Đang tải... (xem toàn văn)
Hệ thống biểu hiện PROTEIN tái tổ hợp
Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 1 PROTEIN TÁI TỔ HỢP PROTEIN VÀ CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP Nghiên cứu về hệ enzyme đã mở ra cánh cửa cho việc xác định các protein có khả năng ứng dụng trong điều trị bệnh. Khi đã được xác định, những protein này cần được nghiên cứu kỹ, bao gồm việc biểu hiện protein ở các sinh vật mẫu nhờ sử dụng các kỹ thuật DNA. Một số protein sẽ trở thành thuốc chữa bệnh và một lượng lớn các protein này ở dạng tinh sạch sẽ có cầu lớn. Khi một gene được nhân dòng, protein mã hóa bởi nó có thể được sản xuất với số lượng lớn khá dễ dàng. Một số protein tái tổ hợp như vậy được trình bày trong bảng 1. Các phân tử có bản chất không phải là protein, có kích thước nhỏ hơn, lại cần cả nửa tá các protein (enzyme) lần lượt xúc tác tổng hợp nên chúng. Việc biểu hiện một gene để sản xuất lượng lớn protein gặp nhiều vấn đề rắc rối hơn so với việc sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm. Càng có nhiều bản sao của một gene trong một tế bào thì mức độ biểu hiện sản phẩm của gene càng cao. Do đó, việc đưa gene vào một plasmid có nhiều bản sao trong mỗi tế bào sẽ cho năng suất sản phẩm cao hơn. Tuy nhiên, plasmid có số bản sao lớn lại thường không ổn định và thường thất thoát, đặc biệt trong các mẻ nuôi cấy ở quy mô công nghiệp có mật độ cao. Một phương pháp để ngăn chặn sự thất thoát plasmid là đưa gene ngoại sinh cài vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ. Cái giá của sự ổn định gene ngoại sinh là số lượng của gene trong mỗi tế bào giờ chỉ là 01. Các nhà khoa học đã cố gắng để đưa nhiều bản sao của một gene ngoại sinh nằm liên tiếp nhau vào nhiễm sắc thể tế bào chủ. Tuy nhiên sự có mặt của nhiều bản sao một gene lại tạo ra sự không ổn định do sự tái tổ hợp giữa các trình tự DNA tương đồng. Bảng 1. một số protein tái tổ hợp Protein Chức năng Erythropoetin Thúc đẩy hình thành tế bào hồng cầu trong việc điều trị bệnh thiếu máu Yếu tố đông máu VIII (factor VIII) Giúp hình thành cục máu đông ở những bệnh nhân bị bệnh máu khó đông Filgrastim và sargramostim (các yếu tố tủy thúc đẩy hình thành tế bào máu) Làm tăng bạch cầu sau khi xạ trị hay ghép tạng Isulin Chữa trị bệnh đái tháo đường (diabetes) Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 2 Interferon (alpha) Trị bệnh viêm gan B và C, bệnh mụn rộp ở cơ quan sinh dục, một số ung thư bạch cầu và ung thư khác Interferon (beta) Điều trị các chứng sơ cứng. Clerosis Interferon (gamma) Điều trị u hạt Interleukin-2 Tiêu diệt tế bào ung thư Samato tropin Điều trị bệnh thiếu hụt hormone sinh trưởng t-PA (protein hoạt hóa plasminogen mô) Làm tan cục máu đông để ngừa và giảm tác hại của cơn đau tim. BIỂU HIỆN CÁC PROTEIN CỦA SINH VẬT NHÂN CHUẨN Ở VI KHUẨN Việc thành bại khi biểu hiện một gene tái tổ hợp phụ thuộc vào một số yếu tố. Hiển nhiên là các gene từ vi khuẩn thường được biểu hiện thành công khi đưa một vector nhân dòng (cloning vector) mang gene vào trong các tế bào vi khuẩn, miễn là chúng nằm sau các promoter vi khuẩn thích hợp. Các plasmid đặc biệt chuyên dụng cho việc biểu hiện gene (expression vector) thường được sử dụng để tăng cường biểu hiện gene. Chúng có một promoter mạnh điều khiển sự biểu hiện của gene chuyển vào. Các vector biểu hiện cũng mang các gene kháng kháng sinh cho phép chọn lọc vector và do đó chọn lọc protein tái tổ hợp. Ngoài ra, chúng phải có vùng khởi đầu sao chép (origin of replication) thích hợp với tế bào chủ. Việc biểu hiện các protein của sinh vật nhân chuẩn thường rắc rối hơn. Mặc dù các tế bào nhân chuẩn có thể được sử dụng để biểu hiện các protein này, vi khuẩn lại dễ nuôi và dễ thực hiện các thao tác gene hơn. Do vậy, luôn có nhu cầu biểu hiện các protein từ sinh vật nhân chuẩn ở các tế bào vi khuẩn. Bởi vì các promoter của sinh vật nhân chuẩn không hoạt động ở tế bào vi khuẩn nên cần phải cung cấp một promoter vi khuẩn. Ngoài ra, các vi khuẩn không thể cắt các đoạn intron ra khỏi mRNA; do đó người ta phải sử dụng quy trình chuẩn để nhân dòng gene từ cDNA tổng số không chứa intron. Trong thực tế, gene ở dạng cDNA được sử dụng rộng rãi, cả trong hệ thống biểu hiện tế bào nhân chuẩn, không chỉ để tránh rắc rối trong việc xử lý mRNA mà còn bởi vì lượng DNA ít hơn rất nhiều nên dễ thao tác hơn. Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 3 Thậm chí nếu một gene tái tổ hợp được phiên mã nhiều, việc dịch mã để tạo ra protein tương ứng có thể bị hạn chế ở giai đoạn tổng hợp protein. Các phân tử mRNA được dịch mã với hiệu quả khác nhau, liên quan đến một số yếu tố: (a) lực của tương tác giữa ribosome và vị trí bám của ribosome (b) Độ bền của mRNA và/hoặc cấu trúc bậc hai của mRNA (c) Việc sử dụng các codon (codon usage) Ngoài các vector biểu hiện chuẩn, các vector tinh vi được tạo ra để tối ưu những khía cạnh khác của việc biểu hiện protein. Trong chương này chúng ta sẽ thảo luận về việc sử dụng các vector dịch mã và các vector dung hợp để làm tăng cường tổng hợp một protein tái tổ hợp từ một gene chuyển. VECTOR BIỂU HIỆN DỊCH MÃ Ribosome vi khuẩn bám vào mRNA thông qua việc nhận biết vị trí bám ribosome (ribosome binding site-RBS - ở vi khuẩn được biết như là trình tự Shine-Dalgarno). RBS bắt cặp bổ sung với trình tự AUUCCUCC trên phân tử rRNA 16S của tiểu phần bé ribosome. Trình tự RBS càng giống với trình tự bảo thủ ( UAAGGAGG) thì sự lắp ráp ribosome vào mRNA càng hiệu quả và chặt chẽ. Nói chung, nó làm tăng hiệu quả của quá trình khởi đầu dịch mã. Ngoài ra để việc dịch mã xảy ra tối ưu, RBS phải được thiết kế nằm đúng khoảng cách tới bộ ba mã khởi đầu, AUG. Vector biểu hiện (expression vector) được thiết kế để tối ưu việc biểu hiện gene ở mức độ phiên mã. Tuy nhiên, vector biểu hiện dịch mã (translation expression vector) có thể được thiết kế để tối đa hóa quá trình khởi đầu dịch mã. Những vector này mang một trình tự RBS bảo thủ và một mã bộ ba khởi đầu ATG ở vị trí tối ưu (cách 8 bp) về phía sau của RBS. Gene cần chuyển vào được chèn vào vị trí tạo dòng gối lên bộ ba mã khởi đầu. Enzyme giới hạn NcoI rất thuận tiện bởi vì nó nhận biết trình tự C/CATGG, bao gồm cả ATG. Do đó có thể chèn một gene vào sao cho codon ATG trùng với ATG của vector biểu hiện dịch mã. Gene được cắt bằng NcoI ở đầu 5’ của nó và bằng một enzyme giới hạn thuận tiện khác ở đầu 3’ của nó. Nếu cần thiết, Một vị trí cắt của NcoI nhân tạo có thể được đưa vào gene thông qua đột biến điểm định hướng bằng PCR. Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 4 Vector biểu hiện dịch mã cũng mang một gene chọn lọc thuận tiện, thường là kháng ampicillin hay một kháng sinh khác nào đó, và một promoter khỏe có thể điều khiển ở mức phiên mã. Sau vị trí đưa gene vào là hai hay ba trình tự kết thúc phiên mã khỏe để ngăn việc phiên mã các gene plasmid. Mặc dù các vector biểu hiện phiên mã có thể tối ưu việc khởi đầu dịch mã, chúng không kiểm soát được các yếu tố khác, thuộc về đặc tính của các trình tự mỗi gene, đã liệt kê ở phần trước. Cấu trúc bậc hai của phân tử mRNA có thể có ảnh hưởng đáng kể tới mức độ dịch mã. Nếu mRNA gấp lại sao cho RBS và/hoặc bộ ba mã khởi đầu bị khóa, khi đó quá trình dịch mã sẽ bị cản trở. Đặc biệt, trình tự của vài codon đầu trong trình tự mã hóa phải được kiểm tra khả năng bắt cặp với vùng xung quanh RBS. Nếu cần thiết thì các bazơ ở vị trí thứ 3 (Bazơ suy biến) có thể được thay đổi để loại trừ khả năng bắt cặp như vậy. Đạt được tình trạng dịch mã tích cực là chìa khóa trong việc làm bền mRNA bởi vì bất cứ mRNA nào không được dịch mã mạnh đều trở thành đối tượng của việc phân hủy mRNA, điều này làm giảm năng xuất của protein tương ứng. CÁC ẢNH HƯỞNG CỦA THIÊN HƯỚNG SỬ DỤNG CODON Khi gene từ một sinh vật được biểu hiện ở các tế bào chủ khác, vấn đề phức tạp có thể xảy ra từ việc sử dụng các codon để dịch mã. Do mã bộ ba có hiện tượng thoái hóa nên một amino acid có thể được mã hóa bởi nhiều mã bộ ba. Như vậy, mặc dù trình tự amino acid trong một phân tử protein là cố định, vẫn có sự lựa chọn khác nhau về các mã bộ ba cho nó. Trong thực tế, các sinh vật khác nhau ưa chuộng các codon khác nhau mã hóa cho cùng một amino acid. Ví dụ, amino acid lysine được mã hóa bởi AAA hay AAG. Ở E. coli, AAA được sử dụng trong 75% trường hợp và AAG chỉ được sủ dụng trong 25% trường hợp. Ngược lại, Rhodobacter lại sử dụng cặp codon này theo thiên hướng đối lập và sử dụng AAG trong 75% trường hợp cần mã hóa cho lysine, mặc dù E. coli và Rhodobacter đều là vi khuẩn gram âm. Các mã bộ ba được đọc bởi tRNA. Khi một tế bào hiếm khi sử dụng một mã bộ ba nào đó, nó có lượng ít hơn tRNA dùng để đọc codon hiếm đó. Do đó nếu một gene có nhiều condon AAA được đưa vào trong một tế bào hiếm khi sử Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 5 dụng AAA để mã hóa lysine, sẽ xảy ra hiện tượng thiếu hụt tRNA so với nhu cầu và làm chậm quá trình tổng hợp protein lại. Như vậy để tối ưu hóa việc sản xuất protein tái tổ hợp, thiên hướng sử dụng codon phải được cân nhắc. Mặc dù tốn rất nhiều thời gian và công sức, các gene có thể được thay đổi trong trình tự DNA để thay đổi rất nhiều các bazơ ở vị trí thứ 3 trong các codon thoái hóa. Việc này được thực hiện bằng việc tổng hợp nhân tạo và lắp ráp (đột biến điểm định hướng và fusion PCR). Các gene đã được tối ưu hóa cho các các sinh vật chủ mới có thể tăng năng suất biểu hiện lên 10 lần do tốc độ ribosome kéo dài chuỗi polypeptide tăng lên. Cách tiếp cận này đã thành công đối với các độc tố côn trùng, có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis, khi chuyển gene vào thực vật. Một hướng tiếp cận tốn ít công sức và kỹ thuật sâu hơn để giải quyết thiên hướng sử dụng codon khác nhau là cung cấp các tRNA hiếm. Các codon hiếm nhất không được sử dụng bởi vì thiếu hụt nguồn cung các tRNA tương ứng. Ví dụ, các codon hiếm nhất ở E. coli như AGG và AGA, đều mã hóa cho arginine và chỉ chiếm lượng tương ứng là 0,14% và 0,21%. argU gene mã hóa cho tRNA đọc được cả AGA và AGG. Nếu gene này được đưa vào trong một plasmid của tế bào chủ E. coli, sẽ không còn hiện tượng thiếu hụt nguồn cung tRNA để đọc các codon hiếm nữa và protein tái tổ hợp có thể được tạo ra. Các plasmid mang gene cho tất cả các tRNA tương ứng với các codon hiếm đã được bán rộng rãi trên thị trường. Những plasmid này có đoạn khởi đầu sao chép p15A giúp nó tương thích với hầu hết các vector biểu hiện, những vector thường có đoạn khởi đầu sao mã ColE1. TRÁNH CÁC TÁC DỤNG GÂY ĐỘC CỦA VIỆC BIỂU HIỆN NHIỀU PROTEIN TÁI TỔ HỢP Mặc dù luôn mong muốn đạt năng xuất cao, việc sản xuất một lượng lớn protein tái tổ hợp có thể làm phương hại đến tế bào chủ. Ở vi khuẩn, khi quá nhiều protein được tạo ra trong thời gian ngắn chúng sẽ hình thành các thể vùi (inclusion bodies). Đây là những tinh thể đậm đặc của các protein cuộn gấp sai không thể hoạt động chức năng. Do đó các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 6 có các đặc tính kiểm soát khi nào và bao nhiêu protein tái tổ hợp sẽ được tạo ra. Hai hệ thống biểu hiện thông thường là pET và pBAD ở E. coli. Các hệ thống biểu hiện này có cơ chế để bật hay tắt quá trình tổng hợp protein tái tổ hợp, và hệ thống pBAD cũng có thể kiểm soát lượng protein được biểu hiện. pET vector có promoter lai T7/lac, vị trí đa nhân dòng (multi cloning site), và trình tự kết thúc T7. Việc phiên mã từ promoter lai T7/lac đòi hỏi phải có T7 RNA polymerase. Tế bào E. coli chủ có gene mã hóa cho T7 RNA polymerase được đưa vào nhiễm sắc thể bằng công nghệ gene, nhưng protein kìm hãm lac operon, lacI, ức chế biểu hiện gene này. Khi IPTG được thêm vào, nó cảm ứng việc giải phóng lacI ra khỏi operator của lac operon và quá trình phiên mã được bắt đầu. T7 RNA polymerase sau đó được tạo ra và bám vào promoter lai T7/lac, và protein tái tổ hợp được sản xuất. Hệ thống pBAD dựa vào arabinose operon. Nó được cảm ứng bởi arabinose, chất mà sẽ gắn vào protein điều hòa AraC. AraC đã hoạt hóa rời vị trí O2 (xem hình 10.5 ở tài liệu gửi kèm) và bám vào vị trí I. Việc này làm hoạt hóa sự phiên mã của gene được chuyển. Hệ thống pBAD được điều hòa bởi lượng arabinose thêm vào môi trường nuôi cấy. Nếu cần rất nhiều protein tái tổ hợp, nhiều arabinose sẽ được thêm vào. Tuy nhiên nếu protein tái tổ hợp là độc đối với tế bào chủ, lượng ít hơn arabinose sẽ được thêm vào, và có ít protein tái tổ hợp hơn được tạo ra. Hiệu ứng này dựa vào môi trường nuôi cấy chứ không phải dựa vào tế bào chủ. Mỗi tế bào sản xuất protein tái tổ hợp theo kiểu „tất cả hoặc không có gì “. Nồng độ arabinose thấp không hoạt hóa tất cả các tế bào trong môi trường nuôi cấy, trong khi nồng độ arabinose cao lại làm việc đó“. LÀM TĂNG ĐỘ BỀN CỦA PROTEIN Các protein khác nhau khác biệt rất lớn về độ bền. Đời sống của một protein trong tế bào phụ thuộc vào tốc độ các protease nội bào phân hủy nó. Không kể cấu trúc 3D tổng thể của phân tử protein, có hai yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phân hủy một phân tử protein. Các yếu tố này được tin là có thể làm thay đổi khả năng nhận biết các protein của các bộ máy phân hủy. Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 7 (a) Đặc điểm và thành phần các amino acid đầu N có ảnh hưởng lớn đến thời gian bán hủy của protein. Mặc dù ban đầu tất cả các polypeptide đều bắt đầu bằng methinonine ở đầu N, rất nhiều protein được cải biến sau đó. Do vậy thành phần amino acid đầu N của phân tử protein khác nhau rất lớn. Quy luật đầu N được thể hiện trong bảng 2. (b) Sự có mặt của một số trình tự nằm trong phân tử protein làm cho nó kém bền đi rất nhiều. Trình tự PEST gồm 10 đến 60 amino acid giàu proline (P), glutamic acid (E), serine (S) và threonine (T). Trình tự PEST tạo thành một vùng (domain) dễ dàng nhận biết bởi các protease. Việc thay đổi trình tự amino acid đầu N của các protein tái tổ hợp là công việc khá đơn giản. Một đoạn DNA tổng hợp nhân tạo mã hóa cho trình tự amino acid đầu N mới có thể được đưa vào bằng các kỹ thuật cơ bản, ví dụ như PCR. Hiệu quả của việc cải biến đầu N này đã được chứng minh với enzyme beta- galactosidase tái tổ hợp. Việc thay đổi trình tự PEST mà không phá hỏng cấu trúc và chức năng của phân tử protein thường khó khăn hơn. Mặc dù, về mặt lý thuyết, việc làm này có thể làm tăng mạnh độ bền và năng suất của protein tái tổ hợp. Bảng 2: Quy luật đầu N đối với độ bền của phân tử protein Amino acid đầu N Thời gian bán hủy (phút) Met. Gly, Ala, Ser, Thr, Val 120 Ile, Glu, Tyr 30 Gln, Pro 10 Leu, Phe, Asp, Lys, Arg 2-3 Trong một vài trường hợp, các protein, mà bình thường sẽ bền nếu cuộn gấp đúng, lại cuộn gấp sai. Các protein cuộn gấp sai kết tụ thành thể vùi có thể quan sát được bằng kính hiển vi. Thể vùi thường được hình thành khi các protein tái tổ hợp tan kém hoặc được tạo ra quá nhanh. Một phương pháp để tránh việc kết tụ của protein tái tổ hợp là cung cấp các chaperone phân tử giúp cuộn gấp các protein tái tổ hợp chính xác. Các chaperone bám vào các protein tái tổ hợp ngay Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 8 khi nó mới được tổng hợp và giữ nó ở dạng không cuộn gấp cho đến khi quá trình dịch mã hoàn tất. Sau đó các protein có thể cuộn gấp đúng hình dạng vốn có. CẢI THIỆN KHẢ NĂNG TIẾT PROTEIN TÁI TỔ HỢP Sau khi protein tái tổ hợp được tổng hợp ở trong E. coli, nó có thể ở trong tế bào chất, ở gian bào giữa màng trong và màng ngoài (periplasm) hay được tiết ra môi trường nuôi cấy. Việc tiết qua màng trong, màng sinh chất, được quy định bởi trình tự amino acid tín hiệu kỵ nước đầu N của phân tử protein mới được tổng hợp. Trình tự tín hiệu sẽ được cắt đi sau khi quá trình xuất bào kết thúc bởi peptidase tín hiệu hay peptidase cắt đầu dẫn (leader peptidase). Mặc dù các vi khuẩn như E. coli xuất ít loại protein, vẫn tồn tại các hệ thống tiết giúp xuất bào các protein qua cả hai màng vào trong môi trường nuôi cấy. Rõ ràng nó dễ dàng hơn khi tinh sạch một protein tiết so với một protein trong tế bào chất cùng với đa phần là rất nhiều protein của tế bào chủ. Mặt khác, nhiều protein kém bền trong môi trường ngoại bào và/hoặc tiếp xúc với không khí. Nói chung các protein như vậy thường không được sử dụng trong công nghệ sinh học do chúng khó khăn để tinh sạch và sử dụng. Hầu hết các protein và enzyme được chọn cho các ứng dụng thực tế đều khá bền khi ở ngoài tế bào. Mục tiêu chuẩn là sắp xếp cho chúng được tiết để giúp tách và tinh sạch. Có vài cách tiếp cận để giải quyết yêu cầu này: (a) Một trình tự tín hiệu được gắn vào gene cần chuyển. Kết quả là protein tái tổ hợp sẽ có một trình tự tín hiệu đầu N khi mới được tổng hợp. Trình tự này sẽ quy định việc tiết vào gian bào bằng hệ thống tiết chung. Tế bào vi khuẩn sau đó sẽ được thu hoạch và xử lý loại bỏ hay thay đổi tính thấm của màng ngoài nhằm giải phóng protein tái tổ hợp. Rắc rối chủ yếu là lượng lớn protein tái tổ hợp có thể làm quá tải hệ thống tiết và kết tụ thành dạng thể vùi. Một lượng lớn protein tái tổ hợp có thể tích tụ trong tế bào chất cùng với trình tự tín hiệu vẫn đính trên đó. Việc tiết đôi khi được tăng cường mạnh bởi việc nâng hàm lượng các protein của hệ thống tiết (Sec proteins). Các bản sao thêm của các gene sec có thể được đưa vào và cho Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 9 biểu hiện trên các plasmid để làm tăng lượng protein. Các chủng E. coli đột biến cũng đã được phát triển để tăng tiết protein. (b) Protein tái tổ hợp có thể được dụng hợp với một protein thường được tiết của vi khuẩn. Protein bám maltose của vi khuẩn E. coli được tiết một cách hiệu quả vào gian bào và là protein mang được ưa chuộng cho các protein tái tổ hợp. Protein mang sau đó sẽ được cắt ra khỏi protein tái tổ hợp nhờ protease. Kỹ thuật này đặc biệt hữu dụng cho các peptide ngắn, bao gồm nhiều loại hormone và yếu tố sinh trưởng (growth factor), những chất mà thường kém bền khi đứng một mình. (c) Gene quan tâm có thể được biểu hiện ở vi khuẩn gram dương, như Bacillus, là những vi khuẩn không có màng ngoài. Kết quả là protein tái tổ hợp được tiết thẳng ra ngoài môi trường nuôi cấy. Mặc dù tiện lợi, di truyền học về Bacillus còn chưa được nghiên cứu tường tận như về E. coli. Tế bào động vật có thể là một sự thay thế bởi vì chúng chỉ có một màng sinh chất, và như vậy có thể tiết trực tiếp protein tái tổ hợp vào môi trường. (d) Việc tiết qua cả hai màng của vi khuẩn gram âm như E. coli có thể thực hiện được nhờ các hệ thống tiết chuyên biệt. Hầu hết trong số các hệ thống tiết này được sử dụng tự nhiên để tiết các độc tố bởi các chủng vi khuẩn gây bệnh. Do vậy hệ thống tiết loại I xuyên qua cả hai màng trong và ngoài và được sử dụng để tiết hemolysin bởi các chủng E. coli gây nhiễm trùng đường tiết niệu. hệ thống tiết loại II chỉ xuyên qua màng ngoài. Do vậy việc tiết ra ngoài môi trường cần một hệ thống tiết chung ( ví dụ như hệ thống Sec) để xuất protein qua màng trong trước. Thường thì quá trình hai bước này được sử dụng bởi Pseudomonas để tiết exotoxin A. Các chủng E. coli biến đổi gene để triển khai các hệ thống xuất thay đổi này đang được đưa vào sử dụng. Trong những trường hợp này, cần phải thay đổi protein được tiết sao cho nó được nhận biết bởi hệ thống xuất được lựa chọn. Cải biến gene với các trình tự tín hiệu thích hợp cho phép protein được nhận biết và được xuất bào. Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P. Clark and Nanette J. Pazdernik. 2010. Biotechnology-applying the genetic revolution. Academic Press 10 VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN DUNG HỢP Việc nối hai trình tự mã hóa của hai protein lại với nhau đúng khung đọc sẽ tạo ra một protein dung hợp. Kết quả là, một polypeptide đơn dài hơn được tạo ra trong quá trình dịch mã. Nếu protein đầu tiên (đầu N) là protein tiết thì protein dung hợp cũng sẽ là protein tiết. Do đó có thể tiết protein tái tổ hợp bằng việc dung hợp với một protein tiết khác. Vevtor protein dung hợp là một plasmid cho phép gene quan tâm dung hợp với gene mã hóa cho một protein mang thích hợp. Lựa chọn này giúp tinh sạch protein tái tổ hợp dễ dàng hơn. Ngoài ra, vector đó phải có một trình tự bám của ribosome giống với trình tự bảo thủ cho phép việc dịch mã hiệu quả. Một trong các ví dụ điển hình nhất là protein MalE của E. coli. Đây là protein thường được tiết vào gian bào, nơi nó vận chuyển maltose từ màng ngoài tới màng trong. Gắn ái lực vào giá thể nhựa có amylose sẽ giúp tinh sạch MalE dễ dàng. Gene quan tâm được đưa vào sau và cùng khung đọc của trình tự mã hóa cho MalE. Giữa các trình tự mã hóa là một vị trí cắt của một protease, cho phép protein dung hợp được cắt ra sau khi dịch mã. Một promoter mạnh cũng được cung cấp để tối đa hóa việc tạo ra protein. Sau khi biểu hiện protein, tất cả protein quan tâm sẽ được thu hoạch từ gian bào. Nó sẽ được cho chảy qua một cột amylose để bắt giữ MalE dung hợp. Để giải phóng gene quan tâm khỏi cột, một protease thích hợp được thêm vào. Cuối cùng, protease được loại bỏ khỏi mẫu protein tái tổ hợp bằng một cột bám đặc hiệu với nó. Có nhiều hệ thống biểu hiện protein dung hợp khác được sử dụng, lợi dụng việc bám đặc hiệu của His6, FLAG, hay GST để hỗ trợ việc tinh sạch protein (xem thêm chương trước). Có một hệ thống tiết protein tái tổ hợp dung hợp tinh vi khác sử dụng enzyme beta-lactamase gian bào. Beta-lactamase domain bám vào borate. Điều này cho phép gắn protein dung hợp thông qua giá thể nhựa gắn phenyl-boronate và đẩy protein dung hợp ra khỏi cột bằng borate hòa tan. BIỂU HIỆN PROTEIN BẰNG CÁC TẾ BÀO NHÂN CHUẨN Mặc dù các tế bào vi khuẩn biểu hiện thành công rất nhiều protein từ tế bào nhân chuẩn, vẫn có những trường hợp protein tái tổ hợp được biểu hiện tốt nhất ở các tế bào nhân chuẩn. Một số protein nhân chuẩn không bền hay bất hoạt sau khi được biểu hiện ở [...]... đáng nhưng việc duy trì chúng lại đắt đỏ Do đó, việc xác định dùng hệ thống biểu hiện nào để biểu hiện protein tái tổ hợp phụ thuộc vào protein và các đặc tính riêng của nó Bảng 3: So sánh các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp Tiêu Tên hệ thống biểu hiện chí Tốc độ biểu Động vật Thực vật Tế bào Tế bào côn hiện chuyển gen chuyển gene động vật trùng Giá cả Động vật Thực vật Tế bào côn chuyển gen chuyển... kiểm so t việc biểu hiện Cho đến nay, các tế bào vi khuẩn là phương tiện rẻ nhất và nhanh nhất để biểu hiện protein tái tổ hợp, nhưng chúng không thể đường hóa được protein hay giúp các protein từ động vật có vú cuộn gấp đúng Tế bào động vật có vú giúp protein tái tổ hợp trong đó cuộn gấp và đường hóa thỏa đáng nhưng việc duy trì chúng lại đắt đỏ Do đó, việc xác định dùng hệ thống biểu hiện nào để biểu. .. sắc thể BIỂU HIỆN NHIỀU TIỂU PHẦN PROTEIN Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Nhiều protein của động vật có vú bao gồm nhiều tiểu đơn vị, những đơn vị này phải được lắp ráp trong tế bào Điều này làm cho việc biểu hiện tái tổ hợp các protein này phức tạp hơn Nếu các tiểu phần protein khác nhau được biểu hiện ở các tế bào khác nhau sau đó được trộn vào nhau thường không tạo ra protein còn hoạt động Trong trường hợp này,... xuất protein tái tổ hợp Thuận lợi tiếp theo trong việc sử dụng hệ thống biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn loại bỏ được nguy cơ nhiễm tạp các protein vi khuẩn Mặc dù được tinh sạch, các protein vi khuẩn tồn dư với lượng rất nhỏ sẽ gây độc hay sẽ kích hoạt hệ thống miễn dịch của sinh vật nhân chuẩn, gây sốt Các vector con thoi (shuttle vector) được thiết kế để di chuyển gene qua lại giữa các nhóm... trí MCS và tạo nên một bacmid tái tổ hợp Bacmid sau đó được tách, tinh sạch và chuyển vào tế bào côn trùng, nơi mà nó có thể được nhân lên như một virus Baculovirus tái tổ hợp này sau đó có thể được cho xâm nhiễm các dòng tế bào nuôi cấy để tổng hợp ra protein tái tổ hợp mong muốn sau vài ngày Đã có vài trăm protein của sinh vật nhân chuẩn đã được sản xuất thành công nhờ hệ thống baculovirus/côn trùng... khuẩn, nơi mà một ribosome duy nhất chạy dọc phân tử mRNA qua tất cả các khung đọc mở có trên đó 17 Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010- all rights reserved Reference: David P Clark and Nanette J Pazdernik 2010 Biotechnology-applying the genetic revolution Academic Press SO SÁNH CÁC HỆ THỐNG BIỂU HIỆN Mỗi hệ thống biểu hiện có điểm mạnh và điểm yếu riêng khi so sánh các tiêu chí như chi phí,... trường đơn giản hơn các tế bào động vật Kết quả là, các hệ thống biểu hiện dựa vào côn trùng đã được phát triển Những hệ thống này có thêm thuận lợi là có thể tiến hành các biến đổi sau dịch mã giống với các hệ thống ở tế bào động vật có vú Các vector được sử dụng trong các tế bào vi khuẩn hầu hết đều có nguồn gốc từ một họ virus có tên là baculovirus, họ mà chỉ xâm nhiễm côn trùng (và các động vật không... gấp đúng và/hoặc hoạt hóa protein Các enzyme cần cho quá trình cải biến và xử lý thường vắng mặt trong tế bào vi khuẩn, nên cần phải biểu hiện chúng trong tế bào nhân chuẩn Các enzyme xử lý sau dịch mã có liên quan thường hiện diện ở một loạt sinh vật bậc cao; do đó rất ít trường hợp cần biểu hiện protein tái tổ hợp ở đúng sinh vật đó Ở đây chúng ta quan tâm đến việc sản xuất protein ở tế bào nuôi cấy... ở tế bào nhân chuẩn khó khăn hơn nên hầu hết các vector biểu hiện ở nhân chuẩn là vector con thoi Những vector như vậy cho phép việc cải biến gene diễn ra ở vi khuẩn, thường là E coli, và cho phép chuyển vào các sinh vật khác để biểu hiện gene Chúng ta sẽ xem xét tế bào nấm men, côn trùng và động vật có vú như là những hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 11 Đặng Xuân Nghiêm-HUABIOTECH-Copyright©12/2010-... đông máu XIIIa, vài yếu tố sinh trưởng và protein virus (từ HIV, viêm gan B, C, v.v.) được sử dụng như là các vacine hay trong chuẩn đoán Mặc dù nhiều protein tái tổ hợp đã được biểu hiện thành công ở nấm men, năng suất của chúng thường thấp Các khó khăn bao gồm: (a) Sự thất thoát plasmid biểu hiện trong quá trình sinh trưởng trong các nồi lên men lớn (b) Các protein được cho là sẽ được tiết thường bị . tái tổ hợp phụ thuộc vào protein và các đặc tính riêng của nó. Bảng 3: So sánh các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp Tiêu chí Tên hệ thống biểu hiện Tốc độ biểu hiện Động vật chuyển. khi các protein tái tổ hợp tan kém hoặc được tạo ra quá nhanh. Một phương pháp để tránh việc kết tụ của protein tái tổ hợp là cung cấp các chaperone phân tử giúp cuộn gấp các protein tái tổ hợp. Press 6 có các đặc tính kiểm so t khi nào và bao nhiêu protein tái tổ hợp sẽ được tạo ra. Hai hệ thống biểu hiện thông thường là pET và pBAD ở E. coli. Các hệ thống biểu hiện này có cơ