 % và chiều dài tối đa của rễ là 18 mm Kết quả này có thể được giải thích do auxin tổng hợp có hoạt tính cao hơn dạng tự nhiên Vậy hai môi trường kích thích ra rễ tốt là môi trường Ms ½ bổ sung 3.0 mg/l NAA và môi trường MS ½ bổ sung 5 mg/l IBA 3.6.12 Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ bất định: RỄ bất định sau khi được tạo ra ở các thí nghiệm được tách và cấy chuyền sang môi trường nhân rễ có bổ sung các auxin NAA, IBA ở các nồng độ lần lượt là 1.0; 3.0; 5.0 mg/l  Kết quả: Từ kết quả ở bảng 3.12 và bảng 3.13 cho thấy nguồn gốc mẫu rễ có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả nhân rễ Mẫu rễ trong bảng 3.12 có khả năng nhân rễ tốt hơn, cả 6 nghiệm thức đều ra rễ, tỷ lệ ra rễ cao nhất là 60 %, số rễ thứ cấp cao nhất là 9 rễ/ mẫu Mẫu rễ trong bảng 3.13 có tỷ lệ ra rễ cao nhất là 40 %, số rễ thứ cấp cao nhất là 3 rễ/ mẫu, có 3 trên 6 nghiệm thức ra rễ nhưng những mẫu này lại được cấy trên môi trường chứa NAA Khi xét đến ảnh hưởng của loại auxin, ta thấy rằng NAA phù hợp hơn với quá trình nhân rễ bất định của Sâm Ngọc Linh Ở nồng độ 5.0 mg/l NAA kích thích nhân rễ tốt nhất (60 %), có số rễ thứ cấp nhiều nhất (9 rễ/ mẫu) và mẫu tăng trọng cao (Trọng lượng tươi trung bình là 390 ± 20 mg/l, tăng 3.5 lần so với ban đầu) Hơn nữa, có tới 5/6 nghiệm thức bổ sung NAA cho kết quả ra rễ so với IBA chỉ có 4/6 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 54 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH nghiệm thức Vậy giữa IBA và NAA, NAA ở nồng độ 3.0 mg/l phù hợp cho việc khơi tạo rễ từ mô sẹo và NAA ở nồng độ 5.0 mg/l phù hợp hơn cho quá trình nhân rễ bất định Sâm Ngọc Linh Bảng 3.12: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung NAA: NAA IBA Tỷ lệ ra rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp 1 3 5 - 1 3 5 20 30 60 10 20 30 Trọng lượng tươi trung 1 4 9 1 2 1 bình (mg/l) 140 ± 10 290 ± 10 390 ± 20 450 ± 50 330 ± 20 280 ± 30 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của IBA và NAA đến khả năng nhân rễ của mẫu có nguồn gốc từ môi trường bổ sung IBA: NAA IBA Tỷ lệ ra rễ Số rễ thứ (mg/l) (mg/l) (%) cấp 1 3 5 - 1 3 5 40 20 0 10 0 0 3 1 0 1 0 0 SVTH: NGUYỄN THỊ THU 55 Trọng lượng tươi trung bình (mg/l) 350 ± 10 180 ± 30 270 ± 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Sâm Ngọc Linh được công nhận là một trong những cây Sâm có hàm lượng saponin cao và với số lượng nhiều nhất, so với các loài Panax khác trên thế giới Do đó việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã mang lại nhiều ý nghĩa thực tiễn trong việc bảo tồn nguồn dược liệu quý giá - Quá trình khảo sát ảnh hưởng của loại và nồng độ auxin lên khả năng tạo mô sẹo ban đầu của lá và cuống lá cho thấy nồng độ 3.0 mg/l 2.4-D trở lên không phù hợp cho sự phát sinh mô sẹo từ lá Sâm Ngọc Linh - Trong giai đoạn tăng trưởng chồi, số chồi tái sinh từ mô sẹo đạt cao nhất trên môi trường ½ MS bổ sung 1.0 mg/l BA, 1.0 mg/l NAA, 50 g/l sucrose - Đối với quá trình ra rễ từ mô sẹo, các mẫu mô sẹo được nuôi cấy trên môi trường ½ MS có bổ sung 3.0 mg/l NAA cho tỷ lệt ra rễ cao nhất, số lượng rễ nhiều nhất và tỷ lệ trọng lượng tươi của rễ/ mẫu cao nhất - Môi trường ½ MS có bổ sung 5.0 mg/l NAA kích thích sự nhân rễ tốt nhất, cho tỷ lệ ra rễ cao nhất và rễ phân nhánh nhiều nhất 4.2 Kiến nghị: - Được thế giới ghi nhận là loài Sâm quý hiếm bậc nhất, nhưng đến nay Sâm Ngọc Linh vẫn chưa được biết đến nhiều như các loài Sâm Hàn Quốc hay Sâm Triều Tiên - Việc nghiên cứu tạo nguồn nguyên liệu của các loài Sâm trên thế giới đã được nhiều tác giả tiến hành trong nhiều năm, và tại Việt Nam cũng đã khẳng định tính hiện thực của khả năng tạo nguồn Sâm bằng con đường nuôi cấy mô tế bào Nhưng cần nhiều hơn các nghiên cứu đối với loài Sâm Ngọc Linh của Việt Nam để Việt Nam có thể chủ động nguồn nguyên dược liệu quý, đồng thời đưa thương hiệu Sâm Việt Nam mang tầm quốc tế - Là một loài Sâm đặc hữu được tìm thấy với số lượng ít và phạm vi phân bố hẹp, rất nhạy cảm với môi trường sống, nguồn cung cấp còn hạn chế, thời gian từ SVTH: NGUYỄN THỊ THU 56 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH lúc trồng từ hạt cho đến khi thu được củ lên đến 5-6 năm Do đó, nguồn Sâm Ngọc Linh đang cạn kiệt dần và nguy cơ tuyệt chủng cao, nên cần có nhiều biện pháp cấp bách để bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên thiên nhiên quốc gia SVTH: NGUYỄN THỊ THU 57 ... giá trị kinh tế với công nghệ nuôi cấy tế bào thực nhằm mục đích nhân giống sản xuất hợp chất có giá trị kinh tế, tơi thực khóa luận tốt nghiệp: “Cơng nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh (Panax... 2.1: Sâm Ngọc Linh tự nhiên 15 Hình 2.2: Hình thái Sâm Ngọc Linh 16 Hình 2.3: Cây Sâm Ngọc Linh 17 Hình 3.1: Mơ sẹo Sâm Ngọc Linh 28 Hình 3.2: Chời Sâm Ngọc Linh. .. quan Sâm Ngọc Linh - Tìm hiểu số công nghệ nuôi cấy tế bào Sâm Ngọc Linh SVTH: NGUYỄN THỊ THU 12 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP GVHD: BÙI VĂN THẾ VINH CHƯƠNG II TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu kỹ thuật nuôi cấy