i TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM o0o ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC GVHD: Ths. Nguyễn Thanh Tùng SVTH: Phan Ngọc Lâm Bùi Quang Đạt MSSV: 106110038 106110048 Tp.HCM, tháng 08 năm 2010 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình nghiên cứu và viết bài đồ án tốt nghiệp này, chúng tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của quý thầy cô trường Đại học Kỹ thuật_ Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh và các cô chú trong viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh. Trước hết, chúng tôi xin chân thành cảm ơn đến quí thầy cô trường Đại học Kỹ thuật công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy bảo cho chúng tôi suốt th ời gian học tập tại trường. Chúng tôi cũng xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến các Cô chú trong Lab hóa lý viện Pasteur, đặc biệt là thầy Nguyễn Thanh Tùng đã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết để chỉ dạy, hướng dẫn nghiên cứu và giúp chúng tôi vượt qua mọi khó khăn trong lúc thực hiện đề tài. Mặc dù chúng tôi đã có nhiều cố gắng hoàn thiện bài đồ án này bằng tất cả sự nhiệt tình và năng lự c của mình, tuy nhiên không thể tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được những đóng góp quý báu của thầy cô và các bạn. TP. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2010 Học viên Phan Ngọc Lâm _ Bùi Quang Đạt iii TÓM TẮT ĐỒ ÁN Bảo vệ thực phẩm và vệ sinh an toàn thực phẩm giữ vị trí quan trọng trong bảo vệ sức khỏe cộng đồng. Ngoài ra còn liên quan đến sự phát triển về kinh tế văn hóa và xã hội của đất nước, nhằm nâng cao đời sống, hạnh phúc của nhân dân và dảm bảo lợi ích tính mệnh của người tiêu dùng. Và ngày nay càng có nhiều trường hợp ăn rau củ quả bị ngộ độc nitrate, do lượng nitrate dư quá nhiều. Để xác định chính xác hàm lượng nitrate trong rau củ quả có nằm trong sự cho phép của WHO hay không thì cần phải có phương pháp tốt. Để xác định hàm lượng nitrate trong rau quả trước hết phải chiết tách nitrate ra khỏi rau và sau đó xác định nó bằng một trong các phương pháp như trắc quang, sắc ký, cực phổ, cực chọn lọc ion . . .Ở đây chúng tôi đưa ra phương pháp nghiên cứu chiết tách nitrate bằng phương pháp nghiền và xác định hàm lượng nitrate trong rau củ bằ ng sắc kí lỏng hiệu năng cao HPLC. Nội dung đồ án của chúng tôi bao gồm:  Tổng quan về nitrate, lí thuyết HPLC, hệ thống HPLC, cách chọn điều kiện sắc ký.  Đưa ra quy trình thử nghiệm và thẩm định lại quy trình thử nghiệm nitrate.  Khảo sát hàm lượng nitrate trên một số loại rau củ quả.  Đưa ra kết luận và kiến nghị. iv MỤC LỤC Đề mục Trang Trang bìa i Nhiệm vụ đồ án Lời cảm ơn ii Tóm tắt đồ án iii Mục lục iv Danh sách hình vẽ v Danh sách bảng biểu vi CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1 1.1 Lý do chọn lựa đề tài 1 1.2 Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT 3 2.1 Tổng quan về nitrate 3 2.1.1 Giới thiệu về nitrate 3 2.1.2 Nguồn gốc của nitrat. Vì sao nitrate có nhiều trong đất? 3 2.1.3 Ảnh hưởng của nitrate đối với sức khỏe con người 5 2.1.4 Quy định hàm lượng nitrate trong một số loại rau củ 8 2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate 10 2.2 Tổng quan về HPLC 18 2.2.1 Giới thiệu HPLC 18 2.2.2 Khái niệm HPLC 18 2.2.3 Phân loại sắc ký 18 2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột 20 2.2.5 Các đại lượng đặc trưng của sắc ký đồ 21 2.3 Hệ thống HPLC 27 iv 2.3.1 Bình đựng dung môi 28 2.3.2 Bộ phận khử khí (Degasse) 30 2.3.3 Hệ thống bơm 31 2.3.4 Bộ phận tiêm mẫu 34 2.3.5 Cột sắc ký 35 2.3.6 Detector 40 2.3.7 Bộ phận xử lý và ghi tín hiệu 45 2.4 Chọn điều kiện sắc ký 46 2.4.1 Lựa chọn pha tĩnh 46 2.4.2 Lựa chọn pha động 47 2.4.3 Chuẩn bị dụng cụ và máy móc 49 2.4.4 Chuẩn bị dung môi pha động 50 2.4.5 Chuẩn bị mẫu đo HPLC 50 2.4.6 Cách sử dụng máy HPLC 50 CHƯƠNG 3. PHƯƠ NG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 3.1 Quy trình thử nghiệm 52 3.1.1 Thuốc thử 52 3.1.2 Thiết bị - dụng cụ 53 3.1.3 Cách tiến hành 56 3.2 Thẩm định quy trình thử nghiệm 59 3.2.1 Độ đúng 60 3.2.2 Độ chính xác 61 3.2.3 Tính đặc hiệu 61 3.2.4 Giới hạn phát hiện 62 3.2.5 Giới hạn định lượng 62 3.2.6 Tính tuyến tính 63 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 64 4.1 Kết quả thẩm định 64 iv 4.1.1 Kiểm tra độ sai lệch của 2 phương pháp xử lý mẫu 64 4.1.2 Độ lặp lại 66 4.1.3 Tính tuyến tính 67 4.1.4 Độ đúng 68 4.1.5 Giới hạn phát hiện 70 4.1.6 Tính đặc hiệu 72 4.2 Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên 1 số loại rau củ quả bằng 2 phương pháp 74 4.3 Một số hình ảnh về sắc kí đồ của mẫu phân tích 75 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 79 5.1 Kết luận 79 5.2 Kiến ngh ị 79 Tài liệu tham khảo I v DANH SÁCH HÌNH VẼ Đề mục Trang Hình 2.1 : Công thức cấu tạo của nitrate 3 Hình 2.2 : Công thức của Nitrosamine 6 Hình 2.3: Xác định nitrate bằng FIA 13 Hình 2.4: Hình biểu diễn sự tương tác các chất trong quá trình sắc ký 20 Hình 2.5: Hình minh họa cho quá trình tách các chất trong cột sắc ký 21 Hình 2.6: Sắc ký đồ 21 Hình 2.7: Sắc ký đồ biễu diễn thời gian lưu của các chất 22 Hình 2.8: Hình biểu diễn độ chọn lọc α 24 Hình 2.9: Hình biễu diễn hệ số không đối xứng T 26 Hình 2.10: Mô hình máy sắc ký HPLC 27 Hình 2.11: Bộ phậ n lọc dung môi 28 Hình 2.12: Hệ thống khử dung môi ngay trên dòng 31 Hình 2.13: Bộ phận tiêm mẫu tự động 35 Hình 2.14: Cột phân tích 36 Hình 2.15: Cột bảo vệ 36 Hình 2.16: Detector UV 43 Hình 3.1: Bộ siêu lọc 54 Hình 3.2: Cân điện tử 54 Hình 3.3: Bình lọc dung môi 54 Hình 3.4: Bộ chiết SPE với bơm hút chân không 55 Hình 3.5: Máy rung siêu âm 55 Hình 3.6: Máy sắc ký Agilent 1100 55 Hình 3.7: Quy trình xử lý mẫu 56 Hình 4.1: Đường chuẩn nitrate 64 Hình 4.2: Đường chuẩn nitrate 67 v Hình 4.3: Đường chuẩn nitrate 68 Hình 4.4: Đường nền của mẫu blank 70 Hình 4.5: Đường nền của chuẩn Nitrate ở nồng độ 0.01ppm 70 Hình 4.6: Chồng phổ 2 chất chuẩn nitrate và blank 71 Hình 4.7: Phổ của nitrate (bên phải) 72 Hình 4.8: Phổ của nitrate (bên trái) 72 Hình 4.9: Phổ của nitrite 73 Hình 4.10: Chồng phổ nitrate của mẫu củ dền, khoai tây với chuẩn nitrate 75 Hình 4.11: Chồng phổ nitrate của mẫu hành lá C18 và Carrez 75 Hình 4.12: Sắc ký đồ chuẩn nitrate 5ppm 76 Hình 4.13: Sắc ký đồ mẫu củ dề n 76 Hình 4.14: Sắc ký đồ mẫu cải bẹ xanh 77 Hình 4.15: Sắc ký đồ mẫu cà rốt 77 Hình 4.16: Sắc ký đồ mẫu khoai tây 78 Hình 4.13: Sắc ký đồ mẫu hành lá 78 vi DANH SÁCH BẢNG BIỂU Đề mục Trang Bảng 2.1: Hàm lượng nitrate cho phép trong một số loại rau quả theo tiêu chuẩn của WHO (đơn vị: mg/kg sản phẩm) 9 Bảng 2.2: Tính ứng dụng của các ion đếm khác nhau 16 Bảng 2.3: Tính chất đặc trưng của một số loại Detector 44 Bảng 2.4: Độ phân cực của 1 số dung môi 49 Bảng 3.1: Yêu cầu thẩm định phương pháp phân tích 60 Bảng 4.1: Kết quả chuẩn nitrate 64 Bảng 4.2: Kết quả mẫu xà lách 65 Bảng 4.3: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng Carrez 66 Bảng 4.4: Kết quả mẫu xà lách tinh sạch bằng cột C18 66 Bảng 4.5: Kết quả chuẩn nitrate 67 Bảng 4.6: Kết quả chuẩn nitrate 68 Bảng 4.7: Kết quả mẫu mồng tơi tinh sạch bằng cột C18 69 Bảng 4.8: Kết quả mẫu mồng tơi tinh sạch bằng Carrez 69 Bảng 4.9: Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên một số mẫu rau quả (C18) 74 Bảng 4.10: Kết quả khảo sát hàm lượng nitrate trên một số mẫu rau quả (Carrez) 74 CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1 CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1 Lý do chọn lựa đề tài Hiện nay, an toàn vệ sinh lương thực, thực phẩm đang là vấn đề cấp bách được rất nhiều người quan tâm. Số người phải cấp cứu vào bệnh viện do ăn phải thức ăn bị nhiễm độc ngày càng tăng trong những năm gần đây. Do chạy theo năng suất, một bộ phận nông dân đã sử dụng quá liều lượng các loại phân bón và thuốc bảo vệ thực vật làm nhiễm độc cho các loại rau quả đẫn đến gây độc thậm chí nguy hiểm đến tính mạng con người. Rau quả là sản phẩm nông nghiệp cực kỳ quan trọng đối với việc cung cấp vitamin, khoáng và các chất bổ dưỡng khác liên quan đến sức khoẻ con người. Nhiều loại rau quả được con người sử dụng ở dạng tươi sống vì thế các tác nhân hoá học sử dụng cho rau quả dễ bị hấp thụ và chuyển trực tiếp vào cơ thể con người. Nitrate là một ion độc có trong rau quả, hàm lượng của nó liên quan chặt chẽ đến liều lượng phân đạm sử dụng. Sự có mặt của nitrate với hàm lượng lớn gây hai tác động xấu đến sức khoẻ : • Sự tạo thành methemoglobinemia làm mất khả năng vận chuyển oxi của hemoglobin. Trẻ em mắc chứng bệnh này thường xanh xao (blue bay) và dễ bị đe doạ đến cuộc sống đặc biệt là trẻ em dưới sáu tháng tuổi. • Sự tạo thành các hợp chất gây ung thư (Nitrosamine). Do vậy, việc phân tích xác định hàm lượng của các độc tố (trong đó có nitrate) có trong rau quả là hết sức cần thiết nhằm đánh giá chất lượng rau quả trên thị trường đồng thời có thể giúp các cơ quan chức năng trong việc kiểm tra giám sát chất lượng lương thực, thực phẩm nhằm bảo vệ sức khoẻ người tiêu dùng. Đó là lí do mà chúng em thực hiện đề tài nghiên cứu đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate có trong rau củ quả. 1.2 Mục tiêu, đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài Mục tiêu nghiên cứu: ¾ Tìm hiểu tính chất vật lí, hoá lí, tác hại của nitrate có trong rau củ quả. [...]...CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả có mặt trên thị trường Đối tượng nghiên cứu: một số loại rau củ quả phổ biến trong bữa ăn hàng ngày Phạm vi nghiên cứu: rau củ quả được mua từ một số chợ trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh... trường quốc tế Do nitrate và nitrite có độc tính cao như vậy, ảnh hưởng rất nhiều đến sức khỏe con người nên cần có phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ để đưa ra khuyến cáo cho mọi người Dưới đây là một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate 2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate 2.1.5.1 Phương pháp thể tích Người ta có thể xác định nitrate theo phương pháp này dựa trên... Tổng quan về HPLC 2.2.1 Giới thiệu HPLC HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography) Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng... Sắc ký bắt cặp ion là một dạng hình thức khác của sắc ký trao đổi ion Nhiều vấn đề có thể được giải quyết bằng một trong hai phương pháp nhưng sắc ký trao đổi ion không hiệu quả bằng sắc ký bắt cặp ion trong việc tách những hỗn hợp acid, base và trung tính trong một số tình huống Pha tĩnh sử dụng trong sắc ký bắt cặp ion là cột pha đảo Những mẫu có ion có thể được tách ra bởi sắc ký hấp phụ pha đảo,... chỉ đang ứng dụng sắc ký hấp phụ vào phân tích mẫu 2.2.4 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột Pha tĩnh là một yếu tố quan trọng quyết định bản chất của quá trình sắc ký và loại sắc ký: Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký phân bố hay sắc ký chiết Nếu pha... cực không ion hoá và tan được trong dung môi hữu cơ Bằng cách chọn một cặp đôi thích hợp và điều chỉnh nồng độ của nó, ion Mẫu+ và ion Mẫu- có thể được ly trích một cách hiệu quả vào trong một pha hữu cơ Việc sử dụng phương pháp sắc ký bắt cặp ion để tách những mẫu chứa ion có những điều thuận lợi được tóm tắt như sau: • Có thể sử dụng hệ thống pha đảo để tách vì cột C18 có hiệu năng cao hơn so với cột... thiệp của người sản xuất bằng chế độ dinh dưỡng cho đến tác động của các yếu tố môi trường Khi trời râm và độ ẩm cao, lượng nitrate tích lũy trong cây cao gấp 3 lần bình thường Lượng nitrate cũng tăng cao khi trời nắng và nhiệt độ cao Nhưng trong điều kiện trời nắng và nhiệt độ thấp thì lượng tích lũy nitrate trong cây giảm đi rất nhiều Khả năng tích lũy nitrate trong nông phẩm còn phụ thuộc vào từng... những nhóm ion của phân tử mẫu Phương pháp này phù hợp tách các chất (ví dụ như amino acid), những sản phẩm chuyển hóa ion và ion hữu cơ 2.2.3.3 Sắc ký ghép cặp ion Phương pháp ion ghép cặp có thể cũng được sử dụng cho sự tách ra của những hỗn hợp ion và vượt qua một số vấn đề cố hữu của phương pháp trao đổi ion 2.2.3.4 Sắc ký rây phân tử- sắc ký gel Chế độ này có thể được chia thành sắc ký thấm chất... quan về nitrate 2.1.1 Giới thiệu về nitrate Nitrate là muối của acid nitrite Trong muối nitrate, ion NO3- có cấu tạo hình tam giác đều với góc ONO bằng 1200 và độ dài liên kết N-O bằng 1,218 A0 Ion NO3- không có màu nên các muối nitrate của những cation không màu đều không có màu Hầu hết các muối nitrate đều dễ tan trong nước Một vài muối hút ẩm trong không khí như NaNO3 và NH4NO3 Muối nitrate của những... khả năng tách càng rõ ràng 23 CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN LÝ THUYẾT Hình 2.8: Hình biểu diễn độ chọn lọc α 2.2.5.4 Số đĩa lý thuyết N : Số đĩa lý thuyết là đại lượng biểu thị hiệu năng của cột trong một điều kiện sắc ký nhất định Mỗi đĩa lý thuyết trong cột sắc ký giống như là một lớp pha tĩnh có chiều cao là H Tất nhiên lớp này có tính chất động, tức là một khu vực của hệ phân tách mà trong đó một cân bằng . ¾ Đưa ra phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ quả bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. ¾ Khảo sát hàm lượng nitrate có trong một số loại rau củ quả có mặt trên. ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU VÀ KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG NITRATE CÓ TRONG MỘT SỐ LOẠI RAU CỦ QUẢ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO HPLC GVHD: Ths. Nguyễn Thanh. cần có phương pháp xác định hàm lượng nitrate trong rau củ để đưa ra khuyến cáo cho mọi người. Dưới đây là một số phương pháp xác định hàm lượng nitrate. 2.1.5 Một số phương pháp xác định hàm