Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơn trên cây lúa (Oryza sative L.)
VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHÂU TẤN PHÁT ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Cần Thơ - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM CHÂU TẤN PHÁT ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN MÙI THƠM TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) Chuyên ngành: Di Truyền và Chọn Giống Mã số: 62.62.05.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Nguyễn Thị Lang 2. GS.TS. Bùi Chí Bửu Cần Thơ - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT ii Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Độc lập – Tự Do – Hạnh Phúc LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu:”Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.)” này là của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Châu Tấn Phát iii LỜI CẢM TẠ Xin chân thành biết ơn các Thầy, các Cô hướng dẫn khoa học: - GS.TS. Nguyễn Thị Lang, đã hết lòng chỉ dẫn những nội dung cần thiết thực hiện các môn học, các thí nghiệm và nội dung nghiên cứu để hoàn thành luận án. - GS.TS. Bùi Chí Bửu, đã tận tình chỉ bảo và hướng dẫn các nội dung, phương pháp và kế hoạch triển khai thành công các môn học, thực hiện các thí nghiệm. - Các thầy cô tham gia giảng dạy lớp nghiên cứu sinh khóa 1 của cơ sở đào tạo Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long. Không thể hoàn thành luận án nếu không có sự giúp đở hướng dẫn khoa học và động viên của Cô và Thầy. Xin chân thành biết ơn Hội đồng đánh giá luận án cấp Cơ Sở: đã dành nhiều thời gian để đọc và đóng góp nhiều ý kiến qúi báu cho luận án được hoàn thiện. Xin chân thành cảm ơn: - Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam. - Ban giám đốc Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã giúp đỡ tạo điều kiện cho tôi trong học tập và thực hiện đề tài. - Ban giám hiệu Trường Đại Học Cần Thơ. - Ban giám hiệu và tập thể thầy cô giáo trường đại học Nộng Nghiệp I - Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian tôi theo học chương trình cao học tại đây. - Phòng Khoa học và Hợp tác quốc tế - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã theo dõi, động viên tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Bộ môn Di Truyền và Chọn Giống – Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã giúp đỡ về trang thiết bị cũng như hướng dẫn chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện đề tài tốt nghiệp. iv - Bộ môn Công Nghệ Hạt Giống - Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long, đã động viên và tạo điều kiện về thời gian giúp tôi có thể hoàn thành luận án trong thời gian qui định. - TS. Bùi Thị Thanh Tâm, TS. Phạm Trung Nghĩa đã đóng góp nhiều ý kiến quí báu để hoàn thiện cho các môn học chuyên đề và luận án. - Sau cùng, xin cảm thông sự hy sinh, chia sẽ và động viên của cha mẹ, em gái, vợ và người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp góp phần không nhỏ vào sự thành công của luận án. Tác giả luận án Châu Tấn Phát v MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa i Lời cam đoan ii Lời cảm tạ iii Mục lục v Danh sách bảng viii Danh sách hình x Danh mục các từ viết tắt xiv MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 2 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 3.1. Ý nghĩa khoa học 2 3.2. Ý nghĩa thực tiễn 2 4. Đối tượng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 2 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 4 1.1 Cơ sở khoa học của đề tài 4 1.1.1 Hợp chất tạo mùi thơm, gen thơm và một số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc hình thành mùi thơm trên lúa 4 1.1.2 Nguyên lý và yêu cầu trong chọn giống bằng MAS 9 1.1.3 Nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn BAC (Bacterial Artificial Chromosome) 9 1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền 15 1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa 15 1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen mùi thơm 19 1.2.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về ứng dụng BAC DNA trong chọn giống lúa 25 vi Chương 2: NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Địa điểm nghiên cứu 28 2.2 Thời gian thực hiện 28 2.3 Vật liệu nghiên cứu 28 2.4 Nội dung nghiên cứu 29 2.5 Phương pháp nghiên cứu 29 2.5.1 Phương pháp lai tạo 29 2.5.2 Phương pháp phòng thí nghiệm 33 2.6 Phân tích thống kê và xử lý số liệu 46 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1 Khảo sát đặc tính thơm và không thơm trên các giống lúa mùa và lúa cao sản 47 3.1.1 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa mùa địa phương 47 3.1.2 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm bằng chỉ thị SSR trên các giống lúa mùa 65 3.1.3 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên bộ lúa cao sản 68 3.1.4 Đánh giá kiểu gen mang gen mùi thơm trên các giống lúa cao sản thử nghiệm 72 3.2 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên các giống sử dụng làm vật liệu lai và quần thể con lai sau khi được lai tạo 76 3.2.1 Đánh giá mùi thơm trên các giống lúa bố mẹ 76 3.2.2 Phát triển quần thể của 20 tổ hợp lai 78 3.2.3 Phân tích đa dạng di truyền dựa vào kiểu hình của các giống lúa bố mẹ và các tổ hợp lai thế hệ F1 79 3.2.4 Phân tích sự biểu hiện di truyền mùi thơm ở quần thể cây lai F1 82 3.2.5 Phân tích sự biểu hiện di truyền mùi thơm ở quần thể F3 từ cặp lai OM2517/OM3536 83 vii 3.2.6 Đánh giá kiểu gen mùi thơm của một số giống bố mẹ và tổ hợp lai bằng chỉ thị phân tử 84 3.2.7 Đánh giá kiểu hình và kiểu gen mùi thơm trên quần thể BC2F2 từ tổ hợp lai OM2517/OM3536 86 3.3 Khai thác thư viện BAC nhằm dòng hóa vùng chứa gen qui định mùi thơm 92 3.3.1 Sàng lọc gen thơm của cây lúa thông qua BAC DNA 92 3.3.2 Xây dựng BAC contig (các chuỗi DNA nhân bản nằm liền kề) trên vùng gen mùi thơm 104 3.3.3 Xác định BAC DNA chứa alen mùi thơm 105 3.3.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc dòng mang gen mùi thơm 106 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 112 4.1 Kết luận 112 4.2 Đề nghị 113 DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC viii DANH SÁCH BẢNG Số thứ tự Nội dung Trang Bảng 2.1 Các chỉ thị phân tử đã sử dụng để nghiên cứu trong đề tài luận án và trình tự mồi tương ứng 28 Bảng 2.2 Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử dụng làm bố 29 Bảng 2.3 Nguồn gốc và một số đặc điểm của các giống lúa được sử dụng làm mẹ 30 Bảng 2.4 Trọng lượng agarose theo nồng độ và đối tượng thí nghiệm 36 Bảng 2.5 Chương trình chạy PCR với chỉ thị SSR 37 Bảng 2.6 Chương trình chạy PCR với chỉ thị STS 38 Bảng 3.1 Cấp độ mùi thơm trên lá của một số giống lúa mùa địa phương 50 Bảng 3.2 Cấp độ mùi thơm trên thân của một số giống lúa mùa địa phương 51 Bảng 3.3 Cấp độ mùi thơm trên hạt của một số giống lúa mùa địa phương 52 Bảng 3.4 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên lá và hạt 53 Bảng 3.5 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên thân và lá 54 Bảng 3.6 Một số giống lúa mùa chỉ thể hiện mùi thơm trên hạt và thân 54 Bảng 3.7 Các giống lúa mùa thể hiện mùi thơm toàn diện trên cả thân, lá và hạt 55 Bảng 3.8 Đánh giá kiểu hình mùi thơm trên lá, thân và hạt của 30 giống lúa cao sản thuộc bộ cao sản 69 Bảng 3.9 So sánh kiểu hình và kiểu gen trên 30 giống thuộc bộ lúa cao sản 75 ix Bảng 3.10 Cấp độ mùi thơm trên lá, thân và hạt của các giống lúa bố mẹ 77 Bảng 3.11 Cấp độ mùi thơm trên lá và thân của các tổ hợp lai thế hệ F1 78 Bảng 3.12 Mùi thơm trên thân, lá và hạt của quần thể F3 từ cặp lai OM2517/OM3536 83 Bảng 3.13 So sánh kiểu gen và kiểu hình trên quần thể BC2F2 của tổ hợp lai OM2517/OM3536 91 Bảng 3.14 Những dòng BAC dự tuyển phủ trên locus mùi thơm được sàng lọc bằng chỉ thị RM223 96 Bảng 3.15 Những dòng BAC dự tuyển phủ trên locus mùi thơm được sàng lọc bằng chỉ thị RG28FL-RB 97 Bảng 3.16 Những dòng BAC dự tuyển phủ trên locus mùi thơm được sàng lọc bằng chỉ thị SP6 99 Bảng 3.17 Ba mươi sáu (36) dòng BAC đã được phát hiện sau khi chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR với 3 chỉ thị phân tử RM223, RG28FL-RB và SP6 100 Bảng 3.18 Vị trí trên điện di đồ của 36 dòng BAC được xác định thông qua 3 chỉ thị phân tử RM223, RG28FL-RB và SP6 102 Bảng 3.19 Các cá thể BC2F2 từ tổ hợp lai OM2517/OM3536 được chọn sau khi sàng lọc PCR với 2 chỉ thị 25D10 và 31F5 109 Bảng 3.20 So sánh kiểu gen và kiểu hình trên quần thể BC2F2 của tổ hợp lai OM2517/OM3536 sau khi đánh giá bằng 2 chỉ thị phân tử 25D10 và 31F5 111 [...]... trong những ứng dụng từ thư viện BAC Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa (Oryza sativa L.) được thực hiện 2 2.Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi thơm “fgr” trên các dòng giống làm bố mẹ và quần thể con lai nhằm xác định những dòng con lai có chứa gen mùi thơm -... viện BAC để hổ trợ tìm kiếm những chỉ thị liên kết với tính trạng mùi thơm trên cây lúa 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học - Xác định những dấu chuẩn phân tử riêng biệt liên kết với gen “fgr” trên cây lúa giúp cho việc chọn dòng con lai hiệu quả hơn - Xác định những dòng BAC DNA để tạo các chỉ thị mới liên kết với gen qui định mùi thơm khai thác từ nguồn dòng BAC để hiểu... điện di sản phẩm phản ứng PCR của các 97 dòng BAC dự tuyển với chỉ thị RM223 Hình 3.27 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR của các 98 dòng BAC dự tuyển với chỉ thị RG28FL-RB Hình 3.28 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR của các 99 dòng BAC dự tuyển với chỉ thị SP6 Hình 3.29 Xác định những dòng BAC dự tuyển ở locus mùi 101 thơm bằng điện di phân tích PFGE trên các dòng BAC được phân cắt bởi enzyme... chuỗi trình tự gen Ứng dụng thư viện nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (BAC Bacterial Artificial Chromosome) như là một công cụ có sức thuyết phục mạnh mẽ nhất để xây dựng thư viện bộ gen cho cây lúa, thành lập bản đồ vật lý có chất lượng cao và dùng để hợp nhất bản đồ vật lý với bản đồ di truyền Bên cạnh đó, việc sử dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây lúa cũng là... tích chỉ thị mới từ đó chuyển sang chỉ thị chứa đoạn gen mùi thơm phục vụ cho chọn giống lúa 4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu trên các đối tượng là các giống lúa mùa và các giống lúa cao sản hiện đang được duy trì và nhân giống - Khai thác thư viện BAC DNA để xác định những dòng BAC chứa gen mùi thơm - Phạm vi nghiên cứu: + Chỉ xác định nội dung có liên quan đến các chỉ thị phân tử liên... quanh gen mục tiêu [99] Vì vậy, RSI3 có thể được sử dụng để đánh dấu ở vị trí Xa4 Để tách ly gen Xa4, một thư viện BAC bao gồm 55.296 dòng của IRBB56 đã được xây dựng Các chỉ thị RSI3, G181, và L1044 được sử dụng để thanh lọc thư viện BAC Kết quả đã thanh lọc được 18, 13 và 106 dòng BAC theo thứ tự các chỉ thị như trên Trong số 18 dòng BAC đã được nhận biết bởi RSI3 có bốn dòng BAC (1F21, 26D24, 56M22 và. .. [106] 1.2 Ứng dụng thành tựu di truyền 1.2.1 Nghiên cứu di truyền gen mùi thơm trên cây lúa 1.2.1.1 Mùi thơm trên lúa do một gen lặn kiểm soát Tác giả Berner và ctv [35] tổng kết rằng tính thơm của giống Della được qui định bởi một gen lặn trong nhân Gen này nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và đã được xác định qua kỹ thuật RFLP [31] Các tác giả Ghose và Butany [50], Reddy và Reddy [87], Sood và Siddiq [96]... [18]) trên sự biểu hiện mùi thơm và sự thiếu phương pháp đánh giá về số lượng cho các mức độ khác nhau của mùi thơm 1.2.2 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen mùi thơm 1.2.2.1 Một số nghiên cứu trong nước ứng dụng PCR trong chọn lọc gen mùi thơm Bản đồ fine mapping về gen mùi thơm trên nhiễm sắc thể số 8 được tác giả Nguyễn Thị Lang và ctv [3] thiết kế thông qua ứng dụng. .. cho thấy BAC rất có triển vọng trong ứng dụng sinh học phân tử để phân tích genome thực vật 14 Kho lưu trữ BAC trên lúa hiện nay có 18.432 dòng trên quần thể DH của tổ hợp lai IR64/Azucena [114]; [115] Khả năng chèn vào lớn nhất của BAC là 364kb Có 75% dòng BAC có khả năng mang 76-135kb, trung bình là 107kb Mỗi dòng BAC được ký hiệu theo số đĩa (plate) (X), số hàng (Y) và số cột (Z) Thí dụ, BAC trong... kháng cao hơn và thậm chí là phổ kháng rộng hơn so với bệnh này chỉ với một gen kháng đơn gen [54] Vì vậy 11 mà, Xa4 đã được coi như là một mục tiêu cho tách dòng định vị Xa4 đã được xác định lần đầu tiên bởi tác giả Yoshimura và ctv [117] trên nhiễm sắc thể 11 trên lúa gần với chỉ thị G181 (chỉ thị RFLP) Gần đây, một vài chuỗi trình tự tương đồng gen kháng (RGAs) khuếch đại từ DNA bộ gen cây lúa với các . dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây l a cũng l một trong những ứng dụng từ thư viện BAC. Xuất phát từ những cấp thiết trên, đề tài: Ứng dụng chỉ thị phân. phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen mùi thơm trên cây l a (Oryza sativa L. ) được thực hiện. 2 2.Mục tiêu nghiên cứu - Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA liên kết chặt với gen qui định mùi. ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ PCR VÀ DÒNG BAC ĐỂ XÁC ĐỊNH GEN MÙI THƠM TRÊN CÂY L A (Oryza sativa L. ) LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Cần Thơ - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO