BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM B B Á Á O O C C Á Á O O T T Ổ Ổ N N G G K K Ế Ế T T Đ Đ Ề Ề T T À À I I N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U K K H H C C N N C C Ấ Ấ P P B B Ộ Ộ : : N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U Q Q U U Y Y T T R R Ì Ì N N H H T T Á Á C C H H C C H H I I Ế Ế T T H H E E S S P P E E R R I I D D I I N N T T Ừ Ừ Q Q U U Ả Ả P P H H Ậ Ậ T T T T H H Ủ Ủ L L À À M M N N G G U U Y Y Ê Ê N N L L I I Ệ Ệ U U S S Ả Ả N N X X U U Ấ Ấ T T T T H H U U Ố Ố C C 7449 15/7/2009 HÀ NỘI – 2008 BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM B B Á Á O O C C Á Á O O T T Ổ Ổ N N G G K K Ế Ế T T Đ Đ Ề Ề T T À À I I N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U K K H H C C N N C C Ấ Ấ P P B B Ộ Ộ : : N N G G H H I I Ê Ê N N C C Ứ Ứ U U Q Q U U Y Y T T R R Ì Ì N N H H T T Á Á C C H H C C H H I I Ế Ế T T H H E E S S P P E E R R I I D D I I N N T T Ừ Ừ Q Q U U Ả Ả P P H H Ậ Ậ T T T T H H Ủ Ủ L L À À M M N N G G U U Y Y Ê Ê N N L L I I Ệ Ệ U U S S Ả Ả N N X X U U Ấ Ấ T T T T H H U U Ố Ố C C Chủ nhiệm Đề tài: Ths. Nguyễn Văn Chính Những người tham gia: Ths. Trương T. Tố Trinh CN. Nguyễn Quốc Đạt HÀ NỘI – 2008 N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c ii TÓM TẮT Flavonoid glycosid Hesperidin một loại nguyên liệu thuốc kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư, làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch được sử dụng nhiều trong điều trị bệnh cao huyết áp và bệnh trĩ đã được tách chiết từ quả Phật thủ với năng suất chiết là 1,04% so với nguyên liệu khô. Quy trình tách chiết flavonoid hesperidin đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sản xuất thuốc quy mô phòng thí nghi ệm từ nguyên liệu có chứa hesperidin đã được xây dựng trên cơ sở các kết quả khảo sát các thông số công nghệ về nhiệt độ, pH môi trường chiết và môi trường kết tinh, tỷ lệ dung môi vv. Việc chiết tách hesperidin ở quy mô lớn hơn 10 lần quy mô khảo sát đã được nghiên cứu nhằm hoàn chỉnh cơ sở dữ liệu phục vụ cho việc phát triển sản xuất ở quy mô lớn hơn. Hesperidin tách chi ết được đã được xác định cấu trúc, phân tích định tính, định lượng bằng các phương pháp phổ: IR, UV, MS, 1 H-NMR, 13 C- NMR, HPLC và kiểm nghiệm các chỉ tiêu cơ bản. Các kết quả nghiên cứu thu được có thể áp dụng vào sản xuất hesperidin từ nguồn nguyên liệu tự nhiên sẵn có và rất phong phú trong nước ở quy mô pilot nhằm đáp ứng nguyên liệu sản xuất thuốc cho công nghiệp bào chế dược phẩm trong nước. N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c iii MỤC LỤC TÓM TẮT ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG, BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi MỞ ĐẦU 1 I. TỔNG QUAN 3 I.1. Cây Phật thủ 3 I.1.1. Cây phật thủ và tác dụng chữa bệnh của Phật thủ 3 I.1.2. Thành phần hóa học của quả Phật thủ 4 I.2. Flavonoid, các hợp chất flavonoid trong cây họ Cam 6 I.2.1. Flavonoid 6 I.2.2. Flavonoid trong quả cây họ Cam 7 I.3. Hesperidin 11 I.3.1. Tính chất của Hesperidin 12 I.3.2. Tác dụng dược lý của Hesperidin 12 I.3.3. Tổng quan về tình hình nghiên cứu tách chiết hesperidin 17 I.4. Phân tích hesperidin 19 I.4.1. Phổ tử ngoại của hesperidin 20 I.4.2. Phổ khối MS của hesperidin 20 I.4.3. Phân tích hesperidin bằng HPLC 20 II. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 21 II.1. Phương pháp tiếp cận 21 II.2. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị 22 II.2.1. Nguyên liệu, hóa chất 22 II.2.2. Dụng cụ, thiết bị 22 II.3. Phương pháp chiết tách hesperidin 23 II.3.1. Phương pháp chiết flavonoid toàn phần 23 II.3.2. Phương pháp tách chiết Hesperidin 24 II.4. Phân tích sản phẩm 24 III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 25 N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c iv III.1. Tách chiết flavonoid toàn phần từ quả Phật thủ 25 III.2. Tách chiết và tinh chế Hesperidin 25 III.3. Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tách chiết hesperidin từ quả Phật thủ 27 III.3.1. Ảnh hưởng của pH dung môi chiết đến hiệu suất tách chiết hesperidin 27 III.3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết 29 III.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ 30 III.3.4. Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu 32 III.3.5. Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 34 III.3.6. Ảnh hưởng của pH môi trường kết tinh 35 III.4. Kết quả tách chiết hesperidin lượng lớn từ Phật thủ, vỏ Cam và vỏ Quýt 38 III.5. Phân tích và kiểm nghiệm sản phẩm 39 III.5.1. Phổ hồng ngoại và UV của sản phẩm 39 III.5.2. Khối phổ MS của hesperidin 40 III.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR của hesperidin 40 III.5.4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của hesperidin 41 III.5.5. Kết quả kiểm nghiệm 41 III.6. Đề xuất công nghệ sản xuất Hesperidin 42 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 CÁC PHỤ LUC 50 N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c v DANH MỤC BẢNG, BIỂU, HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ Bảng 1: Các hợp chất flavanone dưới dạng aglycone 8 Bảng 2: Các hợp chất flavone dưới dạng aglycone 8 Bảng 3: Các hợp chất polymethoxyflavone 9 Bảng 4: Các hợp chất flavanone-O-glycosid 9 Bảng 5: Flavone-C-glucosid và flavone-O-glucosid 10 Bảng 6: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất tách chiết hesperidin 27 Bảng 7: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết hesperidin.29 Bảng 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết hesperidin 31 Bảng 9: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết hesperidin 33 Bảng 10: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu đến hiệu suất chiết hesperidin 34 Bảng 11: Ảnh hưởng của pH môi trường kết tinh 36 Bảng 12: Hiệu suất chiết hesperidin ở quy mô và nguồn nguyên liệu khác nhau 38 Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất quá trình chiết 28 Biểu đồ 2: Hiệu suất tách chiết hesperidin từ flavonoid toàn phần ở pH khác nhau 28 Biểu đồ 3: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi chiết đến hiệu suất chiết hesperidin 30 Biểu đồ 4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất chiết hesperidin 32 Biểu đồ 5: Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chiết hesperidin 33 Biểu đồ 6: Ảnh hưởng của kích thước nguyên liệu 35 Biểu đồ 7: Ảnh hưởng của pH môi trường kết tinh 36 Hình 1: Cây, hoa và quả Phật thủ 3 Hình 2: Các hợp chất polyphenol chính trong phật thủ 5 Hình 3: Khung flavone và flavanone 6 Hình 4: Cấu trúc phân tử của các nhóm flavonoid 7 Hình 5: Rutinose và neohesperidose 10 Hình 6: Sơ đồ phân mảnh qua bước chuyển vị nội phân tử của hesperidin. 40 Hình 7: Sơ đồ công nghệ sản xuất Hesperidin 44 N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CS: Cộng sự. CP: Cổ phần. DMF: Dimetyl formamid. Gl: Glucose. HPLC: Sắc ký lỏng hiệu năng cao. KL/TT: Khối lượng / Thể tích. KL: Khối lượng. Rh: Rhamnose. THF: Tetrahydofuran. TT/KL: Thể tích/Khối lượng. TP: Toàn phần. TT: Thể tích. YHCT: Y học cổ truyền. N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c 1 MỞ ĐẦU Hesperidin là một Flavonoid có tác dụng kháng viêm, chống ôxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư nhờ khả năng hấp thụ tác nhân gây ung thư. Hesperidin có tác dụng làm bền thành mạch và giảm tính thấm của mao mạch nên được sử dụng trong điều trị bệnh cao huyết áp và bệnh trĩ. Tác dụng chữa ho của hesperidin là do khả năng chống dị ứng nhờ tính chất ức chế việc giải phóng histamine từ các tế bào lớ n. Hesperidin khi dùng phối hợp với vitamin C có tác dụng cộng hưởng và hỗ trợ hấp thụ vitamin C. Hesperidin là hợp chất flavonoid chủ yếu trong vỏ quả cây họ Cửu lý hương (Rutaceace) thường được gọi là họ Cam như: Cam, Quýt, Chanh, Phật thủ, Thanh yên, Bưởi vv. Nhiều bộ phận của cây họ này được sử dụng làm thuốc trong y học cổ truyền để điều trị bệnh đặc biệt là để chữa ho. Đặc biệt thuốc ho đông dược từ Phật thủ có thể dùng được cho trẻ em. Tuy nhiên, việc nghiên cứu tách chiết các hoạt chất có trong các loại dược liệu này để làm nguyên liệu sản xuất thuốc ở nước ta còn được quan tâm chưa nhiều. Năm 2007 Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam hợp tác với Công ty CP Vimedimex nghiên cứu phát triển thuốc ho từ quả Phật thủ. Trong quá trình triển khai nghiên cứu, chúng tôi nhận th ấy phần bã thải còn chứa một lượng lớn flavonoid glycosid mà chủ yếu là hesperidin. Vì vậy chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu chiết hesperidin từ quả Phật thủ nhằm tận dụng và nâng cao hiệu quả kinh tế. Với những lý do đề cập ở trên, việc nghiên cứu chiết xuất Hesperidin từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên sẵn có trong nước trên cơ sở công nghệ tự nghiên cứu là hết sức cần thiế t. Hơn nữa, việc tự sản xuất hesperidin trong nước vừa góp phần đa dạng hóa sản phẩm, vừa góp phần tự chủ, đa dạng hóa nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc phù hợp với mục tiêu, chiến lược xây dựng và phát triển ngành công nghiệp hóa dược. N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c 2 Mục tiêu của đề tài: • Xây dựng quy trình tách chiết, phân lập Hesperidin làm nguyên liệu sản xuất thuốc từ quả phật thủ. Đề tài đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: • Xác định điều kiện chiết tách flavonoid toàn phần từ quả phật thủ. • Phân lập và tinh chế Hesperidin đạt tiêu chuẩn nguyên lieu thuốc. • Xây dựng quy trình tách chiết Hesperidin từ quả phật thủ. • Phân tích kiểm nghiệm một số chỉ tiêu cơ bản của sản phẩm. N N g g h h i i ê ê n n c c ứ ứ u u q q u u y y tr̀ tr̀ n n h h t t á á c c h h c c h h i i ế ế t t h h e e s s p p e e r r i i d d i i n n t t ừ ừ q q u u ả ả p p h h ậ ậ t t t t h h ủ ủ l l à à m m n n g g u u y y ê ê n n l l i i ệ ệ u u s s ả ả n n x x u u ấ ấ t t t t h h u u ố ố c c 3 I. TỔNG QUAN I.1. Cây Phật thủ I.1.1. Cây phật thủ và tác dụng chữa bệnh của Phật thủ Cây Phật thủ có tên khoa học là Citrus medica L var. Sarcodactylis Swingle thuộc chi Cam quýt (Citrus) họ Cửu lý hương (Rutaceace) thường được gọi là họ Cam; tên thường gọi là Buddha's Hand citron, Finger citrom frenit, Phật thủ. [5] Cây Phật thủ là dạng cây nhỏ xanh tốt quanh năm, lá mọc so le, hình trứng, mép có răng cưa nhỏ, gai ngắn mọc ở dưới lá. Vào đầu mùa h ạ ra hoa màu trắng, cánh hoa trên trắng dưới đỏ, quả chín vào mùa đông, vỏ ngoài màu vàng, trên một số những múi chạy dài dọc quả phía dưới tách ra trông như ngón tay nên có tên là phật thủ.[5], [4] (Hình 1) Hình 1: Cây, hoa và quả Phật thủ [...]... C13-NMR, HPLC … để xác định cấu trúc, hàm lượng 24 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU III.1 Tách chiết flavonoid toàn phần từ quả Phật thủ Quy trình tách chiết flavonoid toàn phần: Nguyên liệu Phật thủ khô được sơ chế như miêu tả ở mục II.2.1, đem xay nhỏ Lấy 200g đem nạp vào bình chiết dung tích 3 lít Nạp tiếp 1,0 lít nước cất... C- Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc III.3 Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tách chiết hesperidin từ quả Phật thủ III.3.1 Ảnh hưởng của pH dung môi chiết đến hiệu suất tách chiết hesperidin Quy trình thực nghiệm tách chiết flavonoid toàn phần và tách chiết phân lập hesperidin từ quả Phật thủ được tiến hành như mô tả trong các mục III.1... số liệu phục vụ cho việc phát trển sản xuất ở quy mô lớn hơn sau này 21 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc II.2 Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị II.2.1 Nguyên liệu, hóa chất Chúng tôi sử dụng nguyên liệu là quả Phật thủ thu mua tại chợ Long Biên được sơ chế như mô tả dưới đây và Phật thủ khô, vỏ Cam, vỏ Quýt mua tai phố Lãn Ông, Hà Nội Sơ chế nguyên. . .Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Phật thủ được trồng tại nhiều nơi trong nước ta, thường để lấy quả ăn, làm mứt và làm thuốc Phật thủ còn được trồng ở Trung Quốc, Ấn độ, các nước vùng Địa Trung Hải, Úc, Nam Mỹ, Trung Đông Y học cổ tryuền thường dùng quả phơi khô (Fructus Citri sarcodactyli) Quả phật thủ hiện mới chỉ được... TP, % Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất quá trình chiết Biểu đồ 2: Hiệu suất tách chiết hesperidin từ flavonoid toàn phần ở pH khác nhau Từ kết quả thực nghiệm cho thấy quá trình chiết tốt nhất nên tiến hành ở pH trong khoảng 11 – 12 Ở pH thấp hơn hiệu suất chiết flavonoid toàn phần cũng như hiệu suất hesperidin. .. tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc I.3.3 Tổng quan về tình hình nghiên cứu tách chiết hesperidin I.3.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Như đã đề cập ở trên, Hesperidin được Lebrton tách chiết vào năm 1827 từ vỏ quả cây Hesperides, sau đó nó được tìm thấy trong rất nhiều cây họ Cam (họ Cửu lý hương) [2], [9] Năm 1931, S Gyorgyi và CS chiết hesperidin từ vỏ chanh... Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc phép tạo ra được flavonoid tương đối tinh khiết, tuy nhiên chi phí cao và công nghệ khó áp dụng trong sản xuất lượng lớn [25] Bonnell; M.James trong USP 4,497,838 mô tả công nghệ chiết hesperidin từ vỏ cam; trong đó sử dụng metanol làm dung môi chiết Dịch chiết thu được đem loại bớt metanol cho đến điểm đục, tách. .. phân tách để thu hesperidin, tinh chế, sấy khô và bảo quản Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành tách chiết flavonoid toàn phần từ quả phật thủ bằng dung dịch kiềm Hesperidin được tách chiết, phân lập bằng phương pháp chiết rắn – lỏng sử dụng các dung môi hữu cơ sau đó kết tinh lại trong metanol Trên cơ sở kết quả nghiên cứu thu được, chúng tôi tến hành chiết hesperidin từ các nguyên liệu chứa hesperidin. .. tiến hành chiết ở pH cao hơn mặc dù lượng flavonoid toàn phần cao hơn, nhưng hiệu suất hesperidin thu được giảm Kết quả này có lẽ là do sự thoái 28 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc biến của các phân tử flavonoid glycoside bởi phản ứng thủy phân một phần hoặc hoàn toàn nửa đường tạo ra dạng aglycone flavonoid Tóm lại, quá trình tách chiết tốt... của hesperidin bao gồm: bảo vệ DNA khỏi bị hư hại; ức chế sự phát triển của các khối u và ức chế sự phân chia của các tế bào ung thư [19] 15 Nghiên cứu quy tr̀nh tách chiết hesperidin từ quả phật thủ làm nguyên liệu sản xuất thuốc Trong hai thập niên gần đây, một số lượng lớn nghiên cứu về hoạt tính chống ung thư của hesperidin và dạng aglycone của nó (hesperetin) được tiến hành Kết quả cho thấy hesperidin . trĩ đã được tách chiết từ quả Phật thủ với năng suất chiết là 1,04% so với nguyên liệu khô. Quy trình tách chiết flavonoid hesperidin đạt tiêu chuẩn làm nguyên liệu sản xuất thuốc quy mô phòng. • Xây dựng quy trình tách chiết, phân lập Hesperidin làm nguyên liệu sản xuất thuốc từ quả phật thủ. Đề tài đã tiến hành các nội dung nghiên cứu sau: • Xác định điều kiện chiết tách flavonoid. III.1. Tách chiết flavonoid toàn phần từ quả Phật thủ 25 III.2. Tách chiết và tinh chế Hesperidin 25 III.3. Khảo sát các thông số ảnh hưởng đến quá trình tách chiết hesperidin từ quả Phật thủ