i BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP Mã số: ĐTĐL.2009 G/54 Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Đăng Hiền Cơ quan chủ trì: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế 8784 Hà Nội – 2011 ii BÁO CÁO ĐỀ TÀI KHOA HỌC ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT VẮC XIN CÚM A/H1N1 TRÊN NUÔI CẤY TẾ BÀO VERO VÀ TẾ BÀO PHÔI GÀ MỘT LỚP Mã số: ĐTĐL.2009 G/54 Các cán bộ thực hiện đề tài 1. PGS.TS.Nguyễn Đăng Hiền 2. PGS.TS.Lê Thị Luân 3. PGS.TS.Đinh Duy Kháng 4. Ts. Nguyễn Thị Quỳ 5. Ths. Cao Xuân Thịnh 6. Ths. Đặng Mai Dung 7. Ts.Nguyễn Thúy Hường 8. Ts.Nguyễn Vân Trang 9. CN.Trần Bích Hạnh 10. CN. Lê Trung Dũng Cơ quan thực hiện: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm y tế iii CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO BSA : Bovine Serum Albumin CDC : Center for Disease Control and Prevention (Trung tâm Phòng chống và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ) DMEM : Dulbecco’s Modifiled Eagle Medium FBS : Fetal bovine serum HA : Hemagglutinin HAU : Đơn vị kháng nguyên ngưng kết hồng cầu HI : Ngăn ngưng kết hồng cầu LH 3 E : Lactalbumin hydrolysate Eagle LT : Ly tâm MDCK : Tế bào thận chó (Madin-Darby canine Kidney cell) MEM : Medium Essential Medium Eagle NA : Neuraminidase NBCS : Newborn Caft Serum NIBSC : National Institute for Biological Standards and Control PCR : Phản ứng khuếch đại chuỗi (Polymerase Chain Reaction) SPF : Trứng gà sạch (Specific pathogen free) SRD : Phản ứng khuếch tán miễn dịch vòng đơn (Single Radial Immunodifution) TCYTTG : Tổ chức Y tế Thế giới iv Mục lục ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 3 1.1. Virút cúm A/ H1N1 3 1.1.1. Phân loại 3 1.1.2. Hình thái 3 1.1.3. Cấu trúc phân tử 4 1.1.4. Tính kháng nguyên 5 1.1.5. Sự nhân lên của virút 7 1.1.6. Sự đề kháng với tác nhân vật lý, hoá học 9 1.1.7. Độc lực của virút 10 1.1.8. Tính chất nuôi cấy 10 1.1.9. Khả năng gây bệnh và đặc điểm lâm sàng 11 1.1.9.1. Khả năng gây bệnh (đáp ứng miễn dịch) 11 1.1.9.2. Sinh bệnh học và triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm A/H1N1 12 1.1.10. Tình hình dịch cúm A/H1N1 tại Việt Nam 12 1.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm 13 1.2.1. Vắc xin cúm mùa 13 1.2.1.1. Vắc xin cúm bất hoạt 13 1.2.1.2. Vắc xin cúm nhược độc 14 1.2.2. Vắc xin cúm cho đại dịch 14 1.2.3. Tình hình sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên thế giới 15 1.2.3.1. Văc xin được sản xuất bởi hãng Novartis (Marburg- Đức) 15 1.2.3.2. Vắc xin từ CSL Biotherapies (Parkville-Australia) 16 1.2.3.3. Vắc xin cúm A/H1N1 do hãng Sinovac của Trung Quốc 16 1.2.3.4. Tình hình sản xuất vắc xin tại Việt Nam 17 1.3. Các công nghệ sản xuất vắc xin cúm 17 1.3.1. Sản xuất vắc xin cúm bất hoạt trên trứ ng gà có phôi 17 1.3.2. Sản xuất vắc xin cúm bất hoạt trên tế bào 18 1.3.3. Tế bào sử dụng trong sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 19 1.3.3.1. Yêu cầu chất lượng của tế bào sử dụng sản xuất vắc xin 19 1.3.3.2. Các loại tế bào sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 19 1.3.3.3. Chủng virút sử dụng trong sản xuất vắc xin 20 1.3.4. Các phương pháp tạo chủng sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên nuôi cấy tế bào 22 1.3.4.1. Phương pháp tạo dòng thuầ n chủng từ đám hoại tử (Plaque) 22 1.3.4.2. Phương pháp tạo dòng bằng phương pháp nồng độ giới hạn (Limited dilution) 23 1.3.4.3. Phương pháp cấy truyền liên tiếp 23 1.3.5. Các phương pháp cô đặc và tinh chế virút 24 1.3.5.1. Các phương pháp cô đặc và sơ chế protein virút 24 1.3.5.2. Phương pháp tinh chế virút 26 CHƯƠNG II 30 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu trong sản xuất chủng và vắcxin 30 2.1.1. Nguyên vật liệu và phương pháp nhân chủng vi rút X-179a trên trứng gà SPF 30 2.1.1.1. Nguyên vật liệu 30 2.1.1.2.Các bước tiến hành 30 v 2.1.2. Nguyên vật liệu và phương pháp thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào 31 2.1.2.1 Trên tế bào vero 31 2.1.2.2 Trên tế bào phôi gà một lớp 32 2.1.3. Nguyên vật liệu và các bước tiến hành nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào vero 39 2.1.3.1. Qui trình sản xuất tế bào vero 39 2.1.3.2. Qui trình sản xuất hỗn dịch virút 39 2.1.3.3. Qui trình tinh sạch 40 2.1.3.4. Qui trình siêu lọc 40 2.1.3.5. Siêu ly tâm bằng TNC+40% sacharose 42 2.1.3.6. Nghiên cứu qui trình bất hoạt 42 2.1.3.7. Thẩm định hiệu quả b ất hoạt và xác định thời gian bất hoạt 43 2.1.3.8. Qui trình loại bỏ ADN tồn dư bằng enzym benzonase 44 2.1.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm(Thử nghiệm tiền lâm sàng) 45 2.1.4.1. Trên chuột lang và chuột nhắt 45 2.1.4.2. Trên khỉ Macaca mulatta 45 2.2. Nguyên vật liệu và phương pháp tiến hành thử nghiệm kiểm định vắc xin 53 2.2.1. Kiểm tra vi khuẩn, nấm (theo dược điển Việt Nam IV) 53 2.2.1.1. Kiểm tra vô trùng bằng phương pháp nuôi cấy 53 2.2.1.2. Ki ểm tra vô trùng bằng thạch máu 57 2.2.2. Kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp nuôi cấy 58 2.2.3. Qui trình kiểm tra tác nhân ngoại lại tế bào sử dụng sản xuất 64 2.2.4. Qui trình kiểm tra nhận dạng cúm A/H1N1(Real time PCR) 66 2.2.5. Qui trình kiểm tra hiệu quả bất hoạt 68 2.2.6. Qui trình định lượng kháng nguyên HA( phương pháp SRD) 72 2.2.7. Qui trình xác định nội độc tố 75 2.2.8. Qui trình xác định formaldehyt tồn dư 77 2.2.9. Xác định protein toàn phần 79 2.2.10. Kiểm tra an toàn chung 79 2.2.11. Thử nghiệm đo pH 80 2.2.12. Qui trình xác định kháng thể cúm bằng phản ứng ngăn ng ưng kết hồng cầu 81 2.2.13. Qui trình giải trình tự gen 89 2.2.14. Thử nghiệm phát hiện ADN tồn dư trong các sản phẩm của quá trình sản xuất vắc xin bằng phương pháp lai điểm 91 2.2.15. Xác định hàm lượng hydroxit nhôm AL(OH) 3 trong vắc xin 94 CHƯƠNG III 96 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 96 3.1. Kết quả nhân chủng vi rút X-179A trên trứng gà SPF 96 3.2. Kết quả thích nghi và thiết lập hệ thống chủng giống trên nuôi cấy tế bào 99 3.2.1. Kết quả thích nghi trên tế bào thận khỉ tiên phát 99 3.2.2. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero 105 3.2.2.1. Kết quả cấy truyền thích nghi trên tế bào vero 105 3.2.2.2. Kết quả Sản xuất và kiểm định chủng cúm A/H1N1 giống gốc trên tế bào vero .107 3.2.3. Kết quả thích nghi trên tế bào phôi gà một lớp 119 3.2.3.1 Môi trường cho tế bào phôi gà P1 119 3.2.3.2. Kết quả thích nghi chủng H1N1 trên tế bào phôi gà Po và P1 128 3.3. Kết quả nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 131 vi 3.3.1. Kết quả nghiên cứu nghiên cứu qui trình 131 3.3.2. Kết quả sản xuất vắc xin theo qui trình 138 3.3.2.1. Qui trình sản xuất và kiểm định vắc xin 138 3.3.2.2. Sản xuất và kiểm định 10.000 liều vắc xin theo qui trình 140 3.4. Đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch trên động vật thí nghiệm (Tiền lâm sàng) 145 3.4.1. Kết quả an toàn trên chuột lang 145 3.4.2. Kết quả an toàn trên chuột nhắt 148 3.5. Kết quả an toàn và đáp ứng miễn dịch trên khỉ Macaca Mulatta 151 3.5.1. Kết qu ả an toàn vắc xin 151 3.5.2. Đáp ứng miễn dịch của vắc xin trên khỉ thử nghiệm 153 3.5.2.1 Kháng thể ngăn ngưng kết hồng cầu (HI) 153 3.5.2.2. Hiệu giá kháng thể trung hòa 162 3.6. Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin cúm A/ H1N1 trên tế bào vero 170 KẾT LUẬN 171 KIẾN NGHỊ 174 TÀI LIỆU THAM KHẢO 175 vii Danh mục các bảng Bảng 2.1. Sơ đồ lấy mẫu 44 Bảng 3.1. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10 -2 96 Bảng 3.2 Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10 -3 96 Bảng 3.3. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10 -4 97 Bảng 3.4. Kết quả hỗn dịch virút thu được tại nồng độ gây nhiễm 10 -5 97 Bảng 3.5. So sánh hiệu giá HA tại các nồng độ gây nhiễm 98 Bảng 3.6. Sự phát triển của chủng virút X-179A-C trên tế bào thận khỉ tiên phát lần 1 99 Bảng 3.7. Hiệu giá HA của các chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát tại môi trường gây nhiễm khác nhau 100 Bảng 3.8. Hiệu giá HA tại lần thích nghi thứ 3 với nồng độ pha loãng 1/4 100 Bảng 3.9. Hiệu giá HA tại lần thích nghi thứ 3 với nồng độ pha loãng 1/10 101 Bảng 3.10. Kết quả nhân chủng lần 4 trên t ế bào thận khỉ tiên phát 102 Bảng 3.11. Hiệu giá HA sau cấy truyền lần 5 trên tế bào thận khỉ tiên phát 102 Bảng 3.12.Tóm tắt kết quả thích nghi chủng trên tế bào thận khỉ tiên phát 104 Bảng 3.13. Hiệu giá HA của chủng cúm A/H1N1 trên tế bào vero 105 Bảng 3.14. Kết quả nghiên cứu nồng độ trypsin thích hợp trên chủng D1V3 105 Bảng 3.15. Liều gây nhiễm tối ưu với chủng sản xuất 109 Bảng 3.16. Kết quả nhận dạng hỗn dị ch virút thu được 110 Bảng 3.17. Tóm tắt kết quả sản xuất, kiểm định chủng vi rút 110 Bảng 3.18. So sánh trình tự nucleotide của gen HA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number 063211) 112 Bảng 3.19. So sánh trình tự axit amin của protein HA giữa 5 chủng virút với chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY063211) 114 Bảng 3.20. So sánh trình tự nucleotide của gen NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL/2010 (Accession number CY063213) 115 Bảng 3.21. So sánh trình tự axit amin của protein NA giữa 5 chủng virút và chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 (Accession number CY0632 117 Bảng 3.22. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin 117 B ảng 3.23. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein HA giữa chủng vắc xin X179 và các chủng khác (179M, 179W, HV4 và AV4) 118 Bảng 3.24. Những thay đổi về trình tự nucleotide và axit amin ở gen/protein NA giữa chủng virút cúm A/H1N1/California/VRDL14/2010 và 5 chủng vắc xin 118 Bảng 3.25. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường 199 với 5% huyết thanh 119 Bảng 3.26. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường 199 với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm 2 120 Bảng 3.27. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường MEM với 5% huyết thanh 120 Bảng 3.28. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường MEM với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm 2 121 Bảng 3.29. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường LH với 5% huyết thanh 122 Bảng 3.30. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường LH với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm 2 122 Bảng 3.31. Sự phát triển của tế bào phôi gà P1 khi sử dụng môi trường DMEM với 5% huyết thanh 123 Bảng 3.32. Số lượng tế bào phôi gà P1 sau 3 ngày nuôi cấy trên môi trường DMEM với huyết thanh khác nhau trên chai 25 cm 2 124 viii Bảng 3.33. Hiệu giá HA của chủng gốc X-179A-C gây nhiễm trên tế bào với các loại môi trường gây nhiễm 128 Bảng 3.34. Hiệu giá HA của chủng X-179A-V gây nhiễm trên tế bào phôi gà với các loại môi trường gây nhiễm 128 Bảng 3.35. Hiệu giá HA của chủng X-179A-M gây nhiễm trên tế bào phôi gà với các loại môi trường gây nhiễm 129 Bảng 3.36. Hiệu giá HA nghiên cứu chủng X-179A-M trên môi trường DMEM glucosa cao với nồng độ trypsin khác nhau 129 Bảng 3.37. Hiệu giá HA trong thời gian theo dõi 130 Bảng 3.38. Hiệu giá HA trong quá trình cấ y truyền liên tiếp 130 Bảng 3.39. Thể tích và hiệu giá vắc xin thô 131 Bảng 3.40. Kết quả nghiên cứu tinh sạch kháng nguyên 131 Bảng 3.41. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV06 132 Bảng 3.42. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV07 133 Bảng 3.43. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu lọc loạt FV08 134 Bảng 3.44. Kết quả nghiên cứu hiệu quả cô đặc bằng siêu ly tâm 135 Bảng 3.45. Kết quả nghiên cứu hiệu quả bất hoạt 136 Bảng 3.46. Kết quả nghiên cứu sử dụng enzym cắt ADN tồn dư của tế bào 138 Bảng 3.47. Kết quả sản xuất loạt FV06 140 Bảng 3.48 Kết quả sản xuất loạt FV07 141 Bảng 3.49. Kết quả sản xuất loạt FV08 141 Bảng 3.50. Kết quả sản xuất loạt FV09 142 Bảng 3.51. Kết qu ả sản xuất 4 loạt vắc xin thô 142 Bảng 3.52. Chất lượng tế bào sử dụng cho sản xuất vắc xin 143 Bảng 3.53. Kết quả formaldehyde trong bán thành phẩm 143 Bảng 3.54. Kết quả Protein toàn phần trong bán thành phẩm 144 Bảng 3.55. Kết quả ADN tồn dư trong bán thành phẩm 144 Bảng 3.56. Kết quả vắc xin thành phẩm 144 Bảng 3.57. Kết quả định lượng kháng nguyên và mức chuyển đổi đơn vị HA 145 Bảng 3.58. Kết quả th ử an toàn trên chuột lang 145 Bảng 3.59. Kết quả thử an toàn trên chuột nhắt trưởng thành 148 Bảng 3.60. Trọng lượng khỉ (kg) 151 Bảng 3.61. Trọng lượng khỉ trong quá trình thử nghiệm 152 Bảng 3.62. Triệu chứng khỉ trong quá trình thử nghiệm 153 Bảng 3.63. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 153 Bảng 3.64. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 154 Bảng 3.65 Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 155 Bảng 3.66. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều .156 Bảng 3.67. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 157 Bảng 3.68. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 158 Bảng 3.69. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều 159 Bảng 3.70. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều 160 Bảng 3.71. Hiệu giá kháng thể HI khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và không có Al(OH)3 161 Bảng 3.72. Hiệ u giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30ug/liều 162 Bảng 3.73. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15ug/liều 163 Bảng 3.74. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 164 ix Bảng 3.75. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5ug/liều 165 Bảng 3.76. Hiệu giá kháng thể trung hòa trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 166 Bảng 3.77. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 167 Bảng 3.78. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 600µg/liều 167 Bảng 3.79. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 900µg/liều 168 Bảng 3.80. Hiệu giá kháng thể trung hòa khi v ắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và không có Al(OH)3 169 x Danh mục các hình Hình 1.1. Hình thái các hạt virion của virút cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử (A) và mô hình hạt virút (B) 4 Hình 1.2. NA phân cắt phân tử axit sialic để giải phóng hạt virút ra khỏi tế bào 6 Hình 1.3. Chu kỳ nhân lên của virút cúm trong tế bào vật chủ 8 Hình 1.4. Sơ đồ nhân lên của virút RNA sợi đơn, (-) 9 Hình 2.1. Trứng gà sạch SPF 30 Hình 2.2. Kiểm tra chất lượng trứng 30 Hình 2.3. Sơ đồ thực hiện phản ứng HI 88 Hình 3.1. Hiệu giá HA gây nhiễm trên trứng tại các nồng độ khác nhau 98 Hình 3.2. Hiệu giá HA khi gặt và sau khi đông băng 106 Hình 3.3. Hình ảnh nhân lên của virút cúm A/H1N1 trên tế bào dưới kính hiển vi điện tử 107 Hình 3.4. Hình ảnh kiểm tra hiệu giá HA của cúm A/H1N1 108 Hình 3.5. Liều gây nhiễm tối ưu 109 Hình 3.6. Chủng vi rút được bảo quản tại tủ âm sâu 111 Hình 3.7. Môi trường 199 nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 120 Hình 3.8. Môi trường MEM nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 121 Hình 3.9. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà mộ t lớp 123 Hình 3.10. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 125 Hình 3.11. Tỷ lệ tách tế bào sử dụng các loại môi trường với huyết thanh bê bào thai 125 Hình 3.12. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường M199 126 Hình 3.13. Hình ảnh tế bào sử dụng môi trường MEM 127 Hình 3.14. So sánh hiệu giá HA với các màng lọc khác nhau 132 Hình 3.15. Hiệu suất cô đặc loạt FV06 tại các mức độ cô đặc khác nhau 133 Hình 3.16. Hiệu suất cô đặc loạt FV07 tại các mức độ cô đặc khác nhau 134 Hình 3.17. Hi ệu suất cô đặc loạt FV 08 tại các mức độ cô đặc khác nhau 135 Hình 3.18. Hiệu xuất siêu ly tâm bằng đường và không đường 136 Hình 3.19. Hiệu quả bất hoạt 137 Hình 3.20. Hình ảnh vắc xin pFluvac 142 Hình 3.21. Hình ảnh kết quả định lượng kháng nguyên HA loạt FV-06 (BTP) 145 Hình 3.22. Trọng lượng chuột lang trong thời gian cách ly 146 Hình 3.23. Tăng trọng chuột lang trong thời gian cách ly 146 Hình 3.24. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0110 147 Hình 3.25. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F-0210 147 Hình 3.26. Tăng trọng chuột sau khi tiêm v ắc xin loạt F-0310 147 Hình 3.27. Tăng trọng chuột sau khi tiêm vắc xin loạt F- 0111 148 Hình 3.28. Trọng lượng chuột nhắt trong thời gian cách ly 149 Hình 3.29. Tăng trọng chuột nhắt trong thời gian cách ly 149 Hình 3.30. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0110 150 Hình 3.31. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0210 150 Hình 3.32. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0310 150 Hình 3.33. Tăng trọng chuột nhắt sau khi tiêm vắc xin loạt F-0111 150 Hình 3.34. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 30µg/liều 154 Hình 3.35. Hi ệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 15µg/liều 155 Hình 3.36. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 10µg/liều 156 Hình 3.37. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 7,5µg/liều 157 Hình 3.38. Hiệu giá kháng thể kháng H1N1 trên nhóm sử dụng kháng nguyên 5µg/liều 158 Hình 3.39. Hiệu giá kháng thể khi vắcxin có hàm lượng kháng nguyên khác nhau và Al(OH)3 với nồng độ 300µg/liều 159 [...]... catatgtttt tgtggggtca 661 tcaagataca gcaagaagtt caagccggaa atagcaataa gacccaaagt gagggrtcra 721 gaagggagaa tgaactatta ctggacacta gtagagccgg gagacaaaat aacattcgaa 21 781 gcaactggaa atctagtggt accgagatat gcattcgcaa tggaaagaaa tgctggatct 841 ggtattatca tttcagatac accagtccac gattgcaata caacttgtca aacacccaag 901 ggtgctataa acaccagcct cccatttcag aatatacatc cgatcacaat tggaaaatgt 961 ccaaaatatg taaaaagcac aaaattgaga... 1321 gaactgttgg ttctattgga aaatgaaaga actttggact accacgattc aaatgtgaag 1381 aacttatatg aaaaggtaag aagccagcta aaaaacaatg ccaaggaaat tggaaacggc 1441 tgctttgaat tttaccacaa atgcgataac acgtgcatgg aaagtgtcaa aaatgggact 1501 tatgactacc caaaatactc agaggaagca aaattaaaca gagaagaaat agatggggta 1561 aagctggaat caacaaggat ttaccagatt ttggcgatct attcaactgt cgccagttca 1621 ttggtactgg tagtctccct gggggcaatc agtttctgga tgtgctctaa... ggaaacacct 301 agttcagaca atggaacgtg ttacccagga gatttcatcg attatgagga gctaagagag 361 caattgagct cagtgtcatc atttgaaagg tttgagatat tccccaagac aagttcatgg 421 cccaatcatg actcgaacaa aggtgtaacg gcagcatgtc ctcatgctgg agcaaaaagc 481 ttctacaaaa atttaatatg gctagttaaa aaaggaaatt catacccaaa gctcagcaaa 541 tcctacatta atgataaagg gaaagaagtc ctcgtgctat ggggcattca ccatccatct 601 actagtgctg accaacaaag tctctatcag aatgcagatg... taaaaagcac aaaattgaga ctggccacag gattgaggaa tatcccgtct 1021 attcaatcta gaggcctatt tggggccatt gccggtttca ttgaaggggg gtggacaggg 1081 atggtagatg gatggtacgg ttatcaccat caaaatgagc aggggtcagg atatgcagcc 1141 gacctgaaga gcacacagaa tgccattgac gagattacta acaaagtaaa ttctgttatt 1201 gaaaagatga atacacagtt cacagcagta ggtaaagagt tcaaccacct ggaaaaaaga 1261 atagagaatt taaataaaaa agttgatgat ggtttcctgg acatttggac ttacaatgcc... c a một chủng virút dùng cho sản xuất vắc xin Trình tự gen HA 1 atgaaggcaa tactagtagt tctgctatat acatttgcaa ccgcaaatgc agacacatta 61 tgtataggtt atcatgcgaa caattcaaca gacactgtag acacagtact agaaaagaat 121 gtaacagtaa cacactctgt taaccttcta gaagacaagc ataacgggaa actatgcaaa 181 ctaagagggg tagccccatt gcatttgggt aaatgtaaca ttgctggctg gatcctggga 241 aatccagagt gtgaatcact ctccacagca agctcatggt cctacattgt ggaaacacct... xuất vắc xin cúm A/ H1N1 Mỗi đơn vị với thế mạnh c a mình sẽ nghiên cứu nhằm nhanh chóng tạo ra được vắc xin POLYVAC được giao nhiệm vụ Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/ H1N1 trên tế bào VERO và tế bào phôi gà một lớp Với mục tiêu là Sản xuất được vắc xin cúm A/ H1N1 trên tế bào VERO hoặc tế bào phôi gà một lớp Nội dung cần đạt được: - Nhân chủng virút X-17 9a trên trứng gà SPF - Thích nghi và thiết lập... nhiên, công nghệ sản xuất vắc xin trên tế bào vero là khó Tế bào phôi gà một lớp: một số nghiên cứu đang tìm hiểu và thích nghi virút cúm trên dòng tế bào này để sản xuất giống như qui trình sản xuất vắc xin sởi, Tuy nhiên, ch a có kết quả nghiên cứu được công bố Ưu điểm sản xuất vắc xin cúm trên tế bào: Chủ động được nguồn tế bào do tự thiết lập được ngân hàng tế bào ; vắc xin không ch a các thành phần... từ tế bào giống gốc sang tế bào giống sản xuất 1.3.3.2 Các loại tế bào sử dụng trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/ H1N1 Hiện nay một số nước sử dụng tế bào thận khỉ tiên phát cho sử dụng sản xuất 19 vắc xin cúm A/ H1N1 như Đức và Việt nam Tế bào thận khỉ tiên phát được sản xuất từ những khỉ đã được phê chuẩn c a cơ quan chức năng và đạt chất lượng theo qui định c a Tổ chức Y tế thế giới về sản xuất. .. còn có nhiều hãng sản xuất vắc xin nổi tiếng trên thế giới như Sanofi cũng đang sản xuất vắc xin cúm A/ H1N1 này 1.2.3.4 Tình hình sản xuất vắc xin tại Việt Nam Việt Nam ch a sản xuất được vắc xin cúm Khi dịch cúm A/ H5N1 xảy ra, Bộ Khoa học và Công nghệ và Bộ Y tế đã giao cho một số đơn vị nghiên cứu và sản xuất vắc xin này nhưng hiện nay mới chỉ dừng lại ở qui mô phòng thí nghiệm và đang tiến hành thử... từ trứng gà nên ít gây dị ứng sau tiêm phòng 18 Nhược điểm: sự nhân lên c a virút cúm trên tế bào khó, giá thành sẽ cao hơn vắc xin sản xuất trên trứng gà 1.3.3 Tế bào sử dụng trong sản xuất vắc xin cúm A/ H1N1 1.3.3.1 Yêu cầu chất lượng c a tế bào sử dụng sản xuất vắc xin Tế bào là một trong những nguồn nguyên liệu chính sử dụng trong sản xuất vắc xin Tiêu chí để l a chọn dòng tế bào cho sản xuất vắc . nhiệm vụ Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO và tế bào phôi gà một lớp . Với mục tiêu là Sản xuất được vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào VERO hoặc tế bào phôi gà một lớp . Nội. cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp 121 Hình 3.9. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà mộ t lớp 123 Hình 3.10. Môi trường LH nuôi cấy và tỷ lệ tách tế bào phôi gà một lớp. và các bước tiến hành nghiên cứu qui trình sản xuất và sản xuất vắc xin cúm A/H1N1 trên tế bào vero 39 2.1.3.1. Qui trình sản xuất tế bào vero 39 2.1.3.2. Qui trình sản xuất hỗn dịch virút 39