BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP VÀ THỦY SẢN o0o BÁO CÁO TỔNG HỢP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG XOAN TA BIẾN ĐỔI GEN Chủ nhiệm đề tài : ThS. Hồ Văn Giảng Cơ quan chủ trì : Trường Đại học Lâm nghiệp Địa chỉ : Xuân Mai - Chương Mỹ - Hà Nội Điện thoại : 04.33720668; 0912218584 E.mail : hogiangbiotech@gmail.com 8778 Hà Nội- 2010 BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN CHƯƠNG TRÌNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP VÀ THỦY SẢN o0o BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TẠO GIỐNG XOAN TA BIẾN ĐỔI GEN Chủ nhiệm đề tài ThS. Hồ Văn Giảng Cơ quan chủ trì đề tài Hà Nội-2010 Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 i Lời cảm ơn Chủ nhiệm và nhóm cán bộ thực hiện đề tài “Nghiên cứu tạo giống Xoan ta biến đổi gen” xin chân trọng cảm ơn Văn phòng Chương trình Công nghệ sinh học Nông nghiệp & Thủy sản, Vụ Khoa học Công nghệ & Môi trường - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn đã cấp kinh phí và tạo nhiều điều kiện thuận lợi để thực hiện đề tài. Xin cảm ơn Ban Giám hiệu, các phòng ban có liên quan, khoa Lâm học - Trường Đạ i học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện thuận lợi để triển khai đề tài theo kế hoạch. Xin cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Phòng Công nghệ ADN ứng dụng – Viện Công nghệ sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tích cực tham gia và có nhiều hỗ trợ cho công trình này. Xin cảm ơn các tập thể, cá nhân, các chuyên gia, các nhà khoa học đã động viên, tư vấn, góp ý cho chúng tôi thực hiệ n công trình khoa học này. ĐHLN, ngày 01 tháng 12 năm 2010 CƠ QUAN CHỦ TRÌ ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI Hồ Văn Giảng Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 ii PHẦN I: MỞ ĐẦU Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 iii BẢNG VIẾT TẮT 1 4CL1 4-coumarate:coenzyme A ligase 2 A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens 3 Amp Ampicillin 4 BAP Benzyladenine purin 5 Bp Base pair 6 BSA Bovine serum albumin 7 CaMV35S-P Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter 8 CaMV35S-P Cauliflower Mosaic virus 35S promoter 9 cDNA Complementary DNA 10 CNSH Công nghệ sinh học 11 DNA Deoxyribonucleotide acid 12 E.coli Escheria coli 13 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid 14 FAO Food and Agriculture Organization 15 GA20 GA20 - oxidase 16 GMC Genetically modified crops 17 Gus Β-Glucuronidase gene 18 IBA Indole-3-butyric acid 19 IPTG Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside 20 Kan Kanamycin 21 kDa Kilodalton 22 LB Luria Bertani 23 MCS Multiple cloning site 24 NAA 1 Napthye acetic acid 25 OD Optical density 26 PCR Polymerase chain reaction 27 RNA Ribonucleic acid 28 RT-PCR Reverse transcription PCR 29 SDS Sodium dodecyl sulphate 30 Sol Solution 31 T-DNA Transferred DNA 32 TE Tris EDTA 33 Ti-Plasmide Tumor inducing plasmide 34 X-gluc 5-bromo-4-cloro-3inđolyl β-D glucuronic acid Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 iv MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN i PHẦN I: MỞ ĐẦU ii BẢNG VIẾT TẮT iii MỤC LỤC iv DANH LỤC BẢNG ix DANH MỤC HÌNH xi DANH MỤC BIỂU ĐỒ xiv NHỮNG NGƯỜI THAM GIA THỰC HIỆN ĐỀ TÀI xv BÁO CÁO THỐNG KÊ xvi PHẦN II: NỘI DUNG CHÍNH 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Tình hình nghiên cứu và phát triển cây lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới 6 1.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen trong nước 8 1.3. Khái quát về đối tượng nghiên cứu 9 1.3.1. Cây Xoan ta (Melia azedarach L.) 9 1.3.2. Các Gen mục tiêu: GA20 và 4CL1 11 1.3.3. Một số hệ vector đã sử dụng trong đề tài 15 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1. Phương pháp tuyển chọn cây Xoan ta trội 16 2.2. Phương pháp xây dựng hệ thống tái sinh Xoan ta 17 2.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh cây Xoan ta thông qua phôi soma 17 2.2.1.1. Tạo cây mầm Xoan ta in vitro 17 2.2.1.2. Tạo mô sẹo 17 2.2.1.3. Tạo phôi soma 18 2.2.1.4. Tái sinh chồi từ phôi soma 19 2. 2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh cây thông qua đa chồi 20 2.2.2.1. Tạo cây mầm Xoan ta in vitro 20 2.2.2.2. Tạo đa chồi Xoan ta 20 2.2.2.3. Kích thích tăng trưởng chồi 21 2.2.2.4. Tạo rễ 22 Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 v 2.2.2.5. Trồng và chăm sóc cây ở nhà lưới 23 2.3. Phân lập các gen mục tiêu và promoter đặc hiệu GRP1 23 2.3.1. Tách chiết RNA từ các đối tượng thực vật 23 2.3.1.1. Tách chiết ARN từ cây Arabidopsis thaliana 23 2.3.1.2. Tách chiết mARN từ cây Thông đuôi ngựa (Pinus massoniana) 26 2.3.2. Tổng hợp cDNA và nhân gen mục tiêu (gen GA20 và gen 4CL1) 26 2.3.2.1. Tổng hợp cDNA và nhân gen GA20 26 2.3.2.2. Tổng hợp cDNA và nhân gen 4CL1 28 2.3.3. Sàng lọc các dòng vector tách dòng mang gen mục tiêu 29 2.3.3.1. Sàng lọc gen GA20 29 2.3.3.2. Sàng lọc gen 4CL1 32 2.3.4. Xác định trình tự nucleotide của gen 4CL1 và gen GA20 33 2.3.5. Phân lập promoter đặc hiệu ở tầng xylem (promoter GRP1.8) 33 2.4. Thiết kế vector và biểu hiện gen mục tiêu ở vi khuẩn E.coli 37 2.4.1. Thiết kế vector 37 2.4.1.1. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen mang gen 4CL1 37 2.4.1.2. Thiết kếcấu trúc vector biểu hiện gen mang gen GA20 40 2.4.2. Biểu hiện gen mục tiêu 4CL1 và GA20 ở Vi khuẩn E.coli 40 2.4.2.1. Biểu hiện gen 4CL1 ở vi khuẩn E.coli 40 2.4.2.2. Biểu hiện gen GA20 ở Vi khuẩn E.coli 41 2.5. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen 42 2.5.1. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen GA20 42 2.5.2 Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen 4CL1 45 2.5.3. Tạo chủng vi khuẩn A.tumefacies mang vector chuyển gen 48 2.6. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào cây Xoan ta thông qua A. tumefaciens (sử dụng gen Gus-plus) 49 2.6.1. Xác định ngưỡng chịu đựng của Xoan ta đối với chất chọn lọc 49 2.6.2. Chuyển gen chỉ thị (gen GUS -plus) vào Xoan ta 51 2.6.3. Xác định sự có mặt và biểu hiện của gen chỉ thị (gen GUS-plus) 54 2.7. Chuyển các gen mục tiêu vào cây Thuốc lá 56 2.7.1. Chuyển gen GA20 vào cây Thuốc lá 56 2.7.2. Chuyển gen 4CL1 vào cây Thuốc lá 57 2.7.3. Xác định sự có mặt của gen mục tiêu ở cây Thuốc lá chuyển gen 58 2.8. Chuyển gen mục tiêu (gen GA20 và gen 4CL1) vào Xoan ta 59 2.8.1. Chuyển gen tăng khả năng sinh trưởng GA20 vào Xoan ta 59 Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 vi 2.8.2. Chuyển gen tăng chất lượng gỗ 4CL1 vào Xoan ta 61 2.9. Tái sinh và trồng cây Xoan ta chuyển gen ở nhà lưới 62 2.9.1. Tái sinh cây Xoan ta chuyển gen 62 2.9.2. Trồng cây Xoan ta chuyển gen ở Nhà lưới 63 2.10. Phương pháp phân tích cây Xoan ta chuyển gen 63 2.10.1. Tách chiết ADN tổng số 63 2.10.2. Tách chiết RNA tổng số 64 2.10.3. Kỹ thuật PCR 64 2.10.4. Kỹ thuật lai Southern blot 65 2.10.5. Kỹ thuật RT-PCR 68 2.10.6. Phương pháp phân tích lignin trong cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 69 2.10.6.1. Nhuộm lignin trong thân cây 69 2.10.6.2. Xác định hoạt tính của enzyme 4CL1 69 2.10.6.3. Xác định hàm lượng lignin 71 2.10.7. Đánh giá sinh trường của cây Xoan ta chuyển gen GA20 72 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 73 3.1. Tuyển chọn cây Xoan ta trội 74 3.1.1. Xác định địa điểm tuyển chọn cây Xoan ta trội 74 3.1.2. Quan hệ giữa sinh trưởng chiều cao và đường kính ngang ngực với tuổi của Xoan ta tại các khu vực điều tra 74 3.1.3. Xác định cây Xoan ta trội 78 3.2. Xây dựng hệ thống tái sinh Xoan ta 81 3.2.1. Xây dựng hệ thống tái sinh cây Xoan ta in vitro thông qua phôi soma 81 3.2.1.1. Tạo cây mầm Xoan ta in vitro 81 3.2.1.2. Tạo mô sẹo từ mảnh lá mầm cây in vitro 84 3.2.1.3. Tạo mô sẹo từ đoạn thân cây mầm 85 3.2.1.4. Kích thích mô sẹo tạo phôi soma 87 3.2.1.5. Kích thích phôi soma tái sinh chồi 88 3.2.2. Xây dựng hệ thống tái sinh cây Xoan ta in vitro thông qua đa chồi 90 3.2.2.1. Tạo đa chồi từ mảnh lá mầm 90 3.2.2.2. Tạo đa chồi từ đoạn thân cây mầm 94 3.2.2.3. Kích thích tăng trưởng chồi 98 3.2.2.4. Tạo rễ 100 3.2.2.5. Huấn luyện và chăm sóc cây ở nhà lưới 101 3.3. Kết quả phân lập gen mục tiêu và promoter GRP1.8 106 Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 vii 3.3.1. Phân lập gen mục tiêu 4CL1và GA20 106 3.3.1.1. Thiết kế mồi nhân gen mục tiêu 106 3.3.1.2. Tách chiết RNA tổng số từ Thông đuôi ngựa và Arabidopsis thaliana 107 3.3.1.3. Nhân gen mục tiêu 4CL1 và GA20 từ cDNA bằng kỹ thuật PCR từ cDNA 108 3.3.1.4. Sàng lọc gen mục tiêu 4CL1 và GA20 109 3.3.1.5. Xác định và phân tích trình tự nucleotide của gen mục tiêu 112 Phân lập promoter biểu hiện gen đặc hiệu ở tầng Xylem GRP1.8 từ cây Đậu cô ve (Phaseolus vulgaris L.) 118 3.3.2.1. Thiết kế cặp mồi nhân Promoter GRP1.8 118 3.3.2.2. Tách chiết DNA tổng số 118 3.3.2.3. Nhân promoter GRP 1.8 từ DNA tổng số 119 3.3.2.4. Sàng lọc promoter GRP 1.8 120 3.3.2.5. Xác định và đăng ký trình tự nucleotide của promoter GRP 1.8 121 3.4. Biểu hiện gen mục tiêu ở vi khuẩn E.coli 123 3.4.1. Thiết kế cấu trúc vector biểu hiện gen 4CL1 và GA20 123 3.4.1.1. Tách plasmid từ các dòng vi khuẩn E.coli Rosetta gami TM 123 3.4.1.2. Kiểm tra vector biểu hiện tái tổ hợp mang gen mục tiêu 124 3.4.2. Biểu hiện gen mục tiêu 4CL1 và GA20 ở vi khuẩn E.coli 125 3.5. Tối ưu hóa quy trình chuyển gen vào Xoan ta thông qua A. tumefaciens 127 3.5.1. Nghiên cứu xác định ngưỡng nồng độ chất chọn lọc PPT đối với khả năng sống sót của thể nhận gen 127 3.5.2. Xác định nồng độ kháng sinh cefotaxime diệt khuẩn thích hợp 129 3.5.3. Ảnh hưởng của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen 130 3.5.4. Tái sinh và kiểm tra cây chuyển gen Gus-plus 132 3.6. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang vector chuyển gen 135 3.6.1. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen 4CL1 135 3.6.1.1. Tạo cấu trúc vector chuyển gen pPTN289-4CL1 136 3.6.1.2. Tạo cấu trúc vector chuyển gen pBI121-4CL1 137 3.6.1.3. Sàng lọc các dòng vi khuẩn E.coli mang vector chuyển gen 138 3.6.2. Thiết kế cấu trúc vector chuyển gen mang gen GA20 140 3.6.3. Tạo chủng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen 144 Báo cáo Tổng kết đề tài . Thời gian thực hiện 2007 – 2010 viii 3.7. Chuyển gen mục tiêu vào cây Thuốc lá nhờ vi khuẩn A.tumefacies 146 3.8. Chuyển gen mục tiêu GA20 và 4CL1 vào Xoan ta 149 3.8.1. Chuyển gen tăng khả năng sinh trưởng GA20 vào Xoan ta 149 3.8.2. Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta 152 3.9. Phân tích các dòng Xoan ta chuyển gen 154 3.9.1. So sánh kiểu hình cây Xoan ta chuyển gen với cây đối chứng 154 3.9.2. Xác định sự có mặt của gen mục tiêu ở cây Xoan ta chuyển gen 155 3.9.2.1. Phân tích PCR 155 3.9.2.2. Phân tích Southern blot 156 3.9.3. Xác định sự biểu hiện của gen mục tiêu ở cây Xoan ta chuyển gen 158 3.9.3.1.Phân tích RT-PCR 159 3.9.3.2. Phân tích lignin trong cây chuyển gen 4CL1 161 3.9.3.3. Phân tích sinh trưởng cây Xoan ta chuyển gen GA20 164 PHẦN III. KẾT LUẬN TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ 168 TÀI LIỆU THAM KHẢO 173 [...]... của gen 4CL1 ở cây Xoan ta chuyển gen gen Xác định sự biểu hiện của gen GA20 ở cây Xoan ta chuyển gen Xác định sự biểu hiện của gen 4CL1 ở cây Xoan ta chuyển gen 2010 Trung tâm Giống & CNSH -ĐHLN Trung tâm Giống & CNSH -ĐHLN 10 Tái sinh cây Xoan ta chuyển gen 10.1 Tái sinh cây Xoan ta chuyển gen GA20 10.2 Tái sinh cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 11 Trồng cây Xoan ta chuyển gen ở nhà lưới Trồng cây Xoan ta. .. 95%; cây sinh trưởng, phát triển bình thường Quy 2 trình kỹ 01 quy - Tạo ra được Qui trình chuyển gen GA20 thuật tạo giống trình cây Xoan ta và 4CL1 vào Xoan ta nhờ vi gen khuẩn A tumefaciens đã tạo Xoan ta biến đổi chuyển gen mang gen GA20 được 05 dòng Xoan ta chuyển hoặc gen 4CL1, gen GA20 và 03 dòng Xoan ta đảm bảo tiêu chuyển gen 4CL1 chuẩn chất lượng như đăng kí Thời gian thực hiện 2007 – 2010... gen GA20 vào Xoan ta 151 Hình 3.50: Hình ảnh minh họa các giai đoạn chính trong quy trình chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta 153 Hình 3.51: Cây Xoan ta chuyển gen GA20 và cây đối chứng 1 tháng tuổi ở nhà lưới 154 Hình 3.52: Cây Xoan ta chuyển gen 4CL1 và cây đối chứng 1 tháng tuổi ở nhà lưới 154 Hình 3.53: Các dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 cho kết quả PCR dương tính 155 Hình 3.54: Các dòng Xoan ta chuyển gen. .. tâm Giống & CNSH -ĐHLN 2008 2009 Trung tâm Giống & CNSH -ĐHLN 2008 2008 Trung tâm Giống & CNSH -ĐHLN Nghiên cứu biểu hiện gen GA20 ở vi khuẩn E.coli 2008 2009 Trung tâm Giống & CNSH – ĐHLN 5 Tối ưu hoá quy trình chuyển gen vào Xoan ta (sử dụng gen chỉ thị GUS) Trung tâm Giống & Nghiên cứu lựa chọn loại mẫu 2008 2008 CNSH -ĐHLN và tuổi mẫu dùng làm thể nhận gen 2008 2008 Trung tâm Giống & 5.2 Nghiên cứu. .. thuật chuyển gen vào Xoan ta thông qua A tumefaciens được xây dựng trong nghiên cứu này cũng là tiền đề cho nghiên cứu chuyển các gen mục tiêu khác đang được quan tâm vào Xoan ta - Các loại vật liệu trung gian được tạo ra trong nghiên cứu này (gen GA20, gen 4CL1, promoter GRP1.8, các cấu trúc vector chuyển gen mang gen GA20 hay 4CL1, các chủng vi khuẩn A.tumefaciens mang vector chuyển gen GA20 hay... vector chuyển gen 2 Phòng Công Phòng Công - Tham gia nghiên - Hệ thống tái sinh Xoan nghệ Tế bào nghệ Tế bào cứu xây dựng hệ ta thông qua đa chồi và Thực vật – Thực vật – thống phôi soma Viện Công Viện nghệ sinh nghệ học Công tái - Quy Xoan ta sinh - Tham học sinh gia xây trình kỹ thuật chuyển gen vào Xoan ta dựng quy trình - Một số dòng Xoan ta chuyển gen chỉ thị GUS vào Xoan ta chuyển gen - Các báo... 3.22: Kết quả chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta 152 Bảng 3.23 : Ký hiệu các dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 cho kết quả PCR dương tính 156 Bảng 3.24: Ký hiệu các dòng Xoan ta chuyển gen GA20 cho kết quả PCR dương tính 156 Bảng 3.25: Hoạt độ riêng của enzyme 4CL1 ở thân các dòng Xoan ta chuyển gen 4CL1 và cây đối chứng không chuyển gen Bảng 3.26: Hàm lượng lignin trong thân cây Xoan chuyển gen 4CL1 và cây đối... nhân chọn lọc 5.3 Nghiên cứu chuyển gen chỉ thị 2008 2008 Phòng CN Tế bào TV (gen GUS) vào thể nhận gen Viện CNSH 5.4 Nghiên cứu sàng lọc cây 2009 2008 Trung tâm Giống & 6.3 chuyển gen chỉ thịvectorGUS) Thiết kế cấu trúc (gen chuyển 2008 2009 Phòng -ĐHLN CNSH CN ADN ứng gen mang gen GA20 dụng - CN Tế bào 2009 2008 Phòng Viện CNSHTV5.5 Nghiên cứu xác định sự biểu Viện CNSH hiện của gen chỉ thị ở thể... được thiết lập trong nghiên cứu này là cơ sở cho nghiên cứu chuyển các gen mục tiêu khác vào Xoan ta Kết quả này còn mở ra hướng nghiên cứu tạo giống Xoan ta theo các phương pháp khác dựa trên cơ sở của công nghệ tế bào thực vật Ngoài ra, quy trình kỹ thuật này còn là cơ sở để tiến hành nhân giống in vitro Xoan ta có phẩm chất di truyền cao được chọn tạo theo các phương pháp truyền thống hay tiên tiến... Chuyển gen 4CL1 vào cây 2009 2009 Phòng CN Tế bào TVchuyển gen 4CL1 Thuốc lá Viện CNSH 5.1 Thời gian thực hiện 2007 – 2010 xxiii Báo cáo Tổng kết đề tài 7.3 Kiểm tra sự có mặt của gen mục tiêu ở cây Thuốc lá 2009 2009 Trung tâm Giống & CNSH -ĐHLN 8 Chuyển gen mục tiêu (gen GA20 và gen 4CL1) vào Xoan ta 8.1 8.2 Chuyển gen tăng khả năng sinh trưởng (gen GA20) vào Xoan ta Chuyển gen tăng chất lượng gỗ (gen . hình nghiên cứu và phát triển cây lâm nghiệp biến đổi gen trên thế giới 6 1.2. Tình hình nghiên cứu tạo giống cây lâm nghiệp biến đổi gen trong nước 8 1.3. Khái quát về đối tượng nghiên cứu. Chuyển gen tăng chất lượng gỗ 4CL1 vào Xoan ta 61 2.9. Tái sinh và trồng cây Xoan ta chuyển gen ở nhà lưới 62 2.9.1. Tái sinh cây Xoan ta chuyển gen 62 2.9.2. Trồng cây Xoan ta chuyển gen ở. Chuyển gen mục tiêu GA20 và 4CL1 vào Xoan ta 149 3.8.1. Chuyển gen tăng khả năng sinh trưởng GA20 vào Xoan ta 149 3.8.2. Chuyển gen 4CL1 vào Xoan ta 152 3.9. Phân tích các dòng Xoan ta chuyển gen