Viện khoa học và công nghệ việt nam Viện Công nghệ Sinh học 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi M - + E1-2 E1-3 E1-6 E2-3 E2-4 (kb) S D S D S D S D S D 3,1 T-Boder( left) CaMV35S PolyA PMI CaMV35S Gt-1 PSY Short CaMV35S terminator 35S SSU transit peptide Ctrl nos T-Boder (right) pCaCar T-Boder (left) CaMV35S PolyA PMI CaMV35S promoter T-Boder(r ight) Ubiquitin pro CryIA (b) gene nos BamHI Kpnl Xhol Hindlll pUBB-Man Ubiquit in promoter CryIA(b) Gt1- PSY-35S-Ctrl EcoRI XhoI XhoI XhoI XhoI XhoI XhoI EcoRI Chủ nhiệm Đề tài: PGS. TS. Lê Trần Bình M số: KC.04.13 Hà Nội, 2005 Viện khoa học và công nghệ việt nam Viện Công nghệ Sinh học V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH V.KHCNVN V.CNSH Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi Mã số: KC.04.13 Chủ nhiệm Đề tài: PGS. TS. Lê Trần Bình Cơ quan chủ trì: Viện Công nghệ Sinh học Cơ quan chủ quản: Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam Thời gian thực hiện: 10/2001 - 10/2004 Hà Nội, 2005 Bản báo cáo viết xong ngày 1/2/2005 Tài liệu này đợc chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Đề tài cấp Nhà nớc, mã số KC.04.13 Lời cảm ơn Chủ nhiệm đề tài KC.04.13 xin chân thành cảm ơn 06 cơ quan khoa học gồm: (i) Viện Công nghệ Sinh học, (ii) Viện Sinh học Nhiệt đới, Tp. Hồ Chí Minh, (iii) Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, Hà Nội, (iv) Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà Nội, (v) Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long và Viện Nghiên cứu Cây Bông và Cây có sợi, Ninh Thuận thuộc 03 cơ quan chủ quản là: (i) Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (ii) Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn và (iii) Bộ Công nghiệp đã ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi về trang thiết bị và nhân lực cho các tập thể cán bộ chủ trì và tham gia thực hiện đề tài này. Chủ nhiệm và cán bộ thực hiện đề tài KC.04.13 xin chân thành cảm ơn Vụ Quản lý Khoa học & Công nghệ các ngành kinh tế của Bộ Khoa học và Công nghệ và Ban chủ nhiệm Chơng trình KC.04 đã tạo điều kiện về kinh phí và quản lý quá trình thực hiện các nội dung nghiên cứu của đề tài trong suốt 3 năm qua. Hà nội, ngày tháng năm 2005 Cơ quan chủ trì đề tài Chủ nhiệm đề tài PGS. TS. Lê Trần Bình i Mục lục Danh sách những ngời chủ trì thực hiện. 1 Danh sách những ngời tham gia thực hiện và cơ quan phối hợp 2 Bài tóm tắt 4 Những chữ viết tắt 6 Lời mở đầu 7 Chơng 1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nớc và ngoài nớc. 9 1.1. Tình hình nghiên cứu trong nớc. 9 1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nớc 12 Chơng 2. Lựa chọn đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 13 2.1. Mục tiêu của đề tài 13 2.2. Nội dung nghiên cứu cần thực hiện 13 2.2.1. Su tập và phân lập gen 13 2.2.2. Chuyển gen vào cây trồng 13 2.2.3. Đánh giá cây chuyển gen ở mức phòng thí nghiệm và nhà lới. 14 2.2.4. Thử nghiệm trên đồng ruộng và đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen 15 2.3. Vật liệu và phơng pháp nghiên cứu. 16 2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 16 2.3.2. Phơng pháp nghiên cứu. 17 2.3.3. Dạng sản phẩm kết quả tạo ra 18 2.3.4. Nhu cầu kinh tế xã hội và địa chỉ áp dụng. 19 Chơng 3. Những nội dung và kết quả đã thực hiện . 20 3.1. Kết quả phân lập gen 20 3.1.1. Kết quả phân lập gen vip 20 3.1.2. Kết quả xây dựng th viện gen từ chủng Bacillus thuringiensis AB51 có hoạt tính diệt ấu trùng bọ hà. 35 3.1.3. Phân lập gen Pi-2(t) kháng bệnh đạo ôn 42 3.1.4. Kết quả phân lập gen Pi-1(t) kháng bệnh đạo ôn. 46 3.2. Hoàn thiện các quy trình chuyển gen kháng sâu và gen chịu hạn vào cây bông vải. 47 3.2.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây bông vải 47 3.2.2. Hoàn thiện hệ thống nuôi cấy mô và tái sinh cây bông in vitro phục vụ chuyển gen. 48 3.2.3. Xây dựng qui trình chuyển gen qua ống phấn bằng vi tiêm 64 3.2.4. Kết luận và đề nghị 74 3.3. Kết quả tạo dòng cây hông chuyển gen kháng sâu. 75 3.3.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây hông 75 3.3.2. Hệ thống tái sinh cây hông 75 3.3.3. Hoàn thiện quy trình chuyển gen vào cây hông 79 3.4. Chuyển gen Anti-ACO giữ hoa lâu tàn và gene cry IA(c) kháng sâu vào cây hoa cúc. 86 3.4.1. Cơ sở khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây hoa cúc 86 3.4.2. Vật liệu và phơng pháp 87 i 3.4.3. Kết quả chuyển gen ở cây hoa cúc. 89 3.4.4. Kết luận và hớng nghiên cứu sắp tới 95 3.5. Kết quả tạo dòng lúa kháng rầy và kháng sâu bằng các phơng pháp chuyển gen khác nhau 96 3.5.1. Căn cứ khoa học và thực tiễn của việc chuyển gen vào cây lúa 96 3.5.2. Hoàn thiện quy trình chuyển gen trên giống lúa nhóm indica và tạo dòng lúa biến đổi gen kháng rầy nâu. 98 3.5.3. Chuyển gen cryIA(b, c) kháng sâu và gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vào cây lúa thông qua A. tumefaciens 107 3.6. Các phơng pháp nhận biết và đánh giá cây chuyển gen 139 3.6.1. Đặt vấn đề 139 3.6.2. Các phơng pháp đánh giá cây chuyển gen ở mức phòng thí nghiệm. 140 3.6.3. Thử nghiệm cây chuyển gen trong nhà kính. 146 3.6.4. Lai tạo để kiểm tra cây chuyển gen 157 3.6.5. Kết luận và đánh giá cây chuyển gen. 159 3.7. Cơ sở khoa học và quy trình đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen kháng côn trùng 160 3.7.1. Cơ sở khoa học, thực tiễn và xã hội của việc đánh giá an toàn sinh học đối với GMO 160 3.7.2. Cơ chế quản lý rủi ro. 167 3.7.3. Các thủ nghiệm đồng ruộng. 169 3.7.4. Kết luận 170 Chơng 4. Tổng quát hóa và đánh giá kết quả thu đợc.171 4.1. Kết quả về khoa học. 171 4.2. Kết quả nổi bật và khả năng áp dụng 173 4.3. Trình độ công nghệ174 4.4. Khả năng áp dụng. 175 4.5. Đào tạo 175 4.6. Sản phẩm khoa học của đề tài 176 4.7. Hợp tác quốc tế 177 4.8. Tình hình sử dụng kinh phí 178 4.9. Danh sách các công trình công bố 178 4.10. Hạn chế của đề tài 180 Chơng 5. Kết luận và đề nghị 181 5.1. Kết luận . 181 5.2. Đề nghị 182 Tài liệu tham khảo.183 ii Mục lục các bảng Bảng 1 Danh sách những ngời chủ trì thực hiện 1 Bảng 2 Hoạt lực diệt côn trùng của các đỉnh protein sau khi sắc kí trao đổi anion 26 Bảng 3 Hoạt lực diệt côn trùng của phân đoạn protein có kích thớc 44 kDa tách chiết từ chủng BtAB51 đối với ấu trùng bọ hà tuổi 2 27 Bảng 4 Kết quả xác định trình tự nucleotit của gen vip3 ở 3 mẫu V13, V14 và V15 30 Bảng 5 Thành phần các môi trờng tái sinh cây và tạo đa chồi 49 Bảng 6 Sự hình thành chồi sau 5 tuần 50 Bảng 7 Sự hình thành cụm chồi trên các môi trờng S2-S5 51 Bảng 8 Tỉ lệ kéo dài chồi và chiều cao chồi trên các môi trờng E0-E2 52 Bảng 9 Tỉ lệ tạo rễ trên môi trờng R1 và R2 53 Bảng 10 Thành phần các môi trờng cảm ứng tạo mô sẹo 55 Bảng 11 Thành phần các môi trờng nhân và duy trì mô sẹo 56 Bảng 12 ảnh hởng của các tổ hợp hoóc môn sinh trởng khác nhau lên sự hình thành mô sẹo và phôi soma của các giống bông SSR60F, 254 và VN36P 57 Bảng 13 Tỉ lệ mô sẹo sống sót sau khi cấy chuyển lên các môi trờng nhân và duy trì mô sẹo 60 Bảng 14 Số dòng bông và số lợng hạt thu đợc của các giống sau vi tiêm thu đợc tại Trại Thực nghiệm Cổ Nhuế, Hà Nội năm 2001-2002 66 Bảng 15 Số hoa, quả và tỷ lệ đậu quả của các công thức 67 Bảng 16 Tỷ lệ đậu quả theo giờ tiêm/ngày của các công thức 67 Bảng 17 Tỷ lệ quả dị hình, số múi/quả và số hạt/quả, và của các công thức 68 Bảng 18 Tổng số hạt thu đợc sau tiêm của các công thức 69 Bảng 19 Kết quả sàng lọc cây bông chuyển gen sau vi tiêm bằng Test kháng sinh trên lá 70 Bảng 20 Tỷ lệ cây có phản ứng dơng tính đối với các nồng độ kháng sinh hygromycine của các công thức 71 Bảng 21 Kết quả tái sinh chồi từ mảnh lá sau 5 tuần nuôi cấy 77 Bảng 22 Kết quả tái sinh chồi từ cuống lá sau 5 tuần nuôi cấy 77 Bảng 23 Kết quả tái sinh chồi từ thân cây sau 5 tuần nuôi cấy 78 Bảng 24 Tỷ lệ tái sinh chồi và cây chuyển gen của các mảnh lá trên môi trờng có 4mg/l PPT sau khi nhiễm với Agrobacterium tumefaciens và mẫu lá đối chứn 81 Bảng 25 ảnh hởng của các tổ hợp (NAA và BAP) đến tỷ lệ tái sinh từ mẫu lá giống HCT1 89 Bảng 26 ảnh hởng của các tổ hợp (NAA và BAP) đến tỷ lệ tái sinh từ mẫu lá hoa cúc giống HCV1 89 Bảng 27 ảnh hởng của tiền nuôi cấy lên sức sống của mẫu sau lây nhiễm giống HCT1 91 Bảng 28 ảnh hởng của tiền nuôi cấy đối với sức sống của mẫu sau lây nhiễm giống HCV1 91 Bảng 29 Tỷ lệ có biểu hiện GUS ở các giống lúa thí nghiệm 101 Bảng 30 Số dòng tái sinh từ các mô sẹo qua chọn lọc 101 Bảng 31 ảnh hởng của thông số bắn trên hiệu quả chuyển gen ở giống Taipei 309 103 Bảng 32 Tỷ lệ mô sẹo biểu hiện GUS của các giống lúa 103 Bảng 33 Số dòng tái sinh từ các giống đợc chuyển gen 104 Bảng 34 Kết quả chuyển gen plasmit pUbi-GNA 105 Bảng 35 Kết quả thử rầy đối với các dòng lúa KDML105 chuyển gen GNA 106 Bảng 36 Kết quả chọn lọc và tái sinh cây 113 Bảng 37 Thang điểm đánh giá tình trạng nhiễm bệnh đối với lúa 115 Bảng 38 Tỉ lệ bệnh và tình trạng nhiễm bệnh của 41 dòng cây C71 tái sinh từ mô sẹo chuyển gen Xa21 sau 7 và 14 ngày gây nhiễm bệnh bạc lá với khuẩn Xanthomonas 116 Bảng 39 Kết quả kiểm tra các dòng lúa C71 chuyển gen CryIA(c) 119 Bảng 40 Cấp hại của sâu đục thân 125 iii Bảng 41 Hiệu quả biến đổi gen bằng A. tumefaciens LBA 4404 (pUBB-Man) 126 Bảng 42 Hiệu quả biến đổi gen bằng A. tumefaciens LBA 4404 (pUBC-Man) 127 Bảng 43 Đánh giá sự phân ly của các cây chuyển gen qua chọn lọc mannose 129 Bảng 44 Tỷ lệ chồi héo (%) ghi nhận trên 30 dòng giống lúa IR64 ở thế hệ T 1 ở 5,10, 15, 20 ngày sau khi chủng sâu 131 Bảng 45 Tỷ lệ sâu sống (%) và trọng lợng sâu sống 25 ngày sau chủng 132 Bảng 46 Cấp hại (0-9) và phản ứng của các dòng lúa thử nghiệm đối với sâu đục thân 133 Bảng 47 Số sâu sống, sâu chết và tỷ lệ sâu chết trên các dòng lúa thử nghiệm 135 Bảng 48 So sánh khả năng nảy mầm giữa 2 giống bông kháng sâu và đối chứng trên môi trờng MS có bổ sung Km 141 Bảng 49 Tỉ lệ sống sót ở các mảnh lá của các giống bông trên môi trờng MS có bổ sung Km 142 Bảng 50 Kết quả thử độc tính của CryIA(c) ở mô lúa chuyển gen trên ấu trùng sâu đục thân 148 Bảng 51 Độc tính của protein từ cây lúa chuyển gen CryIA(c) (0.2g thân lá) đối với ấu trùng của sâu đục thân lúa hai chấm 148 Bảng 52 Một số chỉ tiêu theo dõi của các dòng lúa chuyển gen khi bị xử lý hạn 30 ngày 152 Bảng 53 Chỉ số chịu hạn tơng đối của một số dòng lúa chuyển gen 155 Bảng 54 Chỉ số trung bình các chỉ tiêu của cây xử lý mặn 156 Bảng 55 Số lợng hạt lai thu đợc 158 Bảng 56 Một số chỉ tiêu thu đợc từ cây lúa lai 158 Bảng 57 Báo cáo tóm tắt kết quả thực hiện từ 10/2001 - 10/2004 173 Bảng 58 Khả năng áp dụng của đề tài 175 Bảng 59 Danh sách các học viên đợc đào tạo 175 Bảng 60 Danh sách các cán bộ đợc nâng cao trình độ 176 Bảng 61 Hợp tác quốc tế 177 iv Mục lục các hình Hình 1 Kết quả phản ứng lai miễn dịch với kháng thể kháng protein Vip2 21 Hình 2 Kết quả phản ứng Western-Blotting của protein Vip3 với kháng thể kháng Vip3 22 Hình 3 Sắc ký đồ protein ngoại bào BtAB51 từ cột Resource Q 1 ml trên hệ FPLC 23 Hình 4 Điện di SDS-PAGE của các phân đoạn protein tinh chế sau sắc kí trao đổi ion 24 Hình 5 Sắc kí đồ lọc gel mẫu protein ngoại bào BtAB51 từ cột Superose 12 trên hệ FPLC 25 Hình 6 Sắc kí đồ lọc gel mẫu protein ngoại bào BtAB51 từ cột Superose 12 trên hệ FPLC 26 Hình 7 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen vip3 28 Hình 8 Kết quả biến nạp sản phẩm ghép nối vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5 29 Hình 9 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmit bằng EcoRI 29 Hình 10 Sơ đồ đọc trình tự gen vip3 với các mồi V2.1, V2.2, V3.1, V3.2 30 Hình 11 Sơ đồ thiết kế vector 35S/vip3A/NOST 32 Hình 12 Sản phẩm cắt bằng BamHI& SacI 33 Hình 13 Kết quả điện di sản phẩm PCR từ 8 dòng khuẩn lạc với 2 cặp mồi 34 Hình 14 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm phản ứng cắt plasmit tái tổ hợp với tổ hợp BamHI & SacI 34 Hình 15 ADN tách từ chủng Bt AB51 37 Hình 16 ADN tổng số đợc cắt bởi Sau 3A 38 Hình 17 ADN vector qua xử lý 39 Hình 18 Th viện gen sơ cấp 40 Hình 19 Kết quả cắt ADN vector tái tổ hợp 41 Hình 20 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RG64 43 Hình 21 Kết quả điện di các plasmit tái tổ hợp mang gen kháng đạo ôn Pi-2(t) 44 Hình 22 Điện di kiểm tra ADN plasmit tái tổ hợp cắt bằng enzym giới hạn EcoRI 45 Hình 23 Trình tự gen kháng đạo ôn Pi -1 từ giống lúa Tẻ tép so với trình tự nucleotit trong Ngân hàng Dữ liệu Gen Quốc tế (C101Lac) 46 Hình 24 Quá trình tạo đa chồi từ phôi 52 Hình 25 Sự hình thành mô sẹo trên một số môi trờng cảm ứng tạo mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy giống 254 59 Hình 26 Nhân và duy trì mô sẹo của giống VN 36P 61 Hình 27 Tái sinh cây bông giống SSR qua giai đoạn mô sẹo 63 Hình 28 Bầu nhụy sau khi vặt cánh hoa và cắt vòi nhụy 65 Hình 29 Đa kim tiêm và bầu nhụy 65 Hình 30 Bắt đầu đẩy xy lanh tiêm 65 Hình 31 Đã đẩy xong xy lanh tiêm 65 Hình 32 Thu hoạch hạt bông T0 sau thí nghiệm vi tiêm 65 Hình 33 ảnh hởng của vi tiêm đến quả bông 68 Hình 34 Triệu trứng sau ba ngày 72 Hình 35 Triệu trứng sau bốn ngày 72 Hình 36 Quy trình sàng lọc cây chuyển gen 72 Hình 37 Kết quả PCR các dòng bông chuyển gen 73 Hình 38 Biểu hiện của gen GUS trong lá cây hông chuyển gen 81 Hình 39 Cây Hông tái sinh 82 Hình 40 Cây Hông chuyển gen phát triển, cây đối chứng chết trong môi trờng chọn lọc PPT 82 v Hình 41 Kết quả PCR của gen cryIA(c) 83 Hình 42 Kết quả thử tính kháng sâu của các dòng hông chuyển gen so với đối chứng không chuyển gen 84 Hình 43 Kết quả phân tích Southern blot của cây Hông 85 Hình 44 Kết quả Western blot của của cây Hông 85 Hình 45 Cây Paulownia chuyển gen 85 Hình 46 Giống cúc thí nghiệm: HCV1 và HCT1 87 Hình 47 Cấu trúc plasmit pART 27 mang gen Bt (Cry IAc) 88 Hình 48 Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá giống HCV1 90 Hình 49 Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu lá giống HCT1 90 Hình 50 Các mẫu lá cây hoa cúc biến nạp 91 Hình 51 Chồi biến nạp HCT1 trên môi trờng chọn lọc (sau 4 tuần) 92 Hình 52 Chọn lọc cây hoa cúc chuyển gen CryIA(c) 92 Hình 53 Chồi biến nạp trong môi trờng ra rễ 92 Hình 54 Kết quả điện di sản phẩm của phản ứng PCR của giống HCT 1 với mồi của đoạn promotor 35S 93 Hình 55 Kết quả điện di sản phẩm PCR của mẫu HCV1 93 Hình 56 Kết quả lai ADN xác định gen anti-ACO trong cây hoa cúc chuyển gen 94 Hình 57 Kết quả lai ADN xác định gen CryIA(c) trong cây hoa cúc chuyển gen 94 Hình 58 Các dòng cúc chuyển gen trồng trong nhà lới 95 Hình 59 Sự sống sót và phát triển của các mô sẹo trên môi trờng chọn lọc (Hyg 50 mg/l) sau 2 tuần nuôi cấy 102 Hình 60 Cây chuyển gen KDML105 tái sinh và sự biểu hiện gen gus 102 Hình 61 Máy bắn gen PSD He1100 103 Hình 62 Kết quả thử nghiệm sự biểu hiện tạm thời gen gus 104 Hình 63 Các dòng chuyển gen trồng trong nhà kính 104 Hình 64 Sự sinh trởng bình thờng của cây chuyển gen 104 Hình 65 Thử nghiệm tính kháng rầy nâu của các dòng lúa chuyển gen GNA 105 Hình 66 Tạo mô sẹo ở giống lúa C71 111 Hình 67 Mô sẹo trên môi trờng chọn lọc 111 Hình 68 Chọn lọc mô sẹo 112 Hình 69 Cây tái sinh 112 Hình 70 Kết quả nhân đoạn gen CryIA(c) bằng kỹ thuật PCR 113 Hình 71 Vi khuẩn Xanthomanas oryzae mọc trên môi trờng phân lập 114 Hình 72 Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra cây chuyển gen 118 Hình 73 Một số hình ảnh về sàng lọc và đánh giá cây lúa chuyển gen cry1A(c) 120 Hình 74 Kết quả PCR các dòng lúa chuyển gen kháng sâu đục thân thế hệ T4 120 Hình 75 Dòng C67T4-11 kháng SDT 120 Hình 76 Đối chứng C71 không chuyển gen 120 Hình 77 Sơ đồ vector pUBB-Man 121 Hình 78 Sơ đồ vector pUBC-Man 121 Hình 79 Trồng các dòng lúa thử nghiệm 124 Hình 80a Bớm sâu đục thân hai chấm đợc nuôi trong nhà lới 124 Hình 80b Lồng nuôi bớm sâu đục thân 124 Hình 80c Trứng sâu đục thân lấy từ bớm nuôi 124 Hình 80d Trứng sâu đục thân lấy từ bớm nuôi 124 Hình 80e Sâu đục thân nở (sau 7 ngày tạo ra sâu con) 124 vi Hình 81a Thử nghiệm tính kháng trong đĩa petri 125 Hình 81b Thử nghiệm tính kháng toàn cây 125 Hình 82 Phân tích Southern blot các dòng T0/ IR64 chuyển gen với plasmit 127 Hình 83 Phân tích Southern của các dòng lúa Một bụi (T 0 ) chuyển gen với pUBC-Man 128 Hình 84 Cây chuyển gen thế hệ T 2 giống IR64 trồng tại nhà lới Viện lúa ĐBSCL 128 Hình 85 Cây chuyển gen thế hệ T 2 giống KDML105 trồng tại nhà lới Viện lúa ĐBSCL 128 Hình 86 Sâu sống sót trên các dòng lúa thử nghiệm 133 Hình 87 Các dòng lúa thử nghiệm đợc thử sâu 5 sâu mới nở/đoạn thân/3 lần lập lai và tách thân để quan sát sâu sau 5 ngày 134 Hình 88 Cây bông chuyển gen và cây bông đối chứng nảy mầm trên môi trờng chọn lọc 141 Hình 89 Mảnh lá của cây bông chuyển gen (A) và cây bông đối chứng (B) trên môi trờng chọn lọc 142 Hình 90 Phân tích ELISA các dòng bông chuyển gen 143 Hình 91 Sự thể hiện của gen gus của rễ cây lúa chuyển nạp gen kháng sâu trong dung dịch X-gluc 144 Hình 92 Sự thể hiện của gen gus (1,1kb) và gen hph (0,76kb) ở cây đã chuyển gen (1-4) so với đối chứng (NT) và so với vạch chuẩn (M) 144 Hình 93 Kết quả lai ADN (Southern blotting) 145 Hình 94 Kết quả lai ARN (Northern blotting) 145 Hình 95 Kết quả phản ứng Western blot 146 Hình 96 Thử tính kháng Km của 2 giống bông kháng sâu (phải) và gíông bông đối chứng không kháng sâu. Nồng độ Km lần lợt từ trái sang là 0; 0,25 ; 0,5; 1; 1,5g/L 147 Hình 97 Kết quả phép thử sinh học đối với cây chuyển gen CryIAc. 148 Hình 98 Các dòng lúa Zhongzua phục hồi sau 30 ngày xử lý hạn 152 Hình 99 Bộ rễ và thân các dòng lúa Zhongzua sau xử lý hạn 153 Hình 100 Biến động trọng lợng khô của rễ thân của các dòng 154 Hình 101 Chỉ số chịu hạn tơng đối của các dòng 154 Hình 102 Biến động chiều dài thân ở các dòng 156 Hình 103 Biến động trọng lợng hạt ở các dòng 157 Hình 104 Cây lúa lai 159 Hình 105 Nhà kính ở Trại Thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế, Hà nội bảo đảm kín côn trùng để thử nghiệm và lai tạo cây trồng chuyển gen 159 Hình 106 Nhà lới ở Trại Thực nghiệm Sinh học Cổ Nhuế, Hà nội bảo đảm kín côn trùng để thử nghiệm và lai tạo cây trồng chuyển gen 159 Hinh 107 Bớm Monarch sinh trởng và phát triển bình thờng 163 Hình 108 Sâu cắn chồi ở bông 169 Hình 109 Cánh đồng bông chuyển gen Bt 169 Hình 110 Thử nghiệm sinh học cây đu đủ chuyển gen kháng virus đốm vòng 170 vii [...]... Viện đã và đang tiến hành nghiên cứu chuyển gen kháng virus đốm vòng vào cây đu đủ và đã thu đợc các cây đu đủ chuyển gen trong nhà lới Gần đây, Viện đang hợp tác với Viện Nghiên cứu cây bông và cây có sợi để triển khai chuyển gen cry và gen chịu hạn tạo cây bông kháng sâu và chịu hạn Kết quả của những nghiên cứu trên là những cây chuyển gen đã đợc tạo ra và lu giữ trong điều kiện in vitro và trong... trình Khoa học Công nghệ cấp Nhà nớc KC.04, Viện CNSH phối hợp cùng với 05 Viện nghiên cứu khác trong cả nớc tiến hành đề tài KC.04.13 Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi 8 Báo cáo Tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài KC.04.13 Chơng 1 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong nớc và ngoài nớc 1.1 Tình hình nghiên cứu trong nớc Lĩnh... trình chuyển gen vào một số cây trồng quan trọng làm cơ sở cho các bớc chuyển gen có giá trị vào các đối tợng cây trồng này Lã Tuấn Nghĩa & CS (1995) đã chuyển gen GUS và gen kháng kanamycin vào cà chua Một số phòng thí nghiệm đã thu đợc thành công nhất định khi nghiên cứu tạo GMO Nhiều phơng pháp chuyển gen khác nhau đã đợc nghiên cứu và áp dụng thành công để đa các gen có giá trị vào hàng loạt cây. .. pháp đánh giá cây chuyển gen ở qui mô phòng thí nghiệm và nhà lới - Tiến hành sàng lọc cây chuyển gen trên môi trờng chứa kháng sinh chọn lọc - Sàng lọc cây chuyển gen bằng phản ứng PCR gen chuyển - Lai Southern giữa mẫu DNA dò với DNA genom cây chuyển gen xác định số lợng bản gen chuyển trong genom cây nhận - Lai Northern giữa mẫu dò với RNA cây chuyển gen - Lai Western giữa protein cây chuyển gen với. .. thị (GUS, kháng Kanamycin) để tối u hệ thống chuyển gen và tiếp đến là các gen kháng côn trùng (cry) và kháng bệnh Mục đích lớn nhất là tạo đợc phơng pháp chuyển gen ở cây gỗ trồng rừng và tạo đợc một số dòng chuyển gen có giá trị 2.2.2.4 Chuyển gen vào cây lúa Hiện nay, khá nhiều gen kháng bệnh đã đợc đa vào cây trồng lơng thực và thực phẩm nh ngô, khoai tây và cải dầu Lúa là cây trồng lơng thực quan... cứng) Các nhóm gen này đã đợc u tiên chuyển nạp vào một số loại cây (không làm lơng thực và thực phẩm) nhằm nâng cao tính chống chịu đối với sâu, bệnh (nấm, vi khuẩn và virut) Hoàn thiện các qui trình chuyển gen: Đối với cây bông đề tài đã xây dựng thành công hệ thống tái sinh cây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, cho phép chuyển gen thông qua Agrobacterium, đồng thời hoàn chỉnh phơng pháp chuyển gen qua ống... chọn đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 2.1 Mục tiêu của đề tài Đề tài KC.04.13 tập trung giải quyết các mục tiêu và nội dung nghiên cứu sau đây: Tiến hành phân lập và thiết kế các gen có ích từ nguồn trong và ngoài nớc để thực hiện việc chuyển các gen trên vào một số giống cây trồng nh cây bông vải, cây hoa cúc, cây trồng rừng nh paulownia (Cây hông) và cây lơng thực nh cây lúa nhằm nâng cao tính chống. .. thực vật, nghiên cứu biểu hiện genHiện tại, một số công trình nghiên cứu là cơ sở để tạo GMO đang đợc triển khai nh nghiên cứu gen thủy phân và lên men tinh bột, gen hormon sinh trởng ở cá, gen chịu hạn, lạnh ở lúa, gen mã hoá protein tinh thể độc tố có hoạt tính diệt côn trùng của vi khuẩn Bacillus thuringiensis và các gen có giá trị khác Trong các lĩnh vực tạo GMO, nghiên cứu chuyển gen vào cây trồng... kết quả chuyển gen và ảnh hởng của cây chuyển gen lên môi trờng sinh thái và khả năng phát tán tự nhiên của gen chuyển Thử khả năng gây dị ứng của protein lạ do chuyển gen tạo ra nếu có Thử nghiệm cây trồng chuyển gen: Cùng với việc tạo cây chuyển gen trong phòng thí nghiệm và trồng thử nghiệm ngoài nhà lới, đề tài đã xây dựng cơ sở khoa học và qui trình đánh giá an toàn sinh học cây chuyển gen kháng... yêu cầu tiên quyết để phát triển và ứng dụng công nghệ chuyển gen vào công tác cải tiến giống cây trồng Viện Công nghệ Sinh học (Viện CNSH) đã tiếp nhận và thiết kế lại các gen cryIA(b,c), gen Xa 21, gen chitinase và tiến hành phân lập thành công nhóm gen ACO antisense (Nguyễn Huy Hoàng et al.,), gen Pi kháng bệnh đạo ôn ở lúa, đặc biệt là nhóm gen vip mã hoá loại protein độc đối với côn trùng thuộc . tổng kết Khoa học & Kỹ thuật Đề tài Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức chống chịu đối với sâu bệnh và ngoại cảnh bất lợi M - + E1-2 E1-3. học Công nghệ cấp Nhà nớc KC.04, Viện CNSH phối hợp cùng với 05 Viện nghiên cứu khác trong cả nớc tiến hành đề tài KC.04.13 Nghiên cứu áp dụng công nghệ gen để tạo cây chuyển gen nâng cao sức. vòng vào cây đu đủ và đã thu đợc các cây đu đủ chuyển gen trong nhà lới. Gần đây, Viện đang hợp tác với Viện Nghiên cứu cây bông và cây có sợi để triển khai chuyển gen cry và gen chịu hạn tạo cây